一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及基因检测试剂盒，特别是涉及一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒。
背景技术：
：戈谢病(Gaucherdisease，GD)是溶酶体糖脂贮积症中最常见、发病率最高的一种，为常染色体隐性遗传，最早由法国医生Gaucher报道。GBA基因编码葡糖脑苷脂酶，位于1q21染色体上。戈谢病是由GBA基因变异，造成溶酶体中的酸性β-葡糖苷又称葡糖脑苷脂(Glucocerebrosidase，GC)无法正常水解为神经酰胺，因而释放的β-葡萄糖脑苷脂被网状内皮系统(脾、肝、骨髓)的巨噬细胞吞入并贮存于其溶酶体中形成典型的戈谢细胞，正常的骨髓基质被特征性戈谢细胞(电镜下可见胞浆中有特异的管状脑苷脂包涵体)取代，导致细胞失去原有的功能，引起肝脾逐渐增大等一系列症状。戈谢病属于罕见疾病，在世界各地广泛流行，发病率为1/(10-40)万，在我国发病率为1/(20-50)万。任何年龄自出生至80岁均可发病，自1948年首次报道以来，各地均有病例发生。临床上根据神经系统病变的严重程度将戈谢病分为三类:Ⅰ型为最普遍的发病形式，在成人中发现较多，不涉及神经系统病变，Ⅰ型戈谢病进展缓慢，脾切除后可长期存活，智力正常，惟生长发育落后。Ⅱ和Ⅲ型主要在婴幼儿和青少年中发病，涉及神经系统病变。Ⅱ型戈谢病多于发病后1年内死于继发感染，少数可存活2年以上。Ⅲ型戈谢病多由于神经系统症状较重，常死于病发症。目前DNA技术可诊断定位于人类染色体1q21的GBA基因，基因长度为7.6kb，含有11个外显子，在此基因的下游16kb处有一高度同源的假基因。目前鉴定的致病突变位点大约有300多个，常见的是N370S(c.1226A>G)和L444P(c.I448T>C)两种突变。近来国外学者对戈谢病的基因型研究已确定了42种突变，包括错义突变、剪接突变、移码突变、缺失、基因与假基因融合与基因转化等。其中最常见的错义突变导致合成的葡糖脑苷脂酶催化功能及稳定性降低。目前已经发现一些基因型与表现型存在相关性，例如N370S等位基因多与Ⅰ型戈谢病患者相关；L444P等位基因多与神经型相关，L444P纯合子多表现为Ⅲ型，而L444P与其他基因结合时通常表现为Ⅱ型。其他基因型如F213I、D409H、G202R可能与戈谢病神经系统损害表型有密切相关性。但是现在还很难将临床病征确切的归因于某一种基因型。虽然戈谢病的基因型-表现型的相关性十分复杂，但是一些基因型与患者症状有关。通过对GBA基因的检测，有助于诊断戈谢病。Sanger测序法是目前公认的，是大多数临床分子诊断项目的金标准，特异性甚至能达到100％，是分子诊断方面的经典技术平台。因此采用Sanger测序法对GBA序列进行突变检测，具有稳定性高，特异性好的优点，能够有效避免假阳性的产生。技术实现要素：本实用新型所要解决的技术问题是提供一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒，本实用新型试剂盒使用方便，灵活性、特异性好，灵敏度高，检测结果判读直观，在临床辅助诊断戈谢病方面有很大的应用前景。本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒。一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒，包括盒体1、盒盖2和设置在盒体内的第一衬垫3，第一衬垫(3)上设有小孔，小孔内设有装有PCR扩增试剂的试剂管4、装有PCR产物纯化试剂的试剂管5、装有DNA测序试剂的试管6；试剂盒内放置有与第一衬垫3平行的第二衬垫9，盒盖2内侧设有条码区7。试剂盒两侧板底部相对各设有一条凹槽，凹槽内滑动插入第二衬垫9。试剂盒两侧板底部设置有安装柱，第二衬垫9放置在安装柱上。所述第二衬垫9上设有容器孔，容器孔内设有装有引物的24孔板8。所述引物既为PCR扩增引物，又为DNA测序引物。所述24孔板用封口膜封口。所述小孔在衬垫(3)上排成一排。所述条码区(7)内含试剂盒中试剂保存、配制信息。有益效果由于采用了上述的技术方案，本实用新型与现有技术相比，具有以下的优点和积极效果：本实用新型试剂盒使用方便，灵活性、特异性好，灵敏度高，检测结果判读直观，在临床辅助诊断戈谢病方面有很大的应用前景。附图说明图1是本实用新型的一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒结构示意图；图2是GBA基因未突变的测序图；图3是GBA基因突变的测序图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。此外应理解，在阅读了本实用新型讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得本实用新型的实施方式涉及一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒。如图1所示，为本实用新型提供的一种戈谢病GBA基因突变的检测试剂盒的结构示意图，包括盒体1、盒盖2和设置在盒体内的第一衬垫3，衬垫3上设有小孔，装有PCR扩增试剂试剂管4、装有PCR产物纯化试剂的试剂管5、装有DNA测序试剂的试管6，试剂盒内放置有与第一衬垫3平行的第二衬垫9，试剂盒两侧板底部相对各设有一条凹槽，凹槽内滑动插入第二衬垫9，其中第二衬垫9上设有容器孔，容器孔内设有装有引物的24孔板8，24孔板用封口膜封口；各试剂排列如图1所示。盒盖2内侧设有条码区7，条码区7内含试剂盒中试剂保存、配制信息。操作步骤如下：1.DNA提取：(使用天根公司人类基因组DNA提取试剂盒，货号：DP331)，按照试剂盒说明书提取DNA，使用50ul去离子水洗脱DNA，若当天不使用，则要-20℃保存。2.PCR：将PCR扩增试剂(成分包括：0.05U/μLTaqDNA聚合酶、400μMdNTPs、3mMMgCl2、20mMTris-HCL(PH8.0)和50mMKCL)、去离子水及GBA基因外显子(本试剂盒包括第3/4、5/6、7、8、9和10/11号外显子扩增和测序引物)扩增引物，室温解冻并混匀，瞬时离心。3.本试剂盒包含6对PCR引物，测序引物与PCR引物共用，如下：GBA-3/4-F：CATGTCTTCATCAGACCTCA；GBA-3/4-R：GCTCTATGTCATCTTGTCCC；GBA-5/6-F：CTCTCCTATTGACTCGGACTAC；GBA-5/6-R：GATCCCACATCCTTGCTG；GBA-7-F：GCTGGGATTACAGGTGTGAG；GBA-7-R：GTCATTTGGATGCTGGATTT；GBA-8-F：AAAATCTCCCCAAACCTC；GBA-8-R：AAGGAAAGGGAAGATAGG；GBA-9F：GACCCTTACCTACACTCTCTGG；GBA-9R：CTGACCCTGCTTTTCTGC；GBA-10/11-F：GTGGGTGACTTCTTAGATGAGG；GBA-10/11-R：GTGCCCTCTTTAGTCACAGAC；引物浓度均为5umol/L。4.PCR反应体系：每个样本需要做6管PCR扩增(使用不同的PCR引物)，体系配制如下表，每一个PCR扩增总体积20ul。PCR扩增试剂10μL去离子水6μLPCR引物(上游)1μLPCR引物(下游)1μLDNA2μL5.PCR反应条件：6.PCR产物纯化：每一个反应孔体系总体积为11uL，由PCR产物纯化试剂2uL和PCR产物9uL组成。反应条件为：37℃、50分钟；95℃、5分钟；4℃保存。7.DNA测序反应：每一个反应孔体系总体积为5ul，有去离子水2ul、测序引物1ul、PCR纯化产物1uL和DNA测序试剂1uL组成。反应条件为：95℃、4分钟；95℃、15秒；56℃、20秒、60℃、2分钟，共25个循环；4℃保存。8.反应结束后，每管加入2uL125mM乙二胺四乙酸二钠EDTA-2Na和15uL无水乙醇，震荡混匀，3700转/分，4℃离心30分钟，轻轻倒去上清液体；每管加入50uL75％的乙醇，3700转/分，4℃离心15分钟，轻轻倒去上清液体；室温放置10～15分钟后，每管加入10uL去离子甲酰胺HIDI溶液，震荡混匀，静置10分钟，上测序仪。9.结果分析：将测序仪上的结果拷贝下来，应用SeqScape软件进行序列比对分析。将测序得到的序列与NCBI中检索到的标准序列进行比对，确认样本的基因序列。测序结果附图见图2和图3(列举出GBA基因未突变和突变的测序图)。当前第1页1 2 3