本公开内容涉及用于增加重组表达的抗体分子的组合物中单体的量的方法和由本文所述的方法获得或可获得的组合物。治疗性单克隆抗体已成为非常重要的一类治疗剂。如wo2010/019493中所公开的，纯化和配制这些抗体分子是一个挑战。然而，非常重要的是只有最高质量的材料被用于治疗应用。随着新颖和复杂的抗体构建体被产生为治疗剂，例如双特异性形式，这变得更加困难。新的抗体形式通常需要存在包含可变轻链结构域(vl)和可变重链结构域(vh)的至少一个fv区域，其中可变结构域不处于其在c端连接至恒定轻链结构域(cl)或恒定重链结构域(ch1)的天然状态。在天然存在的完整抗体分子中，cl和ch1结构域的存在起到稳定vl和vh的配对的作用。因此，在不存在cl和ch1结构域的情况下，可变结构域倾向于与相邻分子的可变结构域进行动态交换。阻止这种动态过程的一种方法是在vh和vl之间引入二硫键，其锁定v区配对并防止动态交换。然而，二硫键的存在也可以起到稳定不想要的抗体多聚体的作用。新的抗体形式通常还包含接头。然而，当一个分子中的可变结构域与另一个分子中的可变结构域配对，从而将两个分子连接在一起时，接头的存在可能导致形成不想要的多聚体。fv中二硫键的存在然后起到稳定多聚体种类的作用。已知的双特异性抗体形式的实例是wo2010/035012和wo2011/036460中详细描述的fab-dsfv。如图27所示，该抗体形式具有形成包含两个或更多个单体的多聚体的倾向。类似的多聚体种类也存在于包含二硫键合的scfv分子的组合物中，其中来自一个scfv的vh与来自单独的scfv的vl配对以形成二硫化物稳定的fv对，其将两个scfv分子连接在一起从而导致两个scfv的二聚体。单独分子中的可变结构域的进一步配对可以产生更大的多聚体种类。已知的纯化方法如色谱法能够从较小的单体种类中分离出大的多聚体种类，但是这不可避免地导致抗体的总产率较低。因此，对于双特异性抗体形式，非常需要解决抗体组合物中不想要的多聚体种类的问题的方法。本公开内容的方法通过减少包含抗体分子的组合物中多聚体的量来提供对上述问题的解决方案。本公开内容对于提供适用于人类使用的单体单克隆抗体分子的组合物特别有用。因此，提供了用于增加重组表达的抗体分子的组合物中单体百分比的方法，其特征在于所述抗体分子包含至少一个对目标抗原具有特异性的fv，所述fv包含一个vh和一个vl，其中所述vh和vl通过一个或多个接头间接连接或直接连接并通过其间的二硫键稳定，所述方法包括：a)将包含抗体分子的组合物在30至60℃的温度范围内保持至少1小时时间段的热转化步骤，b)其中步骤a)在还原剂存在下或在用还原剂处理后进行。将本文所述的方法用于重组表达的抗体有利地增加了组合物中单体的量。有利地，本文的方法可以容易且成本有效地在商业规模上使用。本发明的方法能够将多聚体种类转化成单体，由此增加单体的百分比。转化步骤有利地允许还原剂还原vh和vl之间和多聚体种类的二硫键以部分变性并由此分解多聚体。该方法还允许vh和vl结构域在单个抗体分子内形成fv对，以及vh和vl之间稳定的二硫键的重新形成从而导致单体。发明人已经令人惊讶地显示转化步骤和还原剂可用于将抗体多聚体转化为抗体单体，而不完全变性抗体。本发明的方法还有利地允许正确的二硫键被重新形成以产生期望的单体。在一个实施方案中，单体浓度的增加是2、3、4倍或更多。本发明的方法优选在热转化步骤之后提供重组抗体组合物，其包含至少50％，至少60％，至少70％，75％，80％，85％或至少90％的单体形式的抗体。在一个实施方案中，本公开内容扩展至从本文公开的方法获得或可获得的抗体或结合片段。本发明还提供了由本文公开的方法获得的组合物用于治疗的用途。附图的简要说明图1显示在50℃下用50mmβ-巯基乙醇(beta-mercaptanethanol)处理的蛋白质-a纯化的抗体a26fab-645dsfv的非还原性sds-page，即在蛋白质a纯化后进行处理时。图2显示了在50℃用50mmβ-巯基乙醇处理的蛋白质-a纯化的抗体a26fab-645dsfv的还原性sds-page，即在蛋白质a纯化后进行处理时。图3显示在37至60℃范围内的温度下，用50mmβ-巯基乙醇处理的抗体a26fab-645dsfv所获得的百分比单体的sec-hplc分析。图4显示处理后获得的单体的预测产率，其作为处理前总的初始靶蛋白产率的百分比。如本文所使用的预测产率是单体的产率，其作为参考处理前的起始产率的百分比。图5显示了当在37℃至60℃范围内的温度用50mmβ-巯基乙醇处理时抗体a26fab-645dsfv随时间的净单体回收的sec-hplc分析。图6显示当在50℃的温度下用浓度为1-50mm的β-巯基乙醇处理时抗体a26fab-645dsfv随时间的净单体回收的sec-hplc分析。图7显示处理后获得的单体的预测产率，其作为处理前总的初始靶蛋白产率的百分比。图8在通过sec-hplc(g3000)的过程分析中，确定在所述bmea浓度下在50℃进行转化期间的a26fab-645dsfv净单体回收。图9显示sec-hplc色谱图，其显示了来自尚未经受使用本公开内容方法的处理的重组抗体a26fab-645dsfv的表达的上清液的蛋白质-a纯化。图10显示了sec-hplc色谱图，显示了来自在50℃用50mmβ-硫醇基乙醇处理的重组抗体a26fab-645dsfv的表达的上清液的蛋白质-a纯化。图11显示了a26fab-645dsfv的非还原性sds-page分析，其中澄清的上清液在蛋白a纯化前在50℃用50mmbmea处理。图12显示了a26fab-645dsfv的还原性sds-page分析，其中澄清的上清液在50°用50mmbmea处理，然后进行蛋白a纯化。图13和14显示了使用和不使用本文公开的方法制备的在下游加工后的抗体材料的sec-hplc分析。这些图显示使用这两种方法获得的材料提供了可比的材料。图15显示用各种赋形剂处理的a26fab-645dsfv抗体的非还原sdspage。图16a和16b显示了在不同条件下处理后的a26fab-645dsfv的尺寸排阻色谱数据。图17a显示了在室温下用还原剂处理后的单体百分比。图17b显示了在50℃下用还原剂处理2小时后的单体百分比。图18a显示了在室温下用还原剂处理后通过se-hplc分析的单体百分比。图18b显示在50℃下用还原剂处理2小时后通过se-hplc分析的单体百分比。图19-26显示了各种抗体分子序列及其组分。图27显示了单体fab-dsfv和fab-dsfv的多聚体形式。图28显示了示例性抗体形式。图29显示了示例性抗体形式。详细描述本文使用的术语多聚体或多聚体形式是指由来自两个或更多个抗体单体的结构域组成的抗体形式，其中所有结构域都被正确地折叠和配对。举例来说，多聚体可以由两个或更多个抗体单体形成，其中每个vh结构域与vl结构域配对以形成互补的fv区，如图27中针对fab-dsfv所示。在一个实施方案中，如本文所用增加单体的百分比是指获得单体抗体分子的数值，其与应用本发明方法之前获得的单体抗体分子百分比相比，是总靶蛋白产率的较高百分比。例如，单体百分比可以是抗体分子的初始产率的30％并且在应用本发明方法之后单体百分比可以是至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％或至少90％。在一个实施方案中，在执行本公开内容的方法之后，分离的单体的绝对数值即产率更高。本文所用的产率或总蛋白质是指组合物中抗体分子种类的组合值，除非上下文另外指出。在一个实施方案中，所使用的产率值是在根据本公开内容的处理之前的值。在一个实施方案中，所使用的产率值是在执行根据本公开内容的方法之后回收的总蛋白质(抗体分子种类)的量。在执行本公开内容的方法之后回收的总蛋白质(抗体分子种类)将会减少，因为处理不可避免地导致一些损失。靶蛋白是指表达的重组抗体分子。重组蛋白质是蛋白质，例如使用重组技术表达的抗体分子。除非上下文另有说明，否则本文使用的抗体浓度(也称为进料浓度)是指包含靶蛋白质及其多聚体的材料，所有抗体种类(包括单体和多聚体)的浓度。在一个实施方案中，抗体浓度是在蛋白质a纯化步骤以从组合物中除去杂质之后组合物中抗体的浓度。在本发明的方法的步骤a)中，热转化在30至60℃的温度范围内进行。在一个实施方案中，温度在以下范围内，35至60℃，40至60℃，45至5℃，45至50℃，50至55℃，48至52℃，49至51℃，例如46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，50.5℃，51℃，51.5℃，52℃，52.5℃，53℃，53.5℃，54℃，54.5℃和55℃。在一个实施方案中，步骤a)中的温度在46、47、48、49、50、51、52、53、54或55℃，例如约50℃下进行。在本文中使用的在一定范围内的温度并不一定意味着组合物在方法的持续时间内保持在相同的温度下，但是在执行方法的相关步骤的时间段的过程中，组合物通常保持在所述范围内的一个或多个温度。如果和当治疗过程中温度漂移或超出范围时，控制器将采取措施使组合物达到所需的范围。根据本公开内容的将抗体组合物保持在温度范围内的时间段在一个实施方案中是在1至70小时的范围内，例如2至60小时，例如3至50小时，3至10小时，4至6小时，4.5至5.5小时，特别是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25小时。在一个实施方案中，该时间段是大约5个小时。本文使用的还原剂是指能够还原所讨论的分子例如抗体中的二硫键的还原剂。在包含一个或多个二硫键的抗体存在下的还原剂具有在合适条件下还原二硫键的能力，例如形成-sh。在一个实施方案中，还原剂本身包含单个硫醇基，两个硫醇基或三个或更多个硫醇基。或者，还原剂本身不包含硫醇基。如本文所用的硫醇是指包含实体-sh的基团。在一个实施方案中，还原剂选自谷胱甘肽(gsh)，亚硫酸乙烯酯，2-巯基乙醇(bme)，2-巯基乙胺盐包括其盐例如盐酸盐(也称为bmea，bmea或b-mea，β-mea或βmea)，半胱氨酸如半胱氨酸-hcl，亚磷酸和二硫苏糖醇(dtt)，tcep(三(2-羧乙基)膦)，thp(三(羟丙基)膦)。在一个实施方案中，还原剂包含单个硫醇基。有利地，如果使用包含单个硫醇基的还原剂，则单体的可变区之间所需的二硫键天然形成，即需要进行特定的氧化步骤。包含单个硫醇基的还原剂的实例包括但不限于谷胱甘肽，巯基乙醇(例如2-巯基乙醇)，巯基乙胺(例如2-巯基乙胺)和半胱氨酸(例如半胱氨酸-hcl)。在一个实施方案中，硫醇还原剂是巯基乙醇(如2-巯基乙醇)，巯基乙胺(如2-巯基乙胺)，特别是2-巯基乙胺(也称为bmea，bmea或b-mea，β-mea或βmea)。在一个实施方案中，在抗体组合物处于本公开内容的温度范围之前添加还原剂。在一个实施方案中，步骤a)在用还原剂处理之后进行，特别是其中在加热之前除去还原剂。还原剂越强，越可能适合用于预处理步骤并在步骤a)之前除去。因此，在其中还原剂选自亚磷酸，ddt，tcep和thp的一个实施方案中，在步骤a)之前除去还原剂。如果需要，还原剂可以在加热之前通过包括渗滤等常规技术除去。使用tcep可能需要氧化步骤以将最终的抗体分子中所需的二硫键重新引入。在一个实施方案中，在温度达到30至60℃的范围之前，还原剂不被除去。其中还原剂在步骤a)中的加热期间保留在组合物中的实施方案对于含有单个硫醇基的还原剂例如选自谷胱甘肽，巯基乙醇(例如2-巯基乙醇)，巯基乙胺(例如2-巯基乙胺)和半胱氨酸(例如半胱氨酸-hcl)的还原剂是特别有利的。如果还原剂是强度中等和被保留用于热转化步骤a)的dtt或亚磷酸，则可以采用在该范围下限的温度，例如在30-45℃范围内的温度。此外，在一些分子中结合温度使用这些试剂可能需要氧化步骤来重新形成抗体单体分子中的一些或所有所需的二硫键。在一个实施方案中，在抗体组合物处于本公开内容的温度范围之后添加还原剂。在一个实施方案中，当抗体组合物进入本公开内容的温度范围时添加至还原剂。在一个实施方案中，在抗体组合物处于本公开内容的温度范围之后添加还原剂。在一个实施方案中，在不止一个时机添加至还原剂，例如在温度处于所需范围之前和/或在组合物处于所述温度范围之后。在一个实施方案中，在过程中添加还原剂两次或更多次。在上述实施方案中，其中还原剂在步骤a)中的加热之前添加并且在步骤a)中的加热期间保留在组合物中或者在抗体组合物进入温度范围时或者在抗体组合物处于本公开内容的温度范围内之后添加，还原剂可以在加热步骤期间或之后通过常规技术(包括渗滤等)除去。在一个实施方案中，方法包括在步骤a)之后使组合物经受氧化条件以便重新形成抗体中的一个或多个二硫键的另一步骤。如果使用还原剂如亚磷酸，ddt，tcep或thp，则该实施方案可能是有益的。或者，方法不包括在步骤a)之后使组合物经受氧化条件的步骤。当使用包含单个硫醇基的还原剂例如谷胱甘肽，巯基乙醇(例如2-巯基乙醇)，巯基乙胺(例如2-巯基乙胺)和半胱氨酸(例如半胱氨酸-hcl)时，氧化步骤不是特别需要的。根据本公开内容的方法的另一个有益效果是抗体分子不被所采用的条件完全解折叠。也就是说，由解折叠引起的去活化被最小化，避免了再折叠抗体的需要。在其中抗体包含多个二硫键的一个实施方案中，并非抗体中的所有二硫键都被还原。因此，在分子例如所谓的fab-dsfv中，抗体分子的fab片段和fv中的链内二硫键不会被本发明的方法还原。β-mea对于fab-dsfv分子是特别有利的。还原剂的浓度通常的范围是1mm至100mm，例如10至90mm，例如30到90mm，60到90mm，70到90mm，70至80mm，80到90mm，30至50mm或20至50mm。在一个实施方案中，还原剂的浓度选自15mm，20mm，25mm，30mm，35mm，40mm，45mm，50mm，55mm，60mm，65mm，70mm，75mm，80mm，83mm，85mm，90mm和100mm。在一个实施方案中，还原剂在氨基酸(例如疏水性氨基酸，极性氨基酸或带电荷的氨基酸)存在下使用。不希望受到理论的束缚，认为氨基酸的存在起到在热转化步骤期间稳定重组抗体分子的分子结构的作用，从而保护防止热变性，从而提高总产率。在一个实施方案中，氨基酸选自精氨酸，赖氨酸，丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方案中，氨基酸的浓度在0.01至1.0m的范围内，例如0.01至0.8m，0.2至0.8m或0.7至0.8m。在一个实施方案中，氨基酸的浓度选自0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9m.在一个实施方案中，氨基酸是脯氨酸，丙氨酸或赖氨酸。在一个实施方案中，所用的脯氨酸、丙氨酸或赖氨酸的浓度在10mm至800mm范围内，例如20、55、110、280、555或777mm。在温度处于相关范围例如30至60℃，特别是本文所述的范围或特定温度之前或之后，可将氨基酸添加至重组抗体组合物中。在一个实施方案中，在温度升高至30至60℃的范围之前，将氨基酸添加到组合物中。在一个实施方案中，添加碱性盐，例如柠檬酸盐，硫酸盐或碳酸盐，如柠檬酸盐或硫酸盐。在一个实施方案中，保持温度在所需范围内的时间段为约1至70小时，例如2至60小时，如3至50小时，3至10小时，4至6小时，特别是4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或25小时。在一个实施方案中，热步骤是在伴随搅拌的情况下进行，例如，其中搅拌在100至1200rpm的范围内，例如100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100或1200rpm。在一个实施方案中，组合物中抗体的浓度为1.5g/l至5g/l，例如2g/l至4g/l，例如2g/l至3g/l。在一个实施方案中，方法不采用的氨基酸并且采用在范围1.5g/l至5g/l内的抗体分子浓度，其在约50℃温度下在50至90mm的还原剂如bmea或bme特别是bmea的存在下进行，持续约5小时。有利地，产率可以高达90％，其中60％或更多是单体。在本发明方法的一个实施方案中，使用以下反应条件：还原剂是bmea，氨基酸是赖氨酸，温度是50℃，时间是约5小时。在一个实施方案中，热转化步骤在50至90mm，例如50mm或75mm的还原剂如bmea或bme特别是bmea的存在下，在45至55℃，例如50℃的温度下进行，持续4至6小时，如5小时。在该实施方案中，抗体浓度优选在2至3g/l的范围内。在一个实施方案中，步骤a)在50℃的温度下进行5小时，并且在步骤b)中还原剂是bmea或bme，浓度为70-80mm，例如75mm。在该实施方案中，热转化步骤优选在以0.01-0.8m例如0.7-0.8m的浓度的选自脯氨酸、丙氨酸或赖氨酸的氨基酸的存在下进行。在本公开内容的方法的另一个实施方案中，在热转化步骤中使用以下反应条件：还原剂是浓度为75mm的bmea，氨基酸是浓度为0.7-0.8m的赖氨酸，温度为50℃，时间为约5小时，抗体浓度为2至3g/l，例如2.75g/l。有利地，产率可以高达82％，其中79％或更多是单体。如本文所用的抗体分子是指抗体(即完整抗体)或其结合片段。术语“抗体”涉及完全(完整)抗体，即包含两条重链和两条轻链的元件，包含完整抗体或其结合片段的分子。本文使用的结合片段是指包含一个，两个，三个或更多个结合位点的抗体样分子，其中所述分子不包含“完整抗体”的全长重链或轻链。在一个实施方案中，结合片段不包含ch2和/或ch3结构域。抗体的结合片段包括单链抗体(即全长重链和轻链)；fab，修饰的fab，fab'，修饰的fab'，f(ab')2，fv，fab-fv，fab-dsfv，单结构域抗体(例如vh或vl或vhh)，scfv，二、三或四价抗体，bis-scfv，双抗体(diabody)，三链抗体(triabody)，四链抗体(tetrabody)和任何上述的表位结合片段(参见例如holligerandhudson,2005,naturebiotech.23(9):1126-1136；adairandlawson,2005,drugdesignreviews-online2(3),209-217)，例如wo2009/040562中公开的fabfv形式以及wo2010/035012中公开的其二硫化物稳定的形式。如本文所用，术语“fab片段”是指包含含有vl(可变轻链)结构域和轻链的恒定结构域(cl)的轻链片段和重链的vh(可变重链)结构域和第一恒定结构域(ch1)的抗体片段。用于产生和制造抗体片段的方法在本领域是公知的(参见例如verma等人,1998,journalofimmunologicalmethods,216,165-181)。用于本公开内容的其它抗体片段包括wo2005/003169，wo2005/003170和wo2005/003171中所述的fab和fab'片段。典型的fab'分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区vh，恒定结构域ch1和铰链区，并且轻链包含可变区vl和恒定结构域cl。在一个实施方案中，提供了fab'的二聚体，例如二聚化可以通过铰链进行。在一个实施方案中，重组表达的抗体分子是多特异性抗体分子，例如双特异性或三特异性抗体。本文使用的“双特异性分子”是指具有两个抗原结合位点的分子，其可以结合相同或不同的抗原。本文使用的“三特异性分子”是指具有三个抗原结合位点的分子，其可以结合相同或不同的抗原。本文使用的“多特异性抗体”是指如本文所述的具有两个或更多个结合结构域，例如两个或三个结合结构域的抗体分子。在一个实施方案中，结构域全部结合相同的抗原，包括结合抗原上的相同表位或结合抗原上的不同表位。本文使用的“抗原结合位点”是指分子的一部分，其包含与靶抗原特异性相互作用的一对可变区，特别是同源对。除非上下文另外指出，否则结合位点、抗原结合位点、结合结构域、抗原结合结构域在本文中可互换使用。因此在一个实施方案中，抗体分子包含结合结构域。结合结构域通常包含6个cdr，三个来自重链，三个来自轻链。在一个实施方案中，来自每条链的3个cdr位于框架中并与该框架一起形成可变区。因此，在一个实施方案中，抗体分子包含对抗原具有特异性的包含轻链可变区和重链可变区的结合结构域。本文使用的活性片段与结合片段同义。本文使用的“特异性”是指仅识别其特异于的抗原的抗原结合位点或与对其非特异于的抗原的亲和力相比对其特异于的抗原具有显著更高的结合亲和力(例如5、6、7、8、9、10倍更高的结合亲和力)的结合位点。结合亲和力可以通过标准测定来测量，例如表面等离子体共振，如biacore。通常按照kabat等人设计的系统对抗体可变结构域中的残基进行编号。该系统在kabat等人,1987,insequencesofproteinsofimmunologicalinterest,usdepartmentofhealthandhumanservices,nih,usa(以下称为“kabat等人(同上)”)中示出。在本说明书中使用该编号系统，除非另有说明。kabat残基名称并不总是与氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可以包含比严格的kabat编号中更少或额外的氨基酸，其对应于基本可变结构域结构的结构组分(无论框架或互补决定区(cdr))缩短或插入。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”kabat编号序列进行比对，可以确定给定抗体的残基的正确kabat编号。根据kabat编号系统，重链可变结构域的cdr位于残基31-35(cdr-h1)，残基50-65(cdr-h2)和残基95-102(cdr-h3)。然而，根据chothia(chothia,c.andlesk,a.m.j.mol.biol.,196,901-917(1987))，等同于cdr-h1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另有说明，否则本文所用的“cdr-h1”旨在指残基26至35，如由kabat编号系统和chothia拓扑环定义的组合所描述的。根据kabat编号系统，轻链可变区的cdr位于残基24-34(cdr-l1)，残基50-56(cdr-l2)和残基89-97(cdr-l3)。在本发明的方法中，抗体包含对感兴趣的抗原具有特异性的至少一个fv(vh/vl对)，其中所述vh和vl通过一个或多个接头直接或间接连接并且通过其间的二硫键稳定。在一个实施方案中，抗体或其结合片段包含另外的二硫键，例如二硫化物是链间二硫键(例如重链和轻链之间)和/或其中两条重链之间的铰链区中的二硫键。在一个实施方案中，重组表达的抗体分子包含一个或多个，例如一个，两个，三个，四个，五个或六个二硫键。在一个实施方案中，二硫化物是天然存在的。在一个实施方案中，一个或多个二硫化物被设计为处于特定位置。在一个实施方案中，存在至少一个天然存在的二硫键和至少一个过程改造的二硫键。本文使用的过程改造的二硫键是指二硫键中的一个或两个硫是通过重组基因工程技术引入的情况。vh和vl之间的二硫键的位置不受限制。可变结构域中二硫键位置的实例包括但不限于选自以下的位置：-vh37+vl95c，参见例如proteinscience6，781-788zhu等人(1997)；-vh44+vl100，参见例如biochemistry335451-5459reiter等人(1994)；或journalofbiologicalchemistryvol.269no.28pp.18327-18331reiter等人(1994)；或proteinengineering,vol.10no.12pp.1453-1459rajagopal等人(1997)；-vh44+vl105，参见例如jbiochem.118,825-831luo等人(1995)；-vh45+vl87，参见例如proteinscience6,781-788zhu等人(1997)；-vh55+vl101，参见例如febsletters377135-139young等人(1995)；-vh100+vl50，参见例如biochemistry291362-1367glockshuber等人(1990)；-vh100b+vl49；-vh98+vl46，参见例如proteinscience6,781-788zhu等人(1997)；-vh101+vl46；-vh105+vl43，参见例如proc.natl.acad.sci.usavol.90pp.7538-7542brinkmann等人(1993)；或proteins19,35-47jung等人(1994),-vh106+vl57，参见例如febsletters377135-139young等人(1995)以及对应于其位于分子中的可变区对中的一个或多个位置。因此，在一个实施方案中，本发明的可变结构域对(vh/vl)可以通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，一个在vh中，另一个在vl中，其中半胱氨酸残基对的位置选自vh37和vl95，vh44和vl100，vh44和vl105，vh45和vl87，vh100和vl50，vh100b和vl49，vh98和vl46，vh101和vl46，vh105和vl43，以及vh106和vl57。在一个实施方案中，二硫键在位置vh44和vl100之间形成。上面列出的氨基酸对位于有利于被半胱氨酸置换的位置，使得可以形成二硫键。可以通过已知技术将半胱氨酸工程改造到这些期望的位置。因此，在一个实施方案中，根据本公开内容的工程改造的半胱氨酸是指其中给定氨基酸位置处的天然存在的残基已经被半胱氨酸残基取代的情况。工程改造的半胱氨酸的引入可以使用本领域已知的任何方法进行。这些方法包括但不限于pcr延伸重叠诱变，定点诱变或盒式诱变(一般参见sambrook等，sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharbourlaboratorypress,coldspringharbour,ny,1989；ausbel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishing&wiley-interscience,ny,1993)。定点诱变试剂盒可商购，例如，定点诱变试剂盒(stratagen，lajolla，ca)。盒式诱变可以基于wells等人，1985，gene，34：315-323进行。或者，可通过退火、连接和pcr扩增以及重叠寡核苷酸的克隆，通过全基因合成来制备突变体。通常，vh和vl对(其中vh和vl通过一个或多个接头间接或直接连接并通过其间的二硫键稳定)是的互补vh/vl对，其形成抗原结合位点并协作地结合抗原，即对同一抗原具有亲和性并与抗原协作地结合的互补vh/vl对。通常它们将是来自相同抗体的vh/vl对，例如由宿主在体内产生的抗体。如本文所用的协作地结合抗原是指可变区一起特异性结合靶抗原。在一个实施方案中，抗体包含至少一个fv，其中vh不在c端融合至重链恒定结构域ch1，且vl不在c端融合至轻链恒定区cl(cκ或cλ)。vh和vl结构域能够形成相互作用，其通过与其他抗体分子中的vh或vl结构域相互作用而导致多聚体形成。在fv中，vh和vl结构域可以通过接头彼此直接连接或通过接头间接连接至一个或多个另外的分子。vh和vl之间的连接“固定”或限定了给定的vh和vl对之间的关系，使得如果所述vh与另一分子中的vl配对，则形成多聚体，因为原始vh和vl之间的关系通过连接的存在而得到维持。相反，在其中vh和vl结构域不通过一个或多个接头连接的fv中，vh和vl结构域能够“分开(coming-apart)”(也称为呼吸(breathing))，并且当它们修复时，如果一个可变结构域不是来自原来的配对(但是与它所替代的原始可变区具有相同的序列)，那么分子将仅作为单体重新形成。在本发明中提及的接头优选不是二硫键。用于抗体的合适接头在本领域中是公知的。接头可以包含一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，接头是包含2至40个氨基酸，例如2至30、2至20或2至10个氨基酸的肽接头。肽接头的例子包括下面公开的那些。在一个实施方案中，接头选自序列39至90所示的序列。铰链接头序列seqidno:序列39dkthtcaa40dkthtcppcpa41dkthtcppcpatcppcpa42dkthtcppcpatcppcpatcppcpa43dkthtcppcpagkptlynslvmsdtagtcy44dkthtcppcpagkpthvnvsvvmaevdgtcy45dkthtccvecppcpa46dkthtcprcpepkscdtpppcprcpa47dkthtcpscpa柔性接头序列(s)在序列50到54中是任选的。刚性接头的例子包括肽序列gapapaapapa(seqidno：89)，pppp(seqidno：90)和ppp。在本发明的一个方面，fv包含通过单个接头直接连接的vh结构域和vl结构域。上面描述了用于直接连接vh结构域和vl结构域的合适的接头。在一个实施方案中，vh和vl形成二硫键稳定的单链可变片段，也称为dsscfv分子，其是具有在vh和vl可变结构域之间的肽接头和所述vh和vl之间的结构域间二硫键的单链可变片段。在该实施方案中，dsscfv分子可以与一个或多个另外的分子，优选第二抗体或其结合片段融合以形成二价、三价或四价抗体。dsscfv通过可位于vh结构域、vl结构域或vh和vl两者中的一个或多个接头与一个或多个另外的分子融合。例如，一个或多个dsscfv分子可以融合至整个抗体或其结合片段的一个或多个链的c端或n端。例如，两个或更多个dsscfv分子可以融合在一起以形成双抗体、串联scfv(bis-dsscfv)或微抗体。可能具有通过fv区多聚化倾向的抗体形式包括scfv，双抗体，串联scfv，串联scfv-fc，scfv-fc，scfv-fc-scfv，fab-scfv，scdiabody，scdiabody-fc，scdiabodych3，igg-scfv，scfv-igg，二合一igg(two-in-oneigg)，双v结构域igg，igg-v和v-ig。当在fv或scfv中使用二硫键以稳定这些构建体时，使用本发明的方法来提高所得单体的产率可能是有益的。在本发明的另一方面，vh和vl各自包含通过第二分子间接连接vh和vl的接头。在这个方面，vh结构域和vl结构域通过单独的接头连接到第二分子。上面描述了引用将每个可变结构域连接到第二分子的合适的接头。第二分子提供了vh和vl之间的间接连接。每个vl和vh在合适的位置与第二分子连接，以允许vh和vl结构域协作地结合靶抗原。vh结构域和vl结构域不通过肽键或肽接头彼此直接连接。在这方面，第二分子优选是形成二价，三价或四价抗体的第二抗体或其结合片段。在一个实施方案中，vh和vl结构域通过完整抗体或fab、修饰的fab、fab'、修饰的fab'或f(ab')2间接连接。例如，当第二抗体是fab时，vh结构域可以融合至重链恒定区如第二抗体的ch1的c端，并且vl单结构域抗体可以融合至第二抗体的轻链恒定区(cκ或cλ)的c末端，从而形成fab-dsfv。在wo2010/035012和wo2011/036460(两者均通过引用并入本文)中详细描述了fab-dsfv抗体。抗体可以包含其他结合结构域例如wo2011/117653中公开的二硫键稳定的dvd-ig分子或wo2011/030107中描述的所谓(fabfv)2fc，所述文献各自以引用的方式并入本文。因此，本文使用的抗体包括二价，三价或四价抗体。可以在本发明的方法中使用的其他合适的抗体形式描述于wo2011/030107，其公开了fabfvfc和(fabfv)2fc抗体，wo2011/061492，其公开了与peg缀合的fab-dsfv抗体，wo2011/086091，其公开了fab-dsfv-dsfv，这些专利申请的每一个通过引用并入本文，其中在fv或scfv中使用二硫键。wo2015/197772(其通过引用并入本文)中描述了可用于本发明方法中以提高单体产率的其它合适的抗体形式，其公开了包含以下或由以下组成的多特异性抗体分子：a)式(i)的多肽链：vh-ch1-x-v1；和b)式(ii)的多肽链：vl-cl-y-v2；其中：vh代表重链可变结构域；ch1表示重链恒定区的结构域，例如其结构域1；x代表键或连接基团；y代表键或连接基团；v1代表dsfv，sdab，scfv或dsscfv；vl代表轻链可变结构域；cl代表来自轻链恒定区的结构域，例如cκ；v2代表dsfv，sdab，scfv或dsscfv其中v1和v2中的至少一个是dsscfv。本文使用的“单链可变片段”或“scfv”是指包含重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)或由其组成的单链可变片段，所述重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)通过vh和vl可变结构域之间的肽接头稳定。vh和vl可变结构域可以处于任何合适的取向，例如vh的c末端可以连接到vl的n末端，或者vl的c末端可以连接到vh的n末端。本文使用的“二硫键稳定的单链可变片段”或“dsscfv”是指通过vh和vl可变结构域之间的肽接头稳定并且还包括vh和vl之间的结构域间二硫键的单链可变片段。如本文所用的“二硫键稳定的可变片段”或“dsfv”是指单链可变片段，其不包含vh和vl可变结构域之间的肽接头，而是通过vh和vl之间的结构域间二硫键稳定。本文使用的“单结构域抗体”或“sdab”是指由单个单体可变抗体结构域如vh或vl或vhh组成的抗体片段。图28中显示了示例性抗体形式。在一个实施方案中，v1和v2都是dsscfv，并且这种抗体形式在本文中也可以被称为fab-2xdcfv。vh和vl可变结构域可以处于任何合适的取向，例如vh的c末端可以连接到vl的n末端，或者vl的c末端可以连接到vh的n末端。在wo2013/068571的实施例4中描述了可用于本发明方法中以提高单体产率的其它合适的抗体形式，其公开了fab-dsscfv抗体形式。图29中显示了示例抗体形式。在一个实施方案中，抗体不包含ch2和/或ch3结构域。在一个实施方案中，抗体片段是所谓的fab-dsfv形式，例如如wo2010/035012和wo2011/036460中公开的，其各自通过引用并入本文。在一个实施方案中，抗体是wo2011/117648中公开的二硫键稳定的fab。在一个实施方案中，抗体不是wo2011/117648中公开的二硫键稳定的fab。在一个实施方案中，抗体包含对ox40特异的结合结构域。在一个实施方案中，抗体包含对血清白蛋白特异的结合结构域。在一个实施方案中，抗体包含对ox40特异的结合结构域和对血清白蛋白特异的结合结构域，特别是fab-dsfv形式，例如其中血清白蛋白结合结构域是fv部分，特别是通过引用并入本文的w02013/068563中公开的对ox40和人血清白蛋白特异的双特异性构建体。本公开内容提供了结合人ox40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，其包含：重链，其从n-末端开始依次包含第一重链可变结构域(vh1)，ch1结构域和第二重链可变结构域(vh2)，轻链，其从n-末端开始依次包含第一轻链可变结构域(vl1)，cl结构域和第二轻链可变结构域(vl2)，其中所述重链和轻链排列成使得vh1和vl1形成第一抗原结合位点并且vh2和vl2形成第二抗原结合位点，其中由第一抗原结合位点结合的抗原是人ox40，由第二抗原结合位点结合的抗原是人血清白蛋白，特别是其中重链的第一可变结构域(vh1)包含seqidno：1中给出的cdr-h1的序列，seqidno：2中给出的cdr-h2的序列和seqidno：3中给出的cdr-h3的序列，并且所述轻链的第一个可变结构域(vl1)包含seqidno：4中给出的cdr-l1的序列，seqidno：5中给出的cdr-l2的序列和seqidno：6中给出的cdr-l3的序列，其中所述第二重链可变结构域(vh2)具有seqidno：11中给出的序列，并且所述第二轻链可变结构域(vl2)具有seqidno：12中给出的序列和第二重链可变结构域(vh2)和第二轻链可变结构域(vl2)通过二硫键连接。在一个实施方案中，在ch1结构域和第二重链可变结构域(vh2)之间存在肽接头。在一个实施方案中，在cl结构域和第二轻链可变结构域(vl1)之间存在肽接头。在一个实施方案中，第一重链可变结构域(vh1)包含seqidno：8中给出的序列。在一个实施方案中，第一轻链可变结构域(vl1)包含seqidno：7中给出的序列。在一个实施方案中，重链包含seqidno：15中给出的序列或由其组成。在一个实施方案中，轻链包含seqidno：16中给出的序列或由其组成。在一个实施方案中，抗体分子包含血清白蛋白结合结构域，例如包含来自seqidno：29或30中所示可变区的一个，两个或三个重链cdr，以及来自seqidno：31或32中所示可变区的一个，两个或三个轻链cdr，特别是来自seqidno：29或30所示可变区的三个重链cdr，如针对cdrh1的cdrh1，针对cdh2的cdrh2，针对cdh3的cdrh3，和来自seqidno：31或32所示的可变区的三个轻链cdr，例如针对cdrl1的cdrl1，针对cdl2的cdrl2，针对cdl3的cdrl3。在一个实施方案中，抗体分子包含seqidno：30中所示的重链可变区。在一个实施方案中，抗体分子包含seqidno：32中所示的轻链可变区。在一个实施方案中，抗体分子包含seqidno：30中显示的重链可变区和seqidno：32中所示的轻链可变区。在一个实施方案中，重链包含seqidno：15或19或由其组成。在一个实施方案中，轻链包含seqidno：16或20或由其组成。在一个实施方案中，结合片段抗体分子包含seqidno：15和16、15和20、16和19或19和20。因此在一个实施方案中，提供了结合人ox40和人血清白蛋白的双特异性抗体融合蛋白，其具有包含seqidno：15中给出的序列的重链和包含seqidno：16中给出的序列的轻链。在一个实施方案中，抗体分子(例如fab-dsfv形式)是wo2014/019727中公开的抗体分子，其通过引用并入本文。在一个实施方案中，抗体分子包含对人血清白蛋白特异的结合结构域，特别是具有公开于wo2013/068571(在此引入作为参考)中的cdr或可变区。在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体或片段是单克隆的。单克隆抗体可通过本领域已知的任何方法制备，如杂交瘤技术(kohler&milstein，nature，1975、256、495-497)，三源杂交瘤技术，人b细胞杂交瘤技术(kozbor等人,immunologytoday,1983,4,72)和ebv-杂交瘤技术(cole等人,“monoclonalantibodiesandcancertherapy”,pp.77-96,alanr.liss,inc.,1985)。本发明方法中使用的抗体分子还可以使用单淋巴细胞抗体方法，通过克隆和表达由选择用于产生特异性抗体的单个淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cdna，通过例如babcook,j.等人,proc.natl.acad.sci.usa,1996,93(15),7843-7848,wo92/02551,wo2004/051268andwo2004/106377中描述的方法产生。人源化抗体分子是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(cdr)和任选地包含来自非人物种的一个或多个供体残基的来自人免疫球蛋白分子的框架区(例如参见us5,585,089)。在一个实施方案中，经历本公开内容方法的抗体或结合片段是人源化的。本发明方法中采用的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生，包括由brinkman等人,j.immunol.methods,1995,182,41-50；ames等人,j.immunol.methods,1995,184,177-186；kettleborough等人eur.j.immunol.,1994,24,952-958；persic等人,gene,1997187,9-18；和burton等人,advancesinimmunology,1994,57,191-280；wo90/02809；wo91/10737；wo92/01047；wo92/18619；wo93/11236；wo95/15982；和wo95/20401；和us5,698,426；us5,223,409；us5,403,484；us5,580,717；us5,427,908；us5,750,753；us5,821,047；us5,571,698；us5,427,908；us5,516,637；us5,780,225；us5,658,727；us5,733,743；和us5,969,108公开的那些。转基因小鼠或其他生物体，包括其他哺乳动物，也可用于产生人源化抗体，例如使用噬菌体技术。完全人抗体是这样的抗体，其中重链和轻链的可变区和恒定区(如果存在的话)都是人来源的，或者基本上与人源的序列相同，不一定来自相同的抗体。完全人抗体的实例可以包括例如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和通过其中鼠免疫球蛋白可变区和/或恒定区基因已被它们的人对应物替代的小鼠产生的抗体，例如如在ep0546073,us5,545,806,us5,569,825,us5,625,126,us5,633,425,us5,661,016,us5,770,429,ep0438474和ep0463151中概括地描述的。用于本发明方法的抗体材料可以通过使用涉及编码抗体可变区和恒定区的dna的操作和重新表达的重组dna技术来制备。标准分子生物学技术可用于根据需要修饰、添加或缺失氨基酸或结构域。如本文所用，术语“可变”和“恒定”区还包含对可变区或恒定区的任何改变。抗体起始材料可以从任何物种获得，包括例如小鼠，大鼠，兔，仓鼠，骆驼，美洲驼，山羊或人。抗体的部分可以从多于一种的物种获得，例如抗体可以是嵌合的。在一个例子中，恒定区来自一个物种，而可变区来自另一个物种。抗体起始材料也可以被修饰。在另一个实例中，使用重组dna工程技术产生抗体的可变区。这样的工程改造的形式包括例如通过天然抗体的氨基酸序列的插入、缺失或改变从天然抗体可变区产生的那些。这种类型的具体实例包括那些工程改造的可变区结构域，其包含至少一个cdr和任选地来自一种抗体的一个或多个框架氨基酸和来自第二抗体的可变区结构域的剩余部分。用于产生和制造这些抗体的方法在本领域是公知的(参见例如boss等人,us4,816,397；cabilly等人,us6,331,415；shrader等人,wo92/02551；ward等人,1989,nature,341,544；orlandi等人,1989,proc.natl.acad.sci.usa,86,3833；riechmann等人,1988,nature,322,323；birdetal,1988,science,242,423；queen等人,us5,585,089；adair,wo91/09967；mountainandadair,1992,biotechnol.genet.eng.rev,10,1-142；verma等人,1998,journalofimmunologicalmethods,216,165-181)。在一个实施方案中，抗体包含形成结合结构域的可变结构域对作为同源对。如本文中使用的同源对旨在表示天然的一对可变结构域，即是从单个抗体或抗体表达细胞分离的。可变结构域可能已被优化和/或人源化。来自同源对的经优化/人源化的可变结构域在优化/人源化之后仍然被认为是同源对。因此，本公开内容延伸至使人、人源化或嵌合抗体分子经历本文公开的方法。抗体可以对任何靶抗原具有特异性。抗原可以是细胞相关蛋白，例如在细胞如细菌细胞，酵母细胞，t细胞，内皮细胞或肿瘤细胞上的细胞表面蛋白，或者它可以是可溶性蛋白。感兴趣的抗原也可以是任何医学上相关的蛋白质，例如疾病或感染期间上调的那些蛋白质，例如受体和/或其相应的配体。细胞表面蛋白质的具体例子包括粘附分子，例如整联蛋白例如β1整联蛋白例如vla-4，e-选择素，p选择素或l-选择素，cd2,cd3,cd4,cd5,cd7,cd8,cd11a,cd11b,cd18,cd19,cd20,cd23,cd25,cd33,cd38,cd40,cd40l,cd45,cdw52,cd69,cd134(ox40),icos,bcmp7,cd137,cd27l,cdcp1,csf1或csf1受体，dpcr1，dpcr1，dudulin2，flj20584,flj40787,hek2,kiaa0634,kiaa0659,kiaa1246,kiaa1455,ltbp2,ltk,mal2,mrp2，结合素样2,nkcc1,ptk7,raig1,tcam1,sc6,bcmp101,bcmp84,bcmp11,dtd，癌胚抗原(cea)，人乳脂肪球蛋白(hmfg1和2)，mhci类和mhcii类抗原，kdr和vegf，pd-1，dc-sign，tl1a，dr3，il-7受体a以及合适的话其受体。可溶性抗原包括白介素如il-1,il-2,il-3,il-4,il-5,il-6,il-8,il-12,il-13,il-14,il-16或il-17，诸如il17a和/或il17f，病毒抗原，例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原，免疫球蛋白，诸如ige，干扰素，诸如干扰素α，干扰素β或干扰素γ，肿瘤坏死因子tnf(以前称为肿瘤tnf-α并且在本文称为tnf或tnf-α)，肿瘤坏死因子-β，集落刺激因子如g-csf或gm-csf，以及血小板衍生的生长因子如pdgf-α和pdgf-β，wisp-1和适当的情况下其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原，细菌毒素，病毒如流感病毒，ebv，hepa，b和c，生物恐怖剂，放射性核素和重金属以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。在一个实施方案中，方法包括将抗体分子纯化至适合施用于人的标准并随后将其进行制备的步骤。使用本文所述的方法纯化的抗体分子具有高的结合亲和力(特别是纳摩尔或皮摩尔)。亲和力可以使用本领域已知的任何合适的方法测量，包括biacoretm。在一个实施方案中，抗体或结合片段具有约100pm或更好的结合亲和力，例如约50pm或更好，如约40pm或更好，特别是30pm或更好。在一个实施方案中，抗体或结合片段是完全人或人源化的，并具有约100pm或更好的结合亲和力。本文使用的天然存在的结构域的衍生物旨在指天然存在的序列中的1、2、3、4或5个氨基酸已被置换或缺失，例如以优化该结构域的性质，例如通过消除不希望的特性，但是其中结构域的特征(一个或多个)被保留。本领域技术人员还将理解抗体可经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达分子的宿主细胞系以及培养条件。这种修饰可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺化中的变化。常见的修饰是由于羧肽酶的作用而丧失羧基末端碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)(如harris，rj，journalofchromatography705：129-134，1995中所述)。这些翻译后变化可以影响分子的性质，从而影响下游处理。在一个实施方案中，用于本公开内容的方法中的抗体组合物不包含乙酸钠，例如浓度为25mm的乙酸钠。在一个实施方案中，用于本公开内容的方法中的抗体组合物不包含氯化钠，例如25mm浓度的氯化钠。疏水性氨基酸的例子包括丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，如丙氨酸，脯氨酸或甘氨酸。极性氨基酸的例子包括天冬酰胺，组氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸和色氨酸，如丝氨酸。带电氨基酸的例子包括精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸和谷氨酸，如精氨酸或赖氨酸，特别是赖氨酸。柠檬酸盐的实例包括钠，钾，钙和镁，如钠或钾，特别是钠。硫酸盐的实例包括铵，钙和镁，如铵。碳酸盐(包括碳酸氢盐)的实例包括钠，钾，钙，镁及其相应的碳酸氢盐形式。在一个实施方案中，盐浓度为0.5至5mm，如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5mm。在一个实施方案中，硫酸铵的浓度为4mm。在一个实施方案中，柠檬酸钠的浓度为1.5mm。在一个实施方案中，根据本公开内容的热转化步骤在澄清的上清液上进行。上清液可通过任何合适的手段澄清，例如离心，过滤等。在一个实施方案中，使用0.22微米过滤来澄清上清液。在一个实施方案中，在热转化步骤之前，在上清液上进行蛋白a色谱的步骤。在本文公开的抗体分子的类型(特别是不包含ch2ch3结构域的那些)的情况下，蛋白a纯化是特别有利的，因为该技术允许分辨多聚体与单体。可以使用蛋白质a色谱法来回收不含单体形式的fc区的含有人vh3结构域的抗体。在人vh3结构域和蛋白质a的结合之间已经观察到亲合力效应。鉴于尚未描述fc区与蛋白质a之间的相互作用，这个发现是令人惊讶的，并且允许从含有抗体的单体和多聚体形式的混合物回收单体的含有人vh3结构域的抗体。因此，蛋白a纯化的步骤可以包括a)在允许所述抗体与蛋白质a结合的条件下将包含单体和多聚体形式的含有人vh3结构域的抗体的混合物施加至蛋白a色谱材料，其中所述蛋白a包含结构域d和/或e，和b)回收单体形式的含有人vh3结构域的抗体，其中所述含人vh3结构域的抗体不含有fc区。或者，蛋白a纯化的步骤包括a)将包含单体和多聚体形式的含人vh3结构域的抗体的混合物施加至蛋白a色谱材料，其中所述蛋白a包含结构域d和/或e，b)允许所述抗体与蛋白质a结合，c)施加选择性破坏单体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液，d)回收所得的洗脱液，和任选地e)施加第二洗脱缓冲液，其破坏多聚体形式的抗体的结合，并回收该第二洗脱液，其中所述含有人vh3结构域的抗体不含有fc区。在一个实施方案中，其中所述抗体是wo2013/068563中公开的对ox40和人血清白蛋白特异的抗体a26fab-645dsfv，如上所述进行蛋白a纯化，其中在步骤c)中，洗脱缓冲液的ph为3.5至ph4.2，优选ph3.6至ph4.1，ph3.7至ph4.0，优选ph3.8至ph3.9或ph3，以破坏单体的结合，并且在任选的步骤e)中，洗脱缓冲液具有低于3.5的ph，优选低于ph3.4的ph，优选ph2.8至ph3.2，优选ph2.9至ph3.1，优选ph3.0，其破坏多聚体形式的抗体的结合。或者，蛋白a纯化的步骤包括a)将包含单体和多聚体形式的含人vh3结构域抗体的混合物施加至蛋白a色谱材料，其中所述蛋白a包含结构域d和/或e，b)允许单体形式的抗体的结合，c)回收流通液中单体形式的抗体，和任选地d)施加选择性破坏多聚体形式的抗体的结合的洗脱缓冲液，和e)回收由d)产生的洗脱液；其中所述含有人vh3结构域的抗体不含有fc区。在另一个实施方案中，在热转化步骤之前不进行蛋白a色谱。在一个实施方案中，方法包括进一步的下游处理步骤。在一个实施方案中，方法包括下游纯化的另一步骤，例如下游处理包括色谱步骤，例如疏水相互作用色谱或离子交换色谱。本文采用的下游处理步骤是指在步骤a)之后采用的至少一个步骤用于进一步纯化抗体。下游处理的实例包括一个或多个色谱步骤，例如尺寸排阻色谱，离子交换色谱(如阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)，疏水相互作用色谱，亲和色谱如蛋白-a色谱(如mabselect柱)。用于下游处理多肽和蛋白质的技术是本领域技术人员所熟知的。在一个实施方案中，下游处理包括至少一个色谱步骤，特别是离子交换色谱。在一个实施方案中，方法包括阴离子交换色谱步骤，然后是阳离子交换色谱步骤，反之亦然。在一个实施方案中，采用疏水作用色谱法。在一个实施方案中采用混合模式色谱法。在一个实施方案中，采用多个色谱步骤。在一个实施方案中，方法包括病毒灭活步骤，例如将含有蛋白质的组合物保持在确定的ph，例如低ph，持续确定的时期。在一个实施方案中，最后的下游处理步骤是渗滤步骤和缓冲液交换以提供蛋白质的最终储存缓冲液和浓度。在一个实施方案中，在热转化步骤之后的下游处理包括如上所述的在热转化步骤之前蛋白a(例如mabselect柱)纯化。在一个实施方案中，下游处理还包括病毒灭活步骤，接着进行超滤和缓冲液交换，接着进行阴离子交换色谱，随后进行阳离子交换色谱和病毒过滤步骤。在一个实施方案中，热转化步骤之后的下游处理包括病毒灭活步骤，随后进行超滤和缓冲液交换，接着进行阴离子交换色谱和随后的阳离子交换色谱和病毒过滤步骤。在一个实施方案中，下游处理还包括病毒灭活步骤，随后进行超滤和缓冲液交换，接着进行阳离子交换色谱，随后进行阴离子交换色谱和病毒过滤步骤。在一个实施方案中，热转化步骤之后的下游处理包括病毒灭活步骤，然后进行超滤和缓冲液交换，接着进行阳离子交换色谱和随后的阴离子交换色谱和病毒过滤步骤。其他下游处理步骤包括疏水相互作用色谱法(hic)或混合模式色谱法。在一个实施方案中，最后的下游处理步骤是渗滤步骤和缓冲液交换以提供蛋白质的最终储存缓冲液和浓度。在一个实施方案中，本文公开的方法提供将纯化的单体抗体分子缀合至一种或多种效应物分子的其它步骤。效应物分子可包含单个效应物分子或两个或更多个这样的分子(其被连接以形成可连接至抗体分子的单个部分)。如果期望获得连接至效应物分子的抗体，则此可通过标准化学或重组dna程序来制备，其中抗体直接或经由偶合试剂连接至效应物分子。用于将这样的将效应物分子缀合至抗体的技术已为本领域所熟知(参见hellstrom等人，controlleddrugdelivery，第2版，robinson等人编辑，1987，第623-53页；thorpe等人，1982,immunol.rev.,62：119-58和dubowchik等人，1999,pharmacologyandtherapeutics,83,67-123)。特定化学程序包括例如描述于wo93/06231、wo92/22583、wo89/00195、wo89/01476和wo03/031581中的那些。或者，如果效应物分子是蛋白质或多肽，则可使用重组dna程序(例如如wo86/01533和ep0392745中所述的)获得连接。如本文中所用的术语效应物分子包括例如抗瘤剂、药物、毒素、生物活性蛋白质(例如酶)、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段(例如dna、rna和其片段)、放射性核素(特别是放射性碘化物)、放射性同位素、螯合金属、纳米粒子和报告基团(例如荧光化合物或可通过nmr或esr光谱检测的化合物)。效应物分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂。实例包括考布他汀(combrestatin)、多拉司他汀(dolastatin)、埃博霉素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、类美登素(maytansinoid)、海绵抑制素(spongistatin)、利索新(rhizoxin)、软海绵素(halichondrins)、根霉素(roridins)、哈米特林(hemiasterlins)、紫杉醇(taxol)、细胞松弛素b(cytochalasinb)、短杆菌素d(gramicidind)、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素d(actinomycind)、1-去氢睪固酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、和嘌呤霉素(puromycin)和其类似物或同系物。效应物分子还包括(但不限于)抗代谢物(例如氨甲喋呤(methotrexate)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺(decarbazine))、烷基化剂(例如甲基二氯乙基胺、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(bsnu)和洛莫司汀(lomustine)(ccnu)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链佐霉素(streptozotocin)、丝裂霉素c(mitomycinc)和顺式-二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类(例如道诺霉素(daunorubicin)(先前称作道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素(dactinomycin)(先前称作放线菌素actinomycin)、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素(anthramycin)(amc)、卡奇霉素(calicheamicin)或多卡米星(duocarmycin))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。其他效应物分子可包括螯合放射性核素，例如111in和90y、lu177、铋213、锎252、铱192和钨188/铼188；或药物，例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶i抑制剂、类紫杉醇(taxoid)和苏拉明(suramin)。其他效应物分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括(但不限于)免疫球蛋白、毒素(例如相思子素(abrin)、蓖麻毒蛋白a(ricina)、假单胞菌属(pseudomonas)外毒素或白喉(diphtheria)毒素)、蛋白质(例如胰岛素)、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子或组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、血栓剂或抗血管生成剂(例如血管抑素或内皮抑素)、或生物反应调节剂例如淋巴因子、介白素-1(il-1)、介白素-2(il-2)、颗粒球巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)、颗粒球群落刺激因子(g-csf)、神经生长因子(ngf)或其他生长因子和免疫球蛋白。其他效应物分子可包括可用于例如诊断的可检测的物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)和非放射性顺磁性金属离子。关于可缀合至抗体用作诊断的金属离子，通常参见us4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰基胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光材料包括伞形酮(umbelliferone)、荧光黄(fluorescein)、荧光黄异硫氰酸酯、玫瑰红(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光黄、丹磺酰氯(dansylchloride)和藻红素(phycoerythrin)；合适发光材料包括发光胺(luminol)；合适的生物发光材料包括荧光素酶、荧光素和水母素(aequorin)；且合适的放射性核素包括125i、131i、111in和99tc。在另一实例中，效应物分子可增加抗体的体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体横跨上皮障壁至免疫系统的递送。此类型的合适效应物分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如描述于wo05/117984中的那些。如果效应物分子是聚合物，则其通常可为合成或天然存在的聚合物，例如任选经取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物或具支链或无支链多糖(例如均-或杂-多糖)。可存在于上文所提及的合成聚合物上的具体可选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具体实例包括任选经取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其任选经取代的聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。如本文中所用“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如硫醇选择性反应基团，例如马来酰亚胺和诸如此类。反应基团可直接或经由接头区段连接至聚合物。应理解，在一些情况下，这样的基团的残基作为本公开内容的抗体与聚合物之间的连接基团形成产物的部分。可视需要改变聚合物的大小，但其通常将在500da至50000da、例如5000da至40000da、例如20000da至40000da的平均分子量范围内。具体而言，可基于产物的预期用途(例如定位至某些组织(例如肿瘤)或延长循环半衰期的能力)选择聚合物大小(关于综述，参见chapman,2002,advanceddrugdeliveryreviews,54,531-545)。因此，例如，如果产物意欲离开循环并穿透组织例如用于治疗肿瘤，则可有利地使用例如具有约5000da的分子量的小分子量聚合物。对于产物保留在循环中的应用，可有利地使用例如具有20000da至40000da范围内的分子量的较高分子量聚合物。合适聚合物包括聚亚烷基聚合物，例如聚(乙二醇)或特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且特别是分子量在约15000da至约40000da范围内。在一个实例中，用于本发明中的抗体附接至聚(乙二醇)(peg)部分。在一个特定实例中，peg分子可经由位于抗体中的任何可用氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离氨基、亚氨基、硫醇、羟基或羧基)附接。这样的氨基酸可在抗体中天然存在或可使用重组dna方法经改造至抗体中(例如，参见us5,219,996；us5,667,425；wo98/25971)。在一个实例中，本发明的分子是经修饰的抗体，其中修饰是向其重链的c-末端添加一个或多个氨基酸以允许附接效应物分子。可使用多个位点以附接两个或更多个peg分子。在一个实施方案中，peg分子连接至轻链中的半胱氨酸171，例如参见通过引用并入本文的wo2008/038024。合适地，peg分子经由至少一个位于抗体中的半胱氨酸残基的硫醇基团共价连接。附接至经修饰的抗体的各聚合物分子可共价连接至位于抗体中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键联通常将为二硫键或特别是硫-碳键。如果使用硫醇基团作为附接点，则可使用适当活化的效应物分子(例如硫醇选择性衍生物，例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物)。活化的聚合物可在如上文所述的聚合物修饰的抗体的制备中用作起始材料。活化的聚合物可为含有硫醇反应基团(例如α-卤基羧酸或酯(例如碘乙酰胺)、酰亚胺(例如马来酰亚胺)、乙烯基砜或二硫化物)的任何聚合物。这样的起始材料可商业获得(例如来自nektar，先前称作shearwaterpolymersinc.,huntsville,al,usa)或可从市售起始材料使用常规化学程序来制备。特定的peg分子包括20k甲氧基-peg-胺(可从nektar(先前称作shearwater)、rapppolymere和sunbio获得)和m-peg-spa(可从nektar(先前称作shearwater)获得)。在一个实施方案中，方法包括配制抗体或结合片段包括其缀合形式作为适合用于人类的药物制剂的进一步步骤。因此，本公开内容还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法步骤，所述方法包括添加并混合由本公开内容的方法获得的抗体分子以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。抗体分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴随着其它活性成分，包括其它抗体成分，例如抗tnf，抗il-1β，抗t细胞，抗ifnγ或抗lps抗体或非抗体成分如黄嘌呤。其他合适的活性成分包括能够诱导耐受的抗体，例如抗cd3或抗cd4抗体。在进一步的实施方案中，根据本公开内容的抗体分子或组合物与另外的药学活性剂例如皮质类固醇(例如丙酸氟替卡松酯(fluticasonasepropionate))和/或β-2-激动剂(例如沙丁胺醇，沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖抑制剂(如雷帕霉素，环磷酰胺，甲氨蝶呤)或可选的cd28和/或cd40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂是小分子。在另一个实施方案中，抑制剂是特异于靶的抗体。药物组合物合适地包含治疗有效量的抗体分子。如本文中所用术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防靶向的疾病或病况或展现可检测的治疗或预防效应所需的治疗剂的量。可最初在细胞培养分析中或在动物模型中、通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估计治疗有效量。动物模型还可用于测定适当浓度范围和施用途径。随后可使用此等信息来确定人中的可用施用剂量和途径。人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、重量和性别、饮食，施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗法的耐受性/反应。这样的量可通过常规实验测定且在临床医师的判断内。通常，治疗有效量将为0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。药物组合物可以以每剂量含有预定量的本发明的活性试剂的单位剂型方便地呈现。组合物可单独地施用至患者或可与其他药剂、药物或激素组合(例如，同时、依序或分开)施用。抗体分子施用的剂量取决于待治疗的病状的性质，例如存在的疾病/炎症的程度，以及取决于该分子是否被预防性使用或用于治疗现有病状。剂量的频率将取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体具有短的半衰期(例如2-10小时)，则可能需要每天给予一个或多个剂量。或者，如果抗体具有较长的半衰期(例如2至15天)，则可能仅需要每天一次，每周一次或者甚至每1或2个月一次给予剂量。药学上可接受的载剂自身不应诱发对接受组合物的受试者有害的抗体的产生且不应有毒。合适载剂可为大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒粒子。可使用药学上可接受的盐，例如矿物酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐)或有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐)。治疗组合物中的药学上可接受的载剂可另外含有液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这样的组合物中可存在辅助物质(例如润湿或乳化剂或ph缓冲物质)。这样的载剂使得能够将药物组合物配制成锭剂、丸剂、糖衣锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液以用于由患者摄入。适于施用的形式包括适于肠胃外施用、例如通过注射或输注、例如通过推注注射或连续输注的形式。如果产物用于注射或输注，则其可采用油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液形式且其可含有配制剂，例如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，本公开内容的分子可呈干燥形式，其用于在使用之前用适当无菌液体重构。一旦配制，可将本发明的组合物直接施用至受试者。待治疗的受试者可为动物。然而，在一个或多个实施方案中，组合物适于施用至人受试者。合适地，在本发明的配制剂中，最终配制剂的ph与抗体的等电点的值并不相似，例如如果制剂的ph为7，则8-9或更高的pi可为适当的。尽管不希望受限于理论，但据信此可最终提供具有改良稳定性的最终配制剂，例如抗体保留于溶液中。本公开内容的药物组合物可通过任何多种途径施用，包括但不限于经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、室内、经皮、透皮(例如，参见wo98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。还可使用皮下注射器以施用本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可制备为可注射物，呈液体溶液或悬浮液形式。还可制备适于在注射之前在液体媒剂中制成溶液或悬浮液的固体形式。组合物的直接递送通常将通过注射、皮下、腹膜内、静脉内或肌内完成，或递送至组织之间质间隙。组合物还可施用至病灶中。剂量治疗可为单一剂量时间表或多个剂量时间表。应理解，组合物中的活性成分将为抗体分子。因此，其将在胃肠道中易于降解。因此，如果组合物欲通过使用胃肠道的途径施用，则组合物将需要含有保护抗体分子免于降解但在自胃肠道吸收后释放抗体的试剂。药学上可接受的载剂的全面论述可见于remington’spharmaceuticalsciences(mackpublishingcompany,n.j.1991)中。在一个实施方案中，配制剂以用于局部施用(包括吸入)的配制剂形式提供。合适的可吸入制剂包括可吸入粉末、含有推进剂气体的计量气溶胶或不含推进剂气体的可吸入溶液。含有活性物质的本公开内容的可吸入粉末可仅由上文所提及活性物质组成，或由上文所提及活性物质与生理学上可接受的赋形剂的混合物组成。这样的可吸入粉末可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这样的物质与另一物质的混合物。合适地使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别是(但并非排他性的)呈其水合物形式。沉积于肺中的粒子要求粒径小于10微米，例如1-9微米，例如0.1至5μm，特别是1至5μm。活性成分(例如抗体)的粒径具有首要的重要性。可用于制备可吸入气溶胶的推进剂气体已为本领域所知。合适的推进剂气体选自烃(例如正丙烷、正丁烷或异丁烷)和卤代烃(例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物)。上文提及的推进剂气体可单独使用或以其混合物使用。尤其合适的推进剂气体选自tg11、tg12、tg134a和tg227的卤化烷烃衍生物。在上文所提及的卤化烃中，tg134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和tg227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)和其混合物尤其合适。含有推进剂气体的可吸入气溶胶还可含有其他成分，例如共溶剂、稳定剂、表面活性剂、抗氧化剂、润滑剂和用于调节ph的试剂。所有这样的成分均为本领域所知。本发明含有推进剂气体的可吸入气溶胶可含有高达5重量％的活性物质。本发明的气溶胶含有例如0.002重量％至5重量％、0.01重量％至3重量％、0.015重量％至2重量％、0.1重量％至2重量％、0.5重量％至2重量％或0.5重量％至1重量％的活性成分。或者，局部施用至肺还可通过施用液体溶液或悬浮液配制剂例如采用装置(例如雾化器，例如连接至压缩器的雾化器，例如连接至parimaster(r)压缩器的parilc-jetplus(r)雾化器，由parirespiratoryequipment,inc.,richmond,va.制造)来完成。从本文所述的方法获得的抗体或结合片段可例如以溶液或悬浮液形式递送、分散于溶剂中。其可悬浮于适当生理溶液(例如，盐水或其他药理上可接受的溶剂或缓冲溶液)中。本领域已知的缓冲溶液可含有0.05mg至0.15mg依地酸二钠(disodiumedetate)、8.0mg至9.0mgnacl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠/1ml水，以便获得约4.0至5.0的ph。悬浮液可采用例如冻干分子。治疗性悬浮液或溶液配制剂还可含有一种或多种赋形剂。赋形剂为本领域熟知且包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、edta、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。溶液或悬浮液可囊封于脂质体或生物可降解微球体中。配制剂通常将采用无菌制造方法以实质上无菌形式来提供。此可包括通过本领域技术人员熟悉的那些方法进行以下过程来产生和灭菌：过滤用于配制的经缓冲的溶剂/溶液，将分子无菌悬浮于无菌缓冲溶剂的溶液中，和将配制剂分配至无菌贮器中。本发明的可喷雾配制剂可以以例如包装于箔包封中的单一剂量单元(例如，密封塑料容器或小瓶)形式提供。每一小瓶含有例如2ml的体积的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。在本说明书的上下文中的“包含”意指包括。在本发明的技术上合适的实施方案可以被组合。本文的任何正面叙述的实施方案可以用作否定负面放弃的基础。现在将参考以下实施例来描述本发明，这些实施例仅仅是说明性的而不应以任何方式被解释为限制本发明的范围。实施例1：蛋白质-a纯化的fab-dsfv多聚体种类的热转化a26fab-dsfv的cho表达和澄清结合人ox40和血清白蛋白的具有轻链序列a26fab轻链-(3xg4s)-645dsfv(gl4)(seqidno：16)和重链序列a26fab重链-(g4s，g4t，g4s)-645dsfv(gh5)(seqidno：15)的的构建体在稳定的二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(chodg44)中表达。这是通过使用nuclefector(lonza)按照制造商的说明用含有作为选择性标记的dhfr基因和编码产物的基因的质粒载体转染产生的。在缺乏次黄嘌呤和胸苷的培养基中，在dhfr抑制剂甲氨蝶呤的存在下，选择转染的细胞。在整个接种阶段，在含有20nm甲氨蝶呤的培养基中培养细胞系。然后在没有甲氨蝶呤的情况下培养细胞。对于最后的培养步骤，将细胞在不含甲氨蝶呤的培养基中在80l不锈钢生物反应器中培养14天。上清液的澄清通过离心(室温4000xg，60分钟)然后深度和无菌过滤进行。哺乳动物表达的a26fab-645dsfv的蛋白质a纯化将澄清的cho上清液施加至在delbeccos磷酸盐缓冲盐水(pbs)ph7.4中平衡的9.4mlhiscreen(连续的2个柱)mabselect(gehealthcare)柱。用pbs洗涤柱子，用ph3.5的0.1m柠檬酸盐洗脱结合的材料。用2mtris/hcl(ph8.5)将收集的洗脱峰调节至约ph7。使用10kda分子量截留离心浓缩器将经过ph调节的洗脱液缓冲液交换到ph7.4的pbs中。a26fab-645dsfv的非还原性sds-page分析使用的一般方法在需要时将样品稀释至50μl终体积中的1.0mg/ml，然后添加5μl100mmnem。然后将样品用50μlnovextris-甘氨酸sds样品缓冲液(2x)稀释并涡旋，然后在95℃孵育3分钟。将制备的样品以5μg/孔加载到4-20％丙烯酰胺tris/甘氨酸sds凝胶上，并在150v的恒定电压下运行120分钟。a26fab-645dsfv的还原性sds-page分析使用的一般方法在需要时将样品稀释至50μl还原剂的终体积中的1.0mg/ml。然后将样品用50μlnovextris-甘氨酸sds样品缓冲液(2x)稀释并涡旋，然后在95℃孵育3分钟。将制备的样品以5μg蛋白质/孔加载到4-20％丙烯酸tris/甘氨酸sds凝胶上，并在150v的恒定电压下运行120分钟。将凝胶用考马斯蓝蛋白染色剂染色，参见图2和12。a26fab-645dsfv的g3000sec-hplc分析的一般方法将50μg样品注射到tskgelg3000swxl，7.8×300mm柱(tosoh)上，并以1ml/min用ph7.0的200mm磷酸盐的等度梯度进行显色。信号检测通过在280nm的吸光度进行，参见图9、10、13和14。使用sec-hplc分析来确定％单体(a26fab-645dsfv单体具有约9分钟的保留时间)以及用于预测转化过程的产率的方法。通过在任何特定时间点表达总峰面积作为t＝0处总峰面积的百分比来计算转化过程的预测产率。蛋白a纯化的a26fab-645dsfv在恒定还原剂浓度下的热转化在pbs/100mmbmea(β-巯基乙胺)的转化缓冲液中以1：1稀释约5mg/ml的蛋白a纯化的a26fab-645dsfv，产生50mm的最终bmea浓度。稀释后，将样品在限定的温度下孵育。将在一段时间内采集的样品放在冰上以降低温度并在分析之前停止转化过程。通过sec-hplc进行分析，并测定单体水平和产率预测。在所有评估的温度下看到单体水平增加，然而在较高温度下转化率显著更快。相反，随着温度的升高，预测产率下降。为了计算单体的总产率(净回收)，将单体百分比水平除以100并乘以预测产率。数据总结在图3、4和5以及表1-3中。在孵育温度≥55℃时，在相对较短的孵育时间后，净回收率降低。在≤50℃时，净回收率在所有评估的时间过程中持续增加。50mmbmea下，净回收率在45-50℃显著较高，50℃显示最佳。表1：总单体-使用50mmbmea的转化表2预测产率-使用50mmbmea的转化表3净回收率-使用50mmbmea的转化蛋白a纯化的a26fab-645dsfv在恒定温度下的热转化将约5mg/ml的蛋白a纯化的a26fab-645dsfv在转化缓冲液中以1:1稀释，所述转化缓冲液是在pbs中的所述bmea浓度(1、5、10、20和50mm)的2x原液。稀释后，将样品在50℃孵育。将在时间过程中采集的样品放在冰上以降低温度并在分析前停止转化过程。通过sec-hplc进行分析，并测定单体水平和产率预测。数据总结在图6、7和8以及表4、5和6中。转化率随着bmea浓度的增加而增加。在≥20小时，净回收率稳定达到约65％单体。降低的bmea浓度看到单体水平的更多逐渐增加，并且在1mmbmea随时间过去观察到很少或没有增加。表4总单体-在50℃和所述bmea浓度下的转化率表5预测产率-在50℃和所述bmea浓度时的转化率表6净回收率-在50℃和所述bmea浓度时的转化率实施例2：在澄清的哺乳动物细胞培养物上清液中fab-dsfv多聚体种类的热转化在哺乳动物细胞培养上清中a26fab-645dsfv的热转化使用10kda分子量截留离心浓缩器将澄清的细胞培养物上清液浓缩至初始体积的一半。然后使用pbs/100mmbmea将浓缩的上清液稀释至原始体积，以得到50mm的最终bmea浓度。然后将上清液在50℃孵育过夜(14.5小时)。孵育后，将上清液放在冰上以降低温度并停止转化过程。来自哺乳动物细胞培养物上清液的a26fab-645dsfv在热转化后的蛋白质a纯化将热转化的cho上清液施加至在delbeccos磷酸盐缓冲盐水(pbs)ph7.4中平衡的9.4mlhiscreen(连续的2个柱)mabselect(gehealthcare)柱中。用pbs洗涤柱子，用ph3.5的0.1m柠檬酸盐洗脱结合的材料。收集洗脱峰并用2mtris/hclph8.5将ph调节至约ph7。使用未转化的cho重复纯化作为对照。，通过g3000sec-hplc(表7)和非还原和还原条件下的sds-page分析ph中和的蛋白a洗脱液(图11和12)。发现洗脱ph允许洗脱fabfv单体，而多聚体种类保持与柱结合。重复上清液转化过程并施加至9.4mlhiscreen柱并用洗脱条件(0.1m柠檬酸盐ph3.8)洗脱。还对以相同的装载量加载的未转化的上清液进行对照运行。收集洗脱峰并用2mtris/hclph8.5将ph调节至约ph7。通过g3000sec-hplc(图13和14)分析和a280(表8)分析ph中和的蛋白a洗脱液。在转化的材料中观察到显著较高的单体水平，其在ph3.5洗脱时具有相当的回收率。当通过sec-hplc分析时，来自进行和未进行转化的上清液的产物质量与来自ph3.8的洗脱物相当，然而转化后观察到蛋白质量的显著增加。表7样品％单体蛋白质(mg)蛋白a洗脱-转化后67.114.1蛋白a洗脱-无转化38.614.9表8样品％单体蛋白质(mg)蛋白a洗脱@ph3.8–转化后97.99.0蛋白a洗脱@ph3.8–无转化98.54.9实施例3：研究各种参数的作用用于本实验的进料抗体是a26fab-645dsfv。所有实验均在蛋白a纯化的材料上进行。使用蛋白质a柱(mabselect，geheathcare)纯化a26fab-645dsfv细胞培养液。该材料在ph7.4下被加载，大部分杂质流过柱子，而靶分子被结合。然后使用柠檬酸钠缓冲液在ph3.4洗脱柱子。这将多聚体种类与单体种类一起洗脱。将洗脱液浓缩至13g/l，并渗滤到ph7.4的pbs缓冲液中。在转化前进料抗体a26fab-645dsfv含有约15％的单体。抗体的浓度(进料浓度g/l)、ph、bmea还原剂浓度、转化步骤的温度和混合速度均进行评价，如下表9所示。单体、二聚体、三聚体、四聚体和hmws％在0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7和23小时处使用由walters制造的仪器利用1.7μm柱beh200sec通过se-uplc进行测量，并在表10中显示了5小时处的测量结果。表9实验n1至n35的实验参数表10在5小时处上表9的结果转化步骤的目的是最大化单体百分比。在所研究的范围内，模型中对单体百分比的最显著的因素是还原剂浓度和温度。在更高的还原剂浓度和更高的温度下，单体百分比增加。观察到如下趋势：存在温度升高与沉淀程度之间的相关性。实施例4：研究各种赋形剂的作用实验中研究的赋形剂和浓度在下表11中提供：浓度以mm表示，除了聚山梨醇酯20和80，其以v/v百分比显示。实验在2ml深孔板中进行并且一式两份地完成。所使用的条件是0.5g/la26fab-dsfv、100mmβ-mea、表11中列出的赋形剂和55℃的温度。还使用0.5g/la26fab-dsfv、100mmβ-mea、55℃和不使用赋形剂进行10个对照样品。另外6个对照使用0.5g/l的a26fab-dsfv、55℃温度和不使用还原剂和赋形剂来进行。定期获得时间进程样品。bradford测定用于监测产率。bradford蛋白质测定是用于测量溶液中蛋白质浓度的分析方法。发现β-mea在595nm处不吸收。因此，这种方法被用来测量总蛋白质浓度，从而确定步骤产率。通过使用bradford蛋白质测定试剂盒以96孔形式测定总蛋白质浓度，其中使用tecanfreedomevo200(tecan，reading，uk)液体处理机器人进行液体转移。测定用纯化的a26fab-645dsfv材料校准，通过a280nm进行正交测试。根据制造商的说明制备和分析样品。然后通过线性回归从曲线内插确定未知浓度。随后通过se-uplc和sdspage分析具有高产率的任何实验。与对照相比，氨基酸似乎减少沉淀，因为它们增加了产率。对于聚山梨醇酯，进行进一步的sdspage分析以分析它们的作用(图15)，样品来自在55℃下以0.5g/l进料、100mmβmea进行5小时后的第二次筛选。图16a和16b显示了不同条件下各种赋形剂的尺寸排阻数据。实施例5：与赖氨酸组合的参数研究在存在0.7m赖氨酸和不存在赖氨酸的情况下研究抗体进料浓度g/l、bmea浓度和温度参数。实验在2ml深孔板中进行并且一式两份地完成。使用2mleppendorf管，每个转化步骤在水浴中进行5小时。表12用于研究因素、范围和响应的替代实验设计表13不使用赖氨酸的上表12的结果表14：使用0.7m赖氨酸的上表12的结果当存在0.7m赖氨酸时，温度对单体百分比的影响最大，在较高温度下观察到更多单体。实施例6：不同还原剂的研究对于最初的还原剂筛选实验，我们使用50℃的温度来打开分子。进料是纯化的a26fab-dsfv，浓度1g/l和15％单体。实验在eppendorfs中以1ml的进料体积进行。筛选的还原剂浓度为10、50和100mm(表15)。使用来自thermoscientific的vortemp仪器加热和混合样品。在添加还原剂之后但在加热之前以及在50℃下加热2小时之后进行取样。用β-mea作为本实验的对照还原剂。表15：研究的初始还原剂和条件使用seuplc测定上的峰面积计算产率。将样品的总峰面积除以进料的总峰面积。通过单体百分数乘以总产率计算单体产率。图17a显示了当在室温下进行处理时的单体％，图17b显示了在50℃下进行相应实验2小时后的结果。图18a和18b显示了通过se-hplc进行的相应分析的结果。实施例7：在2l规模转化按照实施例1进行a26fab-645dsfv的cho表达和澄清，以提供澄清的培养液作为2l规模实验的进料。在2l发酵容器中进行热转化实验，转化体积为2l。用于实验的进料是澄清的细胞培养液(ccf)，产物浓度为2.2g/l，其中30％为单体。实验条件如表16所示，转化步骤在所有实验中进行17小时。样品由seuplc分析。表16：2l转化实验的实验条件表17：2l转化实验的实验结果在代表生产规模所使用的那些的容器中，可以将转化步骤扩大到2l规模。有可能在整个步骤中显著增加单体的量。序列表<110>ucbbiopharmasprl<120>用于增加单体抗体fab-dsfv多聚体种类的百分比的方法<130>pf0018wo<150><151><160>38<170>patentinversion3.5<210>1<211>5<212>prt<213>人工<220><223>cdrh1<400>1asntyrglyilehis15<210>2<211>17<212>prt<213>人工<220><223>cdrh2<400>2serileserproserglyglyleuthrtyrtyrargaspservallys151015gly<210>3<211>8<212>prt<213>人工<220><223>cdrh3<400>3glyglygluglyilepheasptyr15<210>4<211>11<212>prt<213>人工<220><223>cdrl1<400>4argalathrglnseriletyrasnalaleuala1510<210>5<211>7<212>prt<213>人工<220><223>cdrl2<400>5asnalaasnthrleuhisthr15<210>6<211>9<212>prt<213>人工<220><223>cdrl3<400>6glnglntyrtyrasptyrproleuthr15<210>7<211>108<212>prt<213>人工<220><223>抗体a26的轻链可变区<400>7aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalathrglnseriletyrasnala202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrasnalaasnthrleuhisthrglyvalproserargpheserala505560serglyserglythraspserthrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrtyrasptyrproleu859095thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg100105<210>8<211>117<212>prt<213>人工<220><223>抗体a26的重链可变区<400>8gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrasntyr202530glyilehistrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaserileserproserglyglyleuthrtyrtyrargaspserval505560lysglyargphethrileserargaspaspalalysasnserprotyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alathrglyglygluglyilepheasptyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserser115<210>9<211>214<212>prt<213>人工<220><223>抗-ox40抗体fab组分的轻链<400>9aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalathrglnseriletyrasnala202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrasnalaasnthrleuhisthrglyvalproserargpheserala505560serglyserglythraspserthrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglntyrtyrasptyrproleu859095thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala100105110proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly115120125thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala130135140lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln145150155160gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser165170175serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr180185190alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser195200205pheasnargglyglucys210<210>10<211>220<212>prt<213>人工<220><223>抗-ox40抗体fab组分的重链<400>10gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrasntyr202530glyilehistrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaserileserproserglyglyleuthrtyrtyrargaspserval505560lysglyargphethrileserargaspaspalalysasnserprotyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alathrglyglygluglyilepheasptyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu115120125alaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycys130135140leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser145150155160glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser165170175serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserser180185190leuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasn195200205thrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys210215220<210>11<211>121<212>prt<213>人工<220><223>抗白蛋白fv组分的重链<400>11gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalavalserglyileaspleuserasntyr202530alaileasntrpvalargglnalaproglylyscysleuglutrpile354045glyileiletrpalaserglythrthrphetyralathrtrpalalys505560glyargphethrileserargaspasnserlysasnthrvaltyrleu65707580glnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysala859095argthrvalproglytyrserthralaprotyrpheaspleutrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>12<211>112<212>prt<213>人工<220><223>抗白蛋白fv组分的轻链<400>12aspileglnmetthrglnserproserservalseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysglnserserproservaltrpserasn202530pheleusertrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleu354045iletyrglualaserlysleuthrserglyvalproserargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleugln65707580progluaspphealathrtyrtyrcysglyglyglytyrserserile859095seraspthrthrpheglycysglythrlysvalgluilelysargthr100105110<210>13<211>16<212>prt<213>人工<220><223>接头1<400>13serglyglyglyglyserglyglyglyglythrglyglyglyglyser151015<210>14<211>15<212>prt<213>人工<220><223>接头2<400>14glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser151015<210>15<211>357<212>prt<213>人工<220><223>a26fab重链-(g4s,g4t,g4s)-645dsfv(gh5)<400>15gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphethrasntyr202530glyilehistrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaserileserproserglyglyleuthrtyrtyrargaspserval505560lysglyargphethrileserargaspaspalalysasnserprotyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alathrglyglygluglyilepheasptyrtrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu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