用于改善血管性血友病因子的半衰期的化合物的制作方法
发明领域
本发明涉及用于改善凝血疾病治疗的产品和方法。
发明背景
存在由凝血因子缺陷引起的各种出血性疾病。最常见的疾病是血友病a和b，分别由凝血因子viii(fviii)和ix的缺陷引起。另一种已知的出血性疾病是血管性血友病(vonwillebrand'sdisease，vwd)。
在血浆中，fviii主要作为血管性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)的非共价复合物存在，其凝血功能是加速因子ⅸa依赖性x因子转化为xa。
经典血友病或血友病a是遗传性出血性疾病。它是由凝血fviii的染色体x连锁缺陷引起的，几乎完全影响每10,000人发生的1至2个个体的男性。x染色体缺陷由本身不患血友病的女性携带者传播。血友病a的临床表现是出血倾向增加。
在进行预防性治疗的严重血友病a患者中，fviii必须每周静脉内(i.v.)约3次施用，因为fviii的血浆半衰期短，约12至14小时。每次i.v.施用麻烦，与疼痛相关，并且具有感染的风险，特别是因为这主要由患者自己或被诊断患有血友病a的儿童的父母在家进行。
因此，非常希望增加fviii的半衰期，使得含有fviii的药物组合物不必须太过频繁地施用。
已经进行若干尝试以延长非活化的fviii的半衰期：通过减少其与细胞受体的相互作用(wo03/093313a2、wo02/060951a2)，通过将聚合物共价连接到fviii(wo94/15625、wo97/11957和us4970300)，通过包封fviii(wo99/55306)，通过引入新的金属结合位点(wo97/03193)，通过肽键(wo97/40145和wo03/087355)或二硫键(wo02/103024a2)将a2结构域共价连接到a3结构域或通过将a1结构域共价连接到a2结构域(wo2006/108590)。
增强fviii或vwf的功能半衰期的另一方法是通过fviii的聚乙二醇化(wo2007/126808、wo2006/053299、wo2004/075923)或通过vwf的聚乙二醇化(wo2006/071801)，其中聚乙二醇化的vwf通过增加的半衰期将间接地也增加存在于血浆中fviii的半衰期。还已经描述了fviii的融合蛋白(wo2004/101740、wo2008/077616和wo2009/156137)。
vwf(其在不同形式的血管性血友病(vwd)中缺失、功能缺陷或仅以减少量可用)是存在于哺乳动物血浆中的具有多种生理功能的多聚体粘附糖蛋白。在初期止血期间，vwf作为血小板表面上的特异性受体和细胞外基质成分如胶原蛋白之间的介质。此外，vwf作为促凝血因子fviii的载体和稳定蛋白。vwf在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型vwf的氨基酸序列和cdna序列公开于collinsetal.1987,procnatl.acad.sci.usa84:4393–4397中。前体多肽pre-pro-vwf由22个残基的信号肽、741-残基的前肽(pro-peptide)和成熟血浆vwf中发现的2050残基的多肽组成(fischeretal.,febslett.351:345-348,1994)。在内质网中的信号肽切割后，在vwf的两个单体之间形成c-末端二硫桥。在通过分泌途径的进一步运输期间，添加了n-连接和o-连接的碳水化合物侧链。更重要的是，vwf二聚体通过n-末端二硫桥多聚化，741个氨基酸长度的前肽在晚期高尔基体中被酶pace/弗林蛋白酶切割掉。前肽以及vwf的高分子量多聚体(vwf-hmwm)存储在内皮细胞的怀布尔-帕拉德小体内或血小板的α-颗粒中。
一旦分泌到血浆中，蛋白酶adamts13在vwf的a1结构域内切割vwf。因此，血浆vwf由从500kda的单个二聚体到由多达20多个分子量超过10,000kda的二聚体组成的多聚体的全范围的多聚体组成。vwf-高分子量多聚体(hmwm)具有最强的止血活性，可以在瑞斯托菌素辅因子活性(vwf：rco)中测定。vwf：rco/vwf抗原的比例越高，高分子量多聚体的相对量越高。
vwf中的缺陷是血管性血友病(vwd)的原因，其特征在于具有或多或少明显的出血表型。3型vwd是vwf完全缺失的最严重形式，1型vwd涉及vwf的定量损失，其表型可能非常轻微。2型vwd涉及vwf的定性缺陷，可能与3型vwd一样严重。2型vwd具有许多子形式，其中一些与高分子量多聚体的损失或减少有关。2a型vonvwd的特征在于中间和大型多聚体的损失。2b型vwd的特征在于最高分子量多聚体的损失。
vwd是人中最常见的遗传性出血性疾病，可以通过用含有血浆或重组来源的vwf的浓缩物的替代疗法来治疗。
在血浆中，fviii以高亲和力结合vwf，其保护其免于过早的分解代谢，因此，除了其在初期止血中的作用外，起到调节fviii血浆水平的关键作用，因此也是控制第二期止血的核心因素。结合vwf的非活化fviii的半衰期在血浆中约为12至14小时。在3型血管性血友病中，不存在或几乎不存在vwf，fviii的半衰期仅为约6小时，由于fviii的浓度降低，导致这种患者的轻度至中度血友病a的症状。vwf对fviii的稳定作用也已经用于帮助在cho细胞中重组表达fviii(kaufmanetal.1989,molcellbiol)。
存在增加vwf、fviii或这两个因子的半衰期的产品和方法的需要。
发明概述
本申请的发明人发现vwf单体强烈结合存在于巨噬细胞上的受体蛋白的钙型凝集素结构域家族10成员a(clec10a)。特别地，发现能够结合clec10a的小鼠直系同源物的抗体对小鼠中vwf的清除具有抑制作用。因此，通过降低vwf的清除，能够结合clec10a的抑制性抗体延长血浆中vwf的半衰期。通过施用这种抑制性抗体，也可以增加fviii的半衰期。
因此，本发明涉及在[1]至[18]项中定义的主题：
[1]能够结合人受体蛋白clec10a或其直系同源物的化合物，其用于治疗凝血疾病。
[2]根据[1]所述的化合物，其中所述化合物能够抑制血管性血友病因子与clec10a的结合。
[3]根据[1]或[2]所述的化合物，其中所述化合物特异性结合clec10a。
[4]根据前述任一项的化合物，其中所述化合物是抗体或其片段。
[5]根据[4]所述的化合物，其中所述抗体为单克隆抗体。
[6]根据前述任一项所述的化合物，其中所述clec10a具有seqidno：1或2所示的氨基酸序列。
[7]根据前述任一项所述的化合物，其中通过所述治疗增加血管性血友病因子的半衰期。
[8]根据前述任一项所述的化合物，其中通过所述治疗增加因子viii的半衰期。
[9]根据前述任一项所述的化合物，其中所述治疗还包括施用选自因子viii、血管性血友病因子及其组合的多肽。
[10]根据[9]所述的化合物，其中所述化合物和所述多肽分开施用。
[11]根据前述任一项所述的化合物，其中所述凝血疾病是血友病a或血管性血友病。
[12]药盒，其包含(i)第1至6项中任一项所定义的第一化合物和(ii)选自因子viii、血管性血友病因子及其组合的多肽。
[13]根据[12]的药盒，其中所述化合物和所述多肽包含在分开的组合物中。
[14]如[1]至[6]中任一项所定义的化合物用于增加血管性血友病因子的半衰期或减少血管性血友病因子的清除的用途。
[15]如[1]至[6]中任一项所述的化合物用于增加因子viii的半衰期的用途。
[16]如[1]至[6]中任一项所定义的化合物，其用于在治疗性治疗中延长血管性血友病因子的半衰期。
[17]体内增加血管性血友病因子的半衰期或减少血管性血友病因子的清除的方法，其包括向受试者施用有效量的[1]至[6]中任一项所定义的化合物。
[18]治疗凝血疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的[1]至[6]中任一项所定义的化合物。
附图说明
图1：单体人vwf与重组人clec10a的相互作用(参见实施例1)。
图2和图3：单体人vwf与重组人clec10a和clec10a直系同源小鼠蛋白(mgl1和mgl2)的相互作用(参见实施例2)。
图4：在存在中和抗mgl1/2抗体的情况下抑制vwf结合mgl2(参见实施例3)。
图5：在中和体内各受体功能的抗mgl1/2抗体存在下的人vwf的pk(参见实施例4)。
vwf缺陷小鼠接受8mg/kg体重的多克隆山羊抗mgl1/2抗体。非特异性山羊抗体用作对照处理。随后，注射人vwf(200iu/kg体重)，并且将vwf:ag表示为在注射后的指定时间内在血浆中回收的注射的vwf剂量的百分比。与接受对照抗体的组相比，抑制性抗mgl1/2抗体的施用导致vwf清除降低。
详述
在第一方面，本发明涉及能够结合人受体蛋白clec10a或其直系同源物的抗体，其用于治疗凝血疾病。
在其它方面，本发明涉及能够结合人clec10a或其直系同源物的化合物，其用于治疗凝血疾病，其中所述化合物
(i)是抗体，
(ii)能够特异性地结合人clec10a或其直系同源物，
(iii)不包含作为abo(h)血型抗原的一部分或源自abo(h)血型抗原的可接近(accessible)的糖残基，
(iv)不经由可以是所述化合物的一部分的碳水化合物结构与受体蛋白clec10a或其直系同源物结合，
(v)不结合人asgp受体，
(vi)不结合人受体clec4m，
(vii)不结合人受体scara5，
(viii)不结合人受体mmr，
(ix)不结合人受体clec4f，和/或
(x)不结合人受体colec12。
clec10a
clec10a(也称为巨噬细胞gal型凝集素)是clec家族的人ii型跨膜受体蛋白。其他同义词是c型凝集素超家族成员14，巨噬细胞凝集素2和cd301。clec10a与肝脏asgpr蛋白密切相关，但由中等单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达。然而，clec10a和asgpr是具有不同细胞定位和碳水化合物特异性的不同蛋白质。据报道，clec10a参与树突状细胞对病原体的识别，并在癌症发病中选择性识别肿瘤相关糖蛋白(vanvlietetal.(2005)internationalimmunology,17:661-669；napoletanoetal.(2012)europeanjournalofimmunology,42:936-945)。该受体被描述为介导与含有末端α-和β-连接的galnac残基的糖蛋白的结合。已经鉴定了o-连接的碳水化合物结构(例如tn-抗原(galnacα连接到丝氨酸/苏氨酸)和唾液酸-tn-抗原结构)作为优选的clec10a相互作用配偶体(vanvlietetal.(2005)internationalimmunology,17:661-669；saelandetal.(2007)cancerimmunology,immunotherapy,56:1225-1236；vanvlietetal.(2008)internationalimmunology,29:83-90；denda-nagaietal.(2010)thejournalofbiologicalchemistry,285:19193-19204；mortezaietal.(2013)glycobiology,23:844-852)。许多肿瘤细胞由于糖基转移酶的表达水平和活性的改变而显示异常糖基化，导致聚糖(如tn抗原)的异常表达(vanvlietetal.(2008)internationalimmunology,29:83-90.)。
如本文所用，术语“clec10a”是指具有或由seqidno：1所示的氨基酸序列或其天然存在的变体组成的人蛋白质。clec10a包括但不限于具有或由在标识q8iun9-1、q8iun9-2和q8iun9-3下的uniprot数据库中显示的氨基酸序列组成的蛋白质。最优选地，clec10a包含seqidno：2所示的氨基酸序列或由seqidno：2所示的氨基酸序列组成。
已经在几种物种中鉴定了clec10a的直系同源物，包括小鼠、大鼠和斑马鱼。人携带clec10a的单个基因，而小鼠具有两个密切相关的mgl1和mgl2基因。鼠受体蛋白也在巨噬细胞和未成熟树突状细胞上表达。人clec10a和鼠受体蛋白在氨基酸水平上显示出高度的同源性。在碳水化合物识别结构域中，人clec10a与小鼠mgl1和小鼠mgl2二者具有约60％的氨基酸序列同一性(suzukietal.(1996)thejournalofimmunology,156:128-135)。人clec10a、小鼠mgl1和小鼠mgl2表现出类似的配体偏好，并且之前报道的结合研究已经证明所有三种受体蛋白都识别gal-和galnac相关(suzukietal.(1996)thejournalofimmunology,156:128-135；oo-puthinanetal.(2008)biochimicaetbiophysicaacta,1780:89-100)。mgl1和mgl2在其氨基酸序列中彼此高度同源(约90％氨基酸同一性)，并且在碳水化合物识别结构域中具有高度的同一性(tsuijietal.(2002)thejournalofbiologicalchemistry,277:28892-28901；oo-puthinanetal.(2008)biochimicaetbiophysicaacta,1780:89-100)。
根据本发明的优选直系同源物包括：
-来自小鼠(musmusculus)的直系同源物例如具有或由uniprot标识p49300、f8whb7和q8jzn1之一定义的氨基酸序列组成的多肽；
-来自大鼠(rattusnorvegicus)的直系同源物(例如具有或由uniprot标识p49301定义的氨基酸序列组成的多肽)；
-来自兔(oryctolaguscuniculus)的直系同源物，
-来自豚鼠(caviaporcellus)的直系同源物，
-来自食蟹猴(macacafascicularis)的直系同源物，和
-来自普通猕猴(macacamulatta)的直系同源物。
能够结合clec10a的化合物
能够结合clec10a的化合物(以下称为“该化合物”)的类型或类别没有特别限定。然而，优选地，该化合物是肽或多肽，最优选地，该化合物是抗体或其片段。
本文所用的术语“抗体”是指与特定抗原结合或具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆、单克隆、遗传工程化和其他修饰形式的抗体，包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、异源缀合抗体(例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)、抗体的单域抗体(纳米抗体)和抗原结合片段，包括例如fab'、f(ab')2、fab、fv、rigg和scfv片段。此外，除非另有说明，否则术语“单克隆抗体”(mab)意在包括完整分子以及抗体片段(例如fab和f(ab')2片段)，其能够结合蛋白质。fab和f(ab')2片段缺乏完整抗体的fc片段，从动物或植物的循环中更快地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(wahletal,1983,j.nucl.med.24:316)。
本发明的抗体能够结合clec10a的至少一种变体。在优选的实施方案中，抗体能够结合由seqidno：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。在最优选的实施方案中，抗体能够结合由seqidno：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
在其它实施方案中，抗体能够结合clec10a的细胞外结构域，例如结合seqidno：2的氨基酸61-316内的表位。
优选地，本发明的抗体与clec10a的凝集素结合位点结合。
优选地，本发明的抗体通过可变区中的氨基酸残基与clec10a结合。更优选地，本发明的抗体不含有衍生自abo(h)血型抗原的可接近的糖残基，该抗体不包含半乳糖、岩藻糖或n-乙酰半乳糖胺的可接近的糖残基。甚至更优选地，该抗体在fc区中不含有糖基化位点，例如，该抗体是根据kabat编号的残基n297的突变的igg。最优选地，抗体不是糖基化的。
还优选抗体特异性结合clec10a。在一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合以下受体中的两种或更多种、优选所有：asgpr1、colec12、clec4f、clec4m、scara5和mmr。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合asgpr1(uniprot标识：p07306)。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合colec12(uniprot标识：q5ku26)。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合clec4f(uniprot标识：q8n1n0)。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合clec4m(uniprot标识：q9h2x3)。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合scara5(uniprot标识：q6zmj2)。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合mmr(uniprot标识：p22897)。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a，但不能结合以下受体中任何一种：asgpr1、colec12、clec4f、clec4m、scara5和mmr。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a的至少一种鼠直系同源物。在该实施方案中，抗体可能能够结合mgl1、mgl2或mgl1和mgl2两者。抗体可能能够结合具有或由uniprot标识p49300中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。抗体可能能够结合具有或由uniprot标识f8whb7中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。抗体可能能够结合具有或由uniprot标识q8jzn1中定义的氨基酸序列组成的蛋白质。
在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a的大鼠直系同源物。在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a的兔直系同源物。在另一个实施方案中，抗体能够结合clec10a的食蟹猴直系同源物和/或普通猕猴直系同源物。
可以如下文实施例1所述测定抗体与clec10a的结合。
由clec10a和抗体形成的复合物的解离常数kd优选小于100nm，更优选小于10nm，最优选小于5nm。通常，kd范围为约10pm至约100nm，或约100pm至约10nm，或约500pm至约5nm。
优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，并且不是产生其的方法。单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。(harlowandlane,"antibodies,alaboratorymanual"cshpress1988,coldspringharborn.y.)。
在其他实施方案中，包括在人中体内使用抗clec10a抗体，可以使用嵌合、灵长类、人源化或人抗体。在优选的实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体，更优选单克隆人抗体或单克隆人源化抗体。
本文所用的术语“嵌合”抗体是指具有衍生自非人免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗体)的可变序列和通常选自人免疫球蛋白模板的人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体的制备方法是本领域已知的。参见，例如，morrison,1985,science229(4719):1202-7；oietal,1986,biotechniques4:214-221；gilliesetal.,1985,j.immunol.methods125:191-202；美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816397，其全部内容通过引用并入本文。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其他目标结合子序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的对应于非人免疫球蛋白的cdr区域和全部或基本上所有的fr区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的一部分。人源化是制备嵌合抗体的技术，其中人可变结构域的一个或多个氨基酸或部分已经被来自非人物种的相应序列所置换。人源化抗体是在非人物种中产生的结合期望的抗原的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(cdr)和来自人免疫球蛋白分子的框架(fr)区域。通常，人框架区中的框架残基将被来自cdr供体抗体的相应残基置换，以改变(优选改善)抗原结合。这些框架置换通过本领域熟知的方法来鉴定，例如，通过cdr和框架残基的相互作用的建模来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较来鉴定在特定位置处的异常框架残基。参见例如riechmannetal.,1988,nature332:323-7和queenetal.的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370(其各自的全部内容通过引用并入本文)。抗体可以使用本领域已知的各种技术进行人源化，包括例如cdr移植(ep239400；pct公开wo91/09967；美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(ep592106；ep519596；padlan,1991,moi.immunol,28:489-498；studnickaetal,1994,prot.eng.7:805-814；roguskaetal,1994,proc.natl.acad.sci.91:969-973)和链置换(chainshuffling)(美国专利号5,565,332)，所有这些的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，如queenetal的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370(其各自的全部内容通过引用并入本文)中所述制备人源化抗体。
在一些实施方案中，抗clec10a抗体是人抗体。完全“人”抗clec10a抗体对于人类患者的治疗性治疗可能是期望的。如本文所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因并且不表达内源性免疫球蛋白的动物分离的抗体。可以通过本领域已知的多种方法制备人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上文所述噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和pct公开wo98/46645、wo98/50433、wo98/24893、wo98/16654、wo96/34096、wo96/33735和wo91/10741，其各自的全部内容通过引用并入本文。也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如pct公开wo98/24893、wo92/01047、wo96/34096、wo96/33735；美国专利号5,413,923、5,625,126；5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598，其全部内容通过引用并入本文。可以使用称为“指导的选择(guidedselection)”的技术来产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(jespersetal,1988,biotechnology12:899-903)。
在一些实施方案中，抗clec10a抗体是灵长类化抗体。术语“灵长类化抗体”是指包含猴可变区和人恒定区的抗体。产生灵长类化抗体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,658,570、5,681,722和5,693,780，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗clec10a抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆(优选人或人源化)抗体。在本方法中有用的双特异性抗体中，结合特异性可以针对clec10a上的两种不同的特异性表位，从而比单特异性抗体更加有效地阻断vwf的结合。
在一些实施方案中，抗clec10a抗体是衍生化抗体。例如但不限于，已经通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接进行了修饰的衍生化抗体(参见下文关于抗体缀合物的讨论)等。许多化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
在一些实施方案中，抗clec10a抗体或其片段可以是这样的抗体或抗体片段，其序列已被修饰以相对于相应的野生型序列减少至少一个恒定区介导的生物效应子功能。为了修饰抗clec10a抗体，使得其表现出与fc受体的结合降低，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在fc受体(fcr)相互作用所需的特定区域突变(参见例如，canfieldandmorrison,1991,j.exp.med.173:1483-1491；和lundetal,1991,j.immunol.147:2657-2662)。抗体的fcr结合能力的降低还可以降低依赖于fcr相互作用的其它效应子功能，例如调理作用和吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性。
另一方面，抗clec10a抗体或其片段可以是已被修饰以增加或降低其与胎儿fc受体fcrn的结合亲和力的抗体或抗体片段。为了改变对fcrn的结合亲和力，抗体的免疫球蛋白恒定区片段可以在fcrn相互作用所必需的特定区域突变(参见例如wo2005/123780)。增加对fcrn的结合亲和力应该增加抗体的血清半衰期，降低对fcrn的结合亲和力应相反地降低抗体的血清半衰期。在具体实施方案中，抗clec10a抗体是igg类的抗体，其中重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一个被用未修饰抗体中存在的氨基酸残基不同的氨基酸残基置换。igg类抗体包括igg1、igg2、igg3和igg4的抗体。置换可以在单独的位置250、314或428或其任何组合中进行，例如在位置250和428，或在位置250和314，或在位置314和428，或在位置250、314和428，其中在位置250和428作为优选组合。对于每个位置，置换氨基酸可以是与未修饰抗体的该位置中存在的氨基酸残基不同的任何氨基酸残基。对于位置250，置换氨基酸残基可以是除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。对于位置314，置换氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。对于位置428，置换氨基酸残基可以是除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包括但不限于丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸或酪氨酸。wo2005/123780的表1中鉴定了合适的氨基酸置换的具体组合，该表全部内容通过引用并入本文。另见hintonetal的美国专利号7,217,797、7,361,740、7,365,168和7,217,798，其全部内容通过引用并入本文。
在另一方面，抗clec10a抗体具有插入一个或多个其高变区的一个或多个氨基酸，例如us2007/0280931中所述。
抗体缀合物
在一些实施方案中，抗clec10a抗体是通过例如任何类型的分子共价连接到抗体而被修饰的抗体缀合物，使得共价连接不干扰与clec10a的结合。将效应子部分与抗体缀合的技术在本领域中是熟知的(参见例如hellstrom等人,controlleddragdelivery,2nded.,于pp.623-53(robinson等人,eds.,1987))；thorpeetal,1982,immunol.rev.62:119-58和dubowchik等人,1999,pharmacologyandtherapeutics83:67-123)。
在一个实例中，抗体或其片段通过共价键(例如，肽键)在任选地n-末端或c-末端融合到另一种蛋白质(或其部分；优选在蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列。优选地，抗体(或其片段)在抗体恒定结构域的n-末端与另一个蛋白质连接。可以使用重组dna程序来产生这样的融合物(例如如wo86/01533和ep0392745中所述)。在另一个实例中，效应子分子可以增加体内的半衰期。这种类型的合适的效应子分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物(例如在wo2005/117984中描述的那些)。
在一些实施方案中，抗clec10a抗体可以连接到聚(乙二醇)(peg)部分上。例如，如果抗体是抗体片段，peg部分可以通过位于抗体片段中的任何可用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基基团)连接。这样的氨基酸可以天然存在于抗体片段中，或者可以使用重组dna方法工程改造到片段中。参见例如美国专利5,219,996。可以使用多个位点来连接两个或更多个peg分子。优选地，peg部分通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接。当巯基用作连接点时，可以使用适当活化的效应子部分，例如巯基选择性衍生物如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。
在另一个实例中，抗clec10a抗体缀合物是经修饰的fab'片段，其是peg化的，即具有共价连接到其上的peg(聚(乙二醇))(例如根据ep0948544中公开的方法)。另见poly(ethyleneglycol)chemistry,biotechnicalandbiomedicalapplications,(j.miltonharris(ed.),plenumpress,newyork,1992)；poly(ethyleneglycol)chemistryandbiologicalapplications,(j.miltonharrisands.zalipsky,eds.,americanchemicalsociety,washingtond.c,1997)；和bioconjugationproteincouplingtechniquesforthebiomedicalsciences,(m.aslamanda.dent,eds.,grovepublishers,newyork,1998)；和chapman,2002,advanceddrugdeliveryreviews54:531-545。
治疗凝血疾病
本文所述的抗clec10a抗体可用于治疗凝血疾病，包括但不限于血友病和血管性血友病。优选地，该疾病是血友病a或血管性血友病。
术语“血友病a”是指功能性凝血fviii缺乏症，其通常是遗传的。
术语“血管性血友病”(vwd)是指与vwf的定性或定量缺乏有关的凝血异常症。
疾病的治疗包括已经在任何临床阶段或症状时诊断为具有任何形式的疾病的患者的治疗；疾病的症状或指征的发作或进展或加重或恶化的延缓；和/或预防和/或降低疾病的严重性。
向其施用抗clec10a抗体的“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，例如非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类(例如猴或人)。优选地，患者是人。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成年患者。
本文描述了包含抗clec10a抗体和任选的一种或多种另外的治疗剂如下述第二治疗剂的组合物。组合物通常作为包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用于患者的所需方法)。
抗clec10a抗体可以通过各种途径施用于患者，例如经口、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、鞘内、外用或局部。任何给定情况下最合适的给药途径将取决于具体的抗体、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，静脉内施用抗clec10a抗体。
在典型的实施方案中，抗clec10a抗体以足以允许以0.5mg/kg至20mg/kg静脉内施用的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，适用于本文所述的组合物和方法的抗体浓度包括但不限于0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg，或者在任何上述值之间的范围，例如1mg/kg至10mg/kg、5mg/kg至15mg/kg或10mg/kg至18mg/kg。
抗clec10a抗体的有效剂量可以为每个单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用约0.001至约750mg/kg，或达到血清浓度为每个单次(例如，推注)施用、多次施用或连续施用0.01-5000μg/ml血清浓度或其中根据所治疗的病症、施用途径和受试者的年龄、体重和状况的任何有效范围或值。在某些实施方案中，每个剂量可以为每千克体重约0.5mg至约50mg或每千克体重约3mg至约30mg。抗体可以配制为水溶液。
药物组合物可以方便地以每剂量含有预定量的抗clec10a抗体的单位剂量形式存在。这样的单位可以含有0.5mg至5g，例如但不限于1mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、750mg、1000mg，或者在任何上述值之间的范围，例如10mg至1000mg、20mg至50mg或30mg至300mg。药学上可接受的载体可以取决于例如待治疗的病症或施用途径的多种形式。
用抗clec10a抗体确定有效剂量、总剂量数和治疗长度完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以使用标准剂量递增研究来确定。
可以通过将具有所需纯度的抗体与任选的本领域通常使用的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在本文中称为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子洗涤剂、抗氧化剂和其它各种添加剂混合制备适用于本文所述方法的抗clec10a抗体的治疗剂型，作为冻干制剂或水溶液储存。参见remington'spharmaceuticalsciences,16thedition(osol,ed.1980)。这样的添加剂所用的剂量和浓度必须对接受者无毒。
缓冲剂有助于将ph值保持在接近生理条件的范围内。它们可以以约2mm至约50mm的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物，柠檬酸-柠檬酸三钠混合物，柠檬酸-柠檬酸单钠柠檬酸盐混合物等)，琥珀酸盐缓冲剂(例如琥珀酸-琥珀酸一钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸缓冲剂(例如酒石酸-酒石酸钠混合物，酒石酸-酒石酸钾混合物，酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲剂(例如富马酸-富马酸一钠混合物，富马酸-富马酸二钠混合物，富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)，葡萄糖酸盐缓冲剂(例如葡萄糖酸-葡糖酸钠混合物，葡萄糖酸-氢氧化钠混合物，葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲剂(例如草酸-草酸钠混合物，草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲剂(例如乳酸-乳酸钠混合物，乳酸-氢氧化钠混合物，乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如乙酸-乙酸钠混合物，乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如tris。
可以加入防腐剂以延迟微生物生长，并且可以以0.2％-1％(w/v)的量加入防腐剂。合适的防腐剂包括苯酚，苄醇，间甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，十八烷基二甲基苄基氯化铵，苄基卤化铵(例如氯化物、溴化物和碘化物)，六氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯，儿茶酚，间苯二酚，环己醇和3-戊醇。可以加入有时称为“稳定剂”的等渗剂以确保液体组合物的等渗性，并且等渗剂包括多羟基糖醇，优选三羟基或更高的糖醇，例如甘油，赤藓醇，阿糖醇，木糖醇，山梨醇和甘露醇。稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能范围可以从填充剂到添加剂，所述添加剂溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(上面列举的)；氨基酸如精氨酸，赖氨酸，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，丙氨酸，鸟氨酸，l-亮氨酸，2-苯丙氨酸，谷氨酸，苏氨酸等，有机糖或糖醇如乳糖，海藻糖，水苏糖，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，核糖醇，肌醇，半乳糖醇，甘油等，包括环多醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂如尿素，谷胱甘肽，硫辛酸，巯基乙酸钠，硫代甘油，α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少的肽)；蛋白质如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二糖如乳糖，麦芽糖，蔗糖和三糖如棉子糖；和多糖如葡聚糖。稳定剂可以以活性蛋白质重量的0.1至10,000重量/份存在。
可以添加非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质免受搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)，泊洛沙姆(184、188等)，普朗尼克多元醇，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
附加的其它赋形剂包括填充剂(例如淀粉)，螯合剂(例如edta)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，甲硫氨酸，维生素e)和助溶剂。
除了抗clec10a抗体之外，本文的制剂还可以含有第二治疗剂。合适的第二治疗剂的实例提供如下。
给药方案可以根据许多临床因素(包括疾病的类型、疾病的严重程度和患者对抗clec10a抗体的敏感性)从每月一次到每天发生变化。在具体实施方案中，抗clec10a抗体以下面的方式施用：每天，每周两次，每周三次，每5天，每10天，每两周，每三周，每四周一次或每月一次，或在上述值中的任意两个值之间的任何范围，例如从每四个星期到每个月，从每10天到每两周，或每周两到三次等。
所施用的抗clec10a抗体的剂量将根据具体的抗体、受试者以及疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)和所选择的施用途径；可以由本领域技术人员容易地确定合适的剂量。
本领域技术人员将认识到，抗clec10a抗体的单个剂量的最佳量和间隔将由所治疗病症的性质和程度、施用形式、途径和部位以及受治疗的特定受试者的年龄和状况确定，以及医生将最终确定要使用的合适的剂量。每当合适时，该剂量可以重复。如果发展出副作用，剂量的量和/或频率可以根据正常的临床实践改变或减少。
联合治疗
优选地，用抗clec10a抗体治疗的患者也用凝血疾病的常规疗法进行治疗。例如，患有血友病的患者通常也用凝血因子(例如，因子viii、vwf或其组合)进行治疗。
本文所用的术语“血管性血友病因子”(vwf)包括天然存在的vwf，还包括其变体，例如，片段，融合蛋白或缀合物，或其中一个或多个残基已被插入、缺失或被置换但保留天然存在的vwf的生物学活性的序列变体。如果vwf变体保留至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，最优选至少75％的野生型vwf的至少一种生物活性，则生物活性在本发明的意义上得到保留。野生型vwf及其变体的生物活性可由本领域技术人员使用瑞斯托菌素辅因子活性的方法(federiciabetal.2004.haematologica89:77-85)，vwf与血小板中的糖蛋白复合物ib-v-ix的gpibα的结合(suckeretal.2006.clinapplthrombhemost.12:305-310)，胶原结合测定(kallas&talpsep.2001.annalsofhematology80:466-471)，或与因子viii的结合来测定。
术语“因子viii”和“fviii”在本文中同义使用。“fviii”包括fviii的天然等位基因变异，可能存在并发生于从一个个体到另一个个体。使用熟知的生产和纯化方法，fviii可以是血浆衍生的或重组产生的。糖基化、酪氨酸硫酸化和其他翻译后修饰的程度和位置可以变化，这取决于所选择的宿主细胞及其生长条件。
术语fviii包括fviii类似物。本文所用的术语“fviii类似物”是指与fviii的野生型氨基酸序列(即由uniprot标识p00451定义的序列)相比，其中一个或多个氨基酸已被置换或缺失的fviii分子(全长或b结构域截短/缺失或单链fviii)，或对于b结构域截短/缺失的fviii分子，该氨基酸序列的相应部分。fviii类似物不是在自然界中发生，而是通过人类操作获得的。
根据本发明使用的因子viii分子也可以是b结构域截短/缺失的fviii分子，其中剩余的结构域对应于fviii野生型氨基酸序列的氨基酸编号1-740和1649-2332所示的序列。其他形式的b结构域缺失的fviii分子在其a3结构域中另外具有部分缺失，这得到单链fviii分子。
因此，这些fviii分子是在转化的宿主细胞(优选哺乳动物来源)中产生的重组分子。然而，b结构域缺失的fviii(即三个a-结构域，两个c结构域以及a1，a2和a3区域)中的剩余结构域可能略有不同，例如与各自野生型氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)有约1％，2％，3％，4％或5％的氨基酸序列的不同。
根据本发明使用的fviii分子可以是双链fviii分子或单链fviii分子。包含在本发明组合物中的fviii分子也可以是fviii的生物活性片段，即其中除了b结构域之外的一个或多个结构域已被缺失或截短的fviii，但其中缺失/截短形式的fviii分子保留其支持血块形成的能力。可以使用本领域熟知的技术在体外评估fviii活性。根据本发明的用于测定fviii活性的优选测试是显色底物测定或一步测定(参见下文)。可以在其余的结构域中引入氨基酸修饰(置换，缺失等)，例如以修饰因子viii与如下的各种其它成分的结合能力：例如，血管性血友病因子(vwf)，低密度脂蛋白受体相关蛋白(lpr)，各种受体，其他凝血因子，细胞表面等，或为了引入和/或消除糖基化位点等。不消除fviii活性的其他突变也可以适用于本发明组合物中使用的fviii分子/类似物。
fviii类似物还包括fviii分子，其中亲本多肽的一个或多个氨基酸残基已被缺失或被其它氨基酸残基置换，和/或其中另外的氨基酸残基已添加到亲本fviii多肽中。
此外，因子viii分子/类似物可以在例如截短的b结构域中和/或在分子(“fviii衍生物”)的一个或多个其他结构域中包括其它修饰。这些其它修饰可以是与因子viii分子缀合的各种分子的形式，例如，聚合物化合物，肽化合物，脂肪酸衍生化合物等
术语fviii包括糖基化的fviii。在本发明的上下文中，术语“糖基化的fviii”旨在表示其中一个或多个peg基团已通过多肽的多糖侧链(聚糖)连接到fviii多肽上的因子viii分子(包括全长fviii和b结构域截短/缺失的fviii)。
术语fviii包括具有保护基或半衰期延长部分的fviii分子。术语“保护基”/“半衰期延长部分”在本文中被理解为指连接至一个或多个氨基酸位点链功能度(例如-sh，-oh，-cooh，-conh2，-nh2或一种或多种n-和/或o-聚糖结构)的一个或多个化学基团，并且当与许多治疗性蛋白质/肽缀合时可以增加这些蛋白质/肽的体内循环半衰期。保护基/半衰期延长部分的实例包括：生物相容性脂肪酸及其衍生物，羟烷基淀粉(has)，例如。羟基乙基淀粉(hes)，聚(glyx-sery)n(高氨基酸聚合物(hap))，透明质酸(ha)，肝素前体(heparosan)聚合物(hep)，磷酰胆碱基聚合物(pc聚合物)，
可以根据本发明使用的fviii分子包括融合蛋白，其包含与异源氨基酸序列、优选半衰期延长的氨基酸序列融合的fviii氨基酸序列。优选的融合蛋白是fc融合蛋白和白蛋白融合蛋白。术语“fc融合蛋白”在本文中旨在涵盖与可以衍生自任何抗体同种型的fc结构域融合的fviii。由于igg抗体的相对长的循环半衰期，iggfc结构域通常是优选的。此外可以修饰fc结构域以便调节某些效应子功能，例如，补体结合和/或结合某些fc受体。fviii与具有结合fcrn受体能力的fc结构域的融合通常会导致与wtfviii的半衰期相比，融合蛋白的循环半衰期延长。因此，用于本发明的fviii分子也可以是fviii类似物的衍生物，例如fviii类似物的融合蛋白，聚乙二醇化或糖基化聚乙二醇化fviii类似物，或与肝素前体聚合物缀合的fviii类似物。本文中术语“白蛋白融合蛋白”意在涵盖与白蛋白氨基酸序列或其片段或衍生物融合的fviii。异源氨基酸序列可以融合到fviii的n-或c-末端，或者它可以内部插入fviii氨基酸序列内。异源氨基酸序列可以是wo2008/077616a1中描述的任何“半衰期延长多肽”，其公开内容通过引用并入本文。
用于本发明组合物的fviii分子的实例包括例如在wo2010/045568、wo2009/062100、wo2010/014708、wo2008/082669、wo2007/126808、us2010/0173831、us2010/0173830、us2010/0168391、us2010/0113365、us2010/0113364、wo2003/031464、wo2009/108806、wo2010/102886、wo2010/115866、wo2011/101242、wo2011/101284、wo2011/101277、wo2011/131510、wo2012/007324、wo2011/101267、wo2013/083858和wo2004/067566中描述的fviii分子。
可用于本发明组合物中的fviii分子的实例包括
根据本发明使用的组合物中因子viii的浓度通常在10-10,000iu/ml的范围内。在不同的实施方案中，本发明组合物中fviii分子的浓度在10-8,000iu/ml、或10-5,000iu/ml、或20-3,000iu/ml、或50-1,500iu/ml的范围内或者是3,000iu/ml、或2,500iu/ml、或2,000iu/ml、或1,500iu/ml、或1,200iu/ml,1,000iu/ml、或800iu/ml、或600iu/ml、或500iu/ml、或400iu/ml、或300iu/ml、或250iu/ml、或200iu/ml、或150iu/ml、或100iu/ml。
“国际单位”或“iu”是通过fviii活性测定测量的fviii的凝血活性(效力)的量度单位，所述fviii活性测定例如使用针对在“iu”中校准的国际标准制剂的标准校准的一步凝血测定或显色底物fviii活性测定。一步凝血测定是本领域已知的，例如在nlee,martinl,etal.,aneffectofpredilutiononpotencyassaysoffviiiconcentrates,thrombosisresearch(pergamonpressltd.)30,511519(1983)中描述的。一步测定的原理：测试作为激活的部分促凝血酶原激酶时间(aptt)-测定的修改版本进行：血浆与磷脂和表面活化剂的孵育导致内源性凝血系统因子的激活。加入钙离子会引发凝血级联。测定形成可测量的纤维蛋白凝块的时间。该测定在因子viii缺乏血浆的存在下进行。缺乏血浆的凝血能力由待测样品中包含的凝血因子viii恢复。凝血时间的缩短与样品中存在的因子viii的量成正比。通过与国际单位中具有已知因子viii活性的标准制剂直接比较来定量凝血因子viii的活性。
另一个标准测定是显色底物测定。显色底物测定可以商业购买，例如coamaticfviii测试试剂盒(chromogenix-instrumentationlaboratoryspav.lemonza338-20128milano,italy)。显色测定的原理：在钙和磷脂存在下，因子x被因子ixa激活成因子xa。因子viiia作为辅因子刺激该反应。fviiia由反应混合物中的少量凝血酶从待测样品中的fviii形成。当使用最佳浓度的ca2+、磷脂和因子ixa和过量的因子x时，因子x的活化与因子viii的效力成正比。活化的因子x从显色底物s-2765中释放发色团pna。因此，在405nm处测量的pna的释放与所形成的fxa的量成比例，因此也与样品的因子viii活性成比例。
在一个实施方案中，治疗包括将本发明的抗clec10a抗体和因子viii施用于患有血友病、优选血友病a的患者。
在另一个实施方案中，治疗包括将本发明的抗clec10a抗体和vwf施用于患有血友病、优选血友病a的患者。
在另一个实施方案中，治疗包括将本发明的抗clec10a抗体和因子viii和vwf施用于患有血友病、优选血友病a的患者。
在另一个实施方案中，治疗包括将本发明的抗clec10a抗体和vwf施用于患有血管性血友病的患者。
在一个具体实施方案中，同时施用抗clec10a抗体和凝血因子(例如因子viii、vwf或其组合)。在另一个实施方案中，分开施用抗clec10a抗体和凝血因子(例如因子viii、vwf或其组合)。抗clec10a抗体的施用与凝血因子(例如因子viii、vwf或其组合)之间的时间没有特别限定。优选在抗clec10a抗体之前施用凝血因子(例如因子viii、vwf或其组合)。
本发明的另一方面是药盒，其包含(i)如上文所定义的第一化合物(优选抗体)和(ii)选自因子viii、血管性血友病因子及其组合的多肽。优选地，化合物(优选抗体)和多肽包含在分开的组合物中。
本发明的另一方面是药盒，其包含(i)如上文所定义的第一化合物(优选抗体)和(ii)选自因子viii、血管性血友病因子及其组合的多肽，用于同时、分开或顺序用于治疗凝血疾病。
本发明的另一方面是如上所定义的化合物(优选抗体)用于增加血管性血友病因子的半衰期或降低血管性血友病因子的清除的用途。
术语“半衰期”是指从体内循环中消除一半的蛋白质所需的时间。可以测定曲线下面积(auc)以评估清除效果。清除的减少导致较高的auc值和半衰期的增加。
本发明的另一方面是上文定义的化合物(优选抗体)用于增加因子viii的半衰期的用途。
本发明的另一方面是如上文所定义的化合物(优选抗体)，其用于在治疗性治疗中延长血管性血友病因子的半衰期。
本发明还涉及在体内增加血管性血友病因子的半衰期或降低血管性血友病因子的清除的方法，包括向受试者施用有效量的如上文所定义的化合物(优选抗体)。
本发明的另一方面是治疗凝血疾病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的如上文所定义的化合物(优选抗体)。
另一方面是如上定义的化合物(优选抗体)在血友病a治疗中降低施用fviii的频率的用途。静脉内或皮下施用fviii的频率可以减少到每周两次。或者，静脉内或皮下施用fviii的频率可以减少到每周一次。
另一方面是如上定义的化合物(优选抗体)在vwd治疗中降低施用vwf的频率的用途。静脉内或皮下施用vwf的频率可以减少到每周两次。或者，静脉内或皮下施用vwf的频率可以减少到每周一次。
另一方面是如上定义的化合物(优选抗体)用于降低在血友病a的治疗中待施用的剂量fviii的用途。
另一方面是如上定义的化合物(优选抗体)用于降低在vwd治疗中待施用的剂量vwf的用途。
本文所用的术语“abo(h)血型抗原”是指存在于通常被抗a或抗b抗体识别的红细胞上的碳水化合物抗原。abo(h)血型系统是人输血中最重要的血型系统。h抗原是abo(h)血型抗原的必需前体，并且是主要与蛋白质连接的碳水化合物结构，其中少部分连接到神经酰胺。它由β-d-半乳糖，β-d-n-乙酰氨基葡萄糖，β-d-半乳糖和2-连接的a-l-岩藻糖的链组成。a抗原含有与h抗原末端的d-半乳糖残基键合的a-n-乙酰半乳糖胺，而b-抗原具有与h抗原的d-半乳糖键合的a-d-半乳糖残基。因此，abo(h)血型系统的末端糖残基是半乳糖、n-乙酰半乳糖胺和岩藻糖。
实施例
实施例1：单体人vwf与重组人clec10a的相互作用
材料与方法
应用表面等离子体共振(spr)技术(biacoret200,gehealthcarebiosciences,uppsala,sweden)来评估纯化的单体人vwf(分析物)和受体蛋白如clec10a(配体)之间的实时生物分子相互作用的机制。基于spr的仪器(例如biacoret200)使用光学方法来监测接近固定有配体的金属传感器表面背面的折射率变化。分析物处于流动相中，其连续通过固定的配体。配体捕获分析物的事件导致分析物在表面上的积累，并导致折射率的增加，折射率是通过检测反射光的强度变化实时地作为spr响应来测量的。spr信号以ru表示，随着时间的推移信号的变化显示为传感图。从实验响应中减去来自参考流动池的背景响应。spr信号变化的大小与被固定或捕获的质量成正比，并且允许实时和无标记环境中结合常数的测定和结合现象的动力学分析(biacorehandbook,2008；schasfoort&tudos,2008；biacorehandbook,2012)。
在流动池温度为+25℃下，通过应用ph7.4的运行缓冲液进行相互作用实验，该缓冲液含有10mmhepes、150mmnacl、5mmcacl2和0.05％(w/v)tween-20，其也用作样品稀释缓冲液。使用的蛋白质在应用前通过pd-10脱盐柱(gehealthcarelifesciences,freiburg,germany)转移到运行缓冲液中。试剂和缓冲液储备溶液购自gehealthcarebiosciences(uppsala,sweden)，缓冲溶液在使用前用无菌过滤(0.22μmstericup过滤单元，millipore,massachusetts,usa)进行。clec10a的细胞外结构域是从r&dsystems(wiesbaden,germany)获得的。此外，使用人白蛋白(cslbehring,marburg,germany)作为对照蛋白。clec10a被捕获在根据制造商的说明书预处理的s系列传感器芯片c1(平坦羧甲基化)上。clec10a的研究开始于预浓缩步骤，以便估计获得所期望的固定水平所需的蛋白质的量以及确定用于固定的最佳ph值。为了有效固定，固定化缓冲液的ph值应低于配体的等电点。因此，对于ph搜索(scouting)，首先将clec10a溶解在wfi中至浓度为1mg/ml，再分别在ph4.0、4.5、5.0和5.5的10mm乙酸钠缓冲液中1:50稀释。根据biacore仪器控制软件中的固定ph搜索向导，通过施加180秒的接触时间和5μl/min的流速进行该方法。分析后，在共价固定开始之前，用50mmnaoh再生表面。
为了固定，将溶解的clec10a用最适ph值(ph5.0)的10mm乙酸钠缓冲液稀释至浓度为20μg/ml。通过根据制造商的操作方案应用胺偶联试剂盒将配体通过游离胺基共价固定到羧甲基葡聚糖基质上。在0.05medc和0.2mnhs的1:1混合物活化7分钟后，在配体的伯胺基和存在于芯片表面上的游离羧酸基团之间发生偶联。在+25℃下以10μl/min的流速进行固定。最终，达到700至1,500ru之间的表面强度的目标。此外，包括没有固定蛋白质的空白流动池作为芯片上大量位移(bulkshift)和非特异性结合变化的参考表面。在配体固定后，两个芯片表面被1m乙醇胺-hcl(ph8.5)封闭7分钟，并且在固定过程中潜在形成的非共价非特异性相互作用通过用10mmnaoh在流速为25μl/min下洗涤10秒洗涤3次来去除。在每种情况下，用运行缓冲液执行5个启动循环来调节spr基线。
制备递增浓度的单体vwf作为运行缓冲液中的2倍连续稀释系列，并以25μl/min注到芯片表面上，以表征蛋白质-配体相互作用。vwf单体的浓度介于4,000和31.25nm之间，并且基于单体vwf的mw计算。由于spr系统对缓冲液组成变化的高灵敏度，所有样品被设计成含有类似的缓冲液组成。选择相对较高的流速以避免由于传质限制导致的潜在重新结合。相互作用分析循环由5分钟的样品注射阶段组成。在该结合阶段中，vwf结合到固定在表面上的clec10a，并增加了表面质量。该阶段之后是运行缓冲液中17分钟的解离阶段。在解离阶段，用运行缓冲液代替样品，从表面除去解离的vwf，导致表面质量降低。对所有样品进行重复测定。芯片表面和对照表面二者在每次运行之间用10mmnaoh的10秒脉冲再生，以从表面固定的clec10a中除去结合的vwf，该步骤在开始最后2分钟的用运行缓冲液洗涤步骤和下一次运行之前重复3次。虽然使用biacoret200评估软件1.0版(gehealthcarebiosciences,uppsala,sweden)分析动力学数据，但数据集仅用于信息目的。
spr主要用作质量检测器。通过累积质量的增加检测vwf与clec10a的相互作用，通过减去从对照表面记录的结合响应，然后减去缓冲液空白注射的平均值，鉴定特异性结合。时间点定位在样品注射结束后20秒，并被评估为感兴趣的稳定蛋白质-配体相互作用的代表。因此，该点用于评估和计算vwf和clec10a之间的生物分子相互作用。此外，至少一式两份进行测试，并且在每种情况下相对于基线计算响应。除了vwf-clec10a相互作用的一般评估之外，还测定了亲和力常数(r50％)，其代表占50％的clec10a的总vwf浓度的响应。亲和力常数通过应用定义的报告点用于结合亲和力估计，并使用软件预设的稳态亲和力拟合从非线性全局曲线拟合得出。此外，通过单独拟合解离阶段来计算解离速率常数(解离速率)。建立了一个合适的解离模型(biacoretrainingcourses,2008)，并将前面定义的报告点用于该计算。
结果
如图1所示，对于通过spr表征的clec10a，vwf以剂量依赖的方式显示出强烈的结合。
实施例2：单体人vwf与重组人clec10a和clec10a直系同源小鼠蛋白(mgl1和mgl2)的相互作用
材料与方法
如实施例1所述，将clec10a，mgl1和mgl2分别固定在s系列传感器芯片cm3(用于固定化的ph值：clec10a和mgl1的ph5.0；mgl2的ph5.5)上。受体蛋白的固定通过胺偶联，但目标是6000(±500)ru的表面密度。如实施例1所述进行测试。
结果
通过spr分析研究了结合相互作用。表1以及图2和3中的结果清楚地表明，纯化的人vwf单体在体外以剂量依赖的方式结合人clec10a和两种鼠受体蛋白。通常，对于所有三种受体蛋白都观察到相似的结合特征。
估计vwf受体结合的亲和力常数(r50％)。此外，通过仅拟合解离阶段来计算解离速率常数(解离速率)。代表稳定的蛋白质-配体相互作用的结合响应(在注射结束后20秒)用于计算。与vwf结合人clec10a相比，估计人单体vwf对小鼠受体蛋白mgl1和mgl2的亲和力较低。
表1
实施例3：在存在中和抗mgl1/2抗体的情况下抑制vwf结合mgl2
材料与方法
通过spr分析研究了多克隆山羊抗mgl1/2抗体(prod.no.af4297,r&dsystems,wiesbaden,germany)对vwf结合的抑制作用。将冻干的抗体溶解在运行缓冲液中至浓度为200μg/ml。mgl1和mgl2分别固定在s系列传感器芯片cm3上。通过如前所述的胺偶联来进行受体蛋白的固定。达到6000(±500)ru的表面强度的目标。分别注射运行缓冲液和抗mgl1/2抗体12分钟，然后双路注射单体vwf(2μm)5分钟，最终解离阶段8分钟。在+25℃下以20μl/min的流速进行spr分析。
结果
例如(参见图4)，中和抗mgl1/2显示出与固定的mgl2的强结合(参见图4a和4b)，导致质量增加。用作分析物的vwf不结合固定的受体蛋白，因为中和抗体阻断受体的相应结合结构域。因此，无法检测到vwf结合。相比之下，如通过使用运行缓冲液的对照样品所证明的，vwf在没有中和抗体的情况下强烈地结合到固定的mgl2(参见图4a和4c)。
总之，通过spr分析清楚地证实了多克隆抗体的受体阻断作用。结果，spr分析显示抗体分别完全阻断vwf与固定的mgl1和mgl2的相互作用。因此，两种抗体定性评估为适用于特异性阻断mgl1和mgl2。
实施例4：使用抑制性抗体在体内特异性阻断人clec10a的小鼠直系同源受体蛋白，导致小鼠中vwf的体内清除降低
两种clec10a直系同源受体蛋白mgl1和mgl2存在于小鼠中。将多克隆山羊抗mgl1/2抗体(prod.no.af4297,r&dsystems,wiesbaden,germany)用于体内受体阻断。此外，将从合并的正常山羊血清中纯化的非特异性抗体(prod.no.i5256,sigma-aldrich,st.louis,usa)用作对照处理。
vwf缺陷小鼠静脉内接受8mg特异性抑制抗体/kgb.w，以研究mgl1和mgl2受体对体内vwf清除的影响。之前，将冻干的抗体溶解于等渗nacl溶液(施用体积为5ml/kgb.w.)。非特异性抗体用作对照处理。10分钟后，小鼠以单次静脉内注射(施用体积为5ml/kgb.w.)接受人pdvwf(200iu/kgb.w.)。研究设计包括2组，每组2只小鼠。在施用vwf后收集血液样品(组1：在5和120分钟取样；组2：在60和240分钟取样)，将样品加工成血浆样品，然后通过vwf：agelisa进行分析。所得数据显示在图5中。统计分析的概述在表2中给出。
pk数据分析显示，与接受对照抗体的组相比，vwf缺陷小鼠的抗mgl1/2抗体处理显示对人vwf清除的抑制作用。在抑制性抗mgl1/2抗体的存在下，与对照处理相比auc高约1.7倍，vwf的血浆清除率约低1.7倍。总之，发现mgl1和mgl2在体内vwf清除中起重要作用，可能是vwf摄取的重要介质。
总之，使用抑制性抗体在体内特异性阻断人clec10a的小鼠直系同源受体蛋白的碳水化合物识别结构域，以便进一步评价各受体蛋白在vwf清除中的参与情况。pk数据的分析显示，与接受非特异性对照抗体的组相比，vwf缺陷小鼠的抗mgl1/2抗体处理显示出对人vwf清除的抑制作用。针对mgl1/mgl2抗体在很大程度上抑制人vwf的降解，表明mgl1/mgl2有助于vwf的结合，特异性受体阻断阻止体内vwf的摄取。这些数据表明vwf是通过受体介导的机制被内吞的，并证实人clec10a参与vwf的摄取。
表2：在存在中和mgl1和mgl2二者的受体功能的抗体的情况下，vwf缺陷小鼠中人vwf的体内清除的统计分析
为了评估抗mgl1/2抗体存在下的vwf清除，计算pk数据。在抑制性抗mgl1/2抗体存在下，vwf的清除降低。
*为了便于计算，将等渗nacl溶液的对照处理的auc定义为100％，因此得到因子1.0。
实施例5：针对人clec10a的阻断抗体的产生
对于本领域技术人员来说，存在许多可用于发现针对人重组或膜相关clec10a的阻断抗体的抗体产生方法。在本实施例中，我们使用抗体噬菌体展示技术与重组clec10a用于抗体产生和初步功能筛选。使用基于细胞的内化测定或适当模型的体内药代动力学研究进行抗体阻断活性的确认。
使用基于人fab的噬菌体展示文库(dyaxcorp.cambridge,ma)使用先前描述的方法(wo2013014092a1)针对生物素化的人clec10a进行筛选。经过三轮淘选，从每轮淘选中并使用fab噬菌体elisa筛选与人clec10a的特异性结合而选出多个单独的噬菌体克隆。对于任何clec10a特异性噬菌体克隆，使用pcr扩增fab区，并通过核苷酸测序确定可变区序列(重链和轻链)。为了进一步的功能评估，将clec10a特异性fab抗体重新工程改造成完整的人igg4抗体，并使用如前所述的哺乳动物表达系统(wo2013014092a1)进行表达。通过elisa证实这些igg抗体与clec10a的特异性结合。鉴定了一组具有对人clec10a具有结合特异性的独特igg抗体。
筛选clec10a特异性抗体的功能阻断活性
通过elisa通过其抑制生物素化βgalnacpaa或vwf与clec10a的结合的能力来评估clec10a特异性igg抗体的功能阻断活性。然后在该测定中显示阻断活性的抗体进一步利用流式细胞术表征它们调节活化的巨噬细胞内化荧光团缀合的vwf的能力。
由于从本实施例中鉴定的任何功能阻断抗体在本质上是完全人的，因此它们容易适用于在人中的治疗用途。
序列表
<110>瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司
<120>用于改善血管性血友病因子的半衰期的化合物
<130>a242
<150>ep2015158088.3
<151>2015-03-06
<160>2
<170>patentin3.5版
<210>1
<211>316
<212>prt
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
<223>xaa是cys或arg
<220>
<221>misc_feature
<222>(73)..(73)
<223>xaa是arg或lys
<220>
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<222>(100)..(100)
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<220>
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<222>(203)..(203)
<223>xaa是ala或gly
<400>1
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