本发明涉及在由橡胶材料形成的弹性体上使诱导性多能干细胞(ips细胞)及胚性干细胞(es细胞)凝集以形成细胞团块、进行培养的细胞保持容器、以及使用该细胞保持容器的细胞培养方法。
背景技术：
以往，进行粘附细胞及浮游细胞等各种细胞的传代培养。例如，通过使用细胞刮棒或移液管等物理的方法或使用酶的生理学方法将附着于培养容器而增殖的细胞剥离，播种在包含新鲜的培养基的新培养容器中进行传代，从而培养粘附细胞。其中，作为粘附细胞的多能性干细胞如果单一细胞化则容易发生细胞死，因此需要在细胞块的状态下进行传代，例如，将多能性干细胞作为集落而剥离，用移液管等弄碎成适当大小的细胞块，然后播种在新的培养容器中并进行传代培养。
在这样的传代培养中，在使用作为物理方法的剥离手段的情况下，会发生对细胞造成非常大的损害的问题。另一方面，在使用作为生理学方法的剥离手段的情况下，虽然没有达到物理方法的程度，但也会发生对细胞造成损害，进而对细胞的酶反应不均匀、或当分化至单一细胞时细胞死灭的问题。此外，在进行移液管操作时，因为细胞块的大小发生变化、或难以得到均等的细胞块，所以会发生在传代后的培养中产生的集落的大小不均匀的问题。这样的各集落的大小的不均匀会引起即使一部分达到一定的大小也不能充分培养其他集落的状态，对细胞的品质管理造成不良影响，成为导致生成效率下降的原因。
作为改善因这些剥离方法造成的对细胞的损害及传代培养中的集落的不均匀的方法，例如专利文献1中公开了含有由生物高分子形成的纳米纤维而形成的多能性干细胞的维持扩增培养用基材及使用该基材的培养方法。通过使用该基材，在传代时无需进行酶处理，仅通过轻微的移液管操作就能分散为单一细胞，能够在抑制细胞死的比例的同时获得均匀化的细胞。
此外，该多能性干细胞容易分化，一旦开始分化就难以恢复到未分化状态，所以需要将细胞维持在不变为容易分化的状态下进行培养。此外，在培养中细胞开始分化的情况下，因为会对周围的细胞产生不良影响，或使未分化细胞的收率及纯度降低，所以需要将开始分化的细胞从培养容器中除去。
在细胞培养中，采用开放式培养和封闭式培养，在使用平皿的通常的开放式培养的情况下，在培养基的交换及传代培养中，因为打开平皿的盖进行操作，所以能将吸引器或微移液管插入平皿中，吸引除去开始分化的细胞。开放式培养为低价且操作性优良，作为研究用是有用的。另一方面，在封闭式培养的情况下，因为无法插入吸引器，所以难以选择性地除去培养过程中开始分化的细胞。相反地，封闭式培养与开放式培养相比，能够减轻污染的发生率及感染风险，所以作为医疗用是有用的，期待一种通过简便的操作能选择性地除去开始分化的细胞的技术或结构。
作为在封闭式培养中也能实现选择性的细胞的除去及回收的方法，例如专利文献2中公开了通过高频振动使细胞以区域选择性的方式从附着面剥离的方法。根据该方法，能通过非接触的方法使细胞从封闭式或开放式的培养容器的附着面选择性地剥离。
此外，无论是封闭式培养或开放式培养，在使用多孔板这样的成形有用于形成细胞团块的下沉的凹陷、即孔的容器的细胞培养方法及传代培养的情况下，为了观察该孔内的细胞，需要使用识别性优良的容器。该细胞培养方法是将分散有培养的细胞的细胞悬浊液导入容器内，在孔内使细胞沉降并进行播种，形成细胞团块，对其进行培养，根据需要将通过移液管操作、高频振动或细胞剥离液的送液而培养的细胞进行回收的方法。此外，还可通过重复这些工序来进行传代培养。
但是，这样的预先成形有孔的形状固定容器中，由于容器的凹凸形状而识别性不好，且因为在将细胞悬浊液导入容器内时气泡容易融合的原因，在孔内存在气泡和细胞，从而细胞的固定位置变为不稳定的状态，或由于气泡而光的透射性及折射率发生变化，进而使识别性降低，所以具有难以进行观察的问题。
这样，虽然以往进行各种传代培养，但期望一种能解决上述的问题并且能在维持大量的多能性干细胞的未分化状态的同时进行培养的维持培养、以及能实现从容器的外侧进行细胞状态的观察和检查等，有利于更高效的、均匀的传代培养的容器及其细胞培养方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开2013-247943号公报
专利文献2：日本专利特开2014-018185号公报
技术实现要素：
发明所要解决的技术问题
本发明是为了解决上述技术问题而完成的发明，其目的是提供一种细胞保持容器及使用该细胞保持容器的细胞培养方法，上述细胞保持容器在由能保持细胞的橡胶材料形成的弹性体上能够进行细胞团块的形成和培养，能在不造成损害的情况下维持细胞的未分化状态，同时进行高效、均匀的传代培养，能够实现选择性的细胞的除去和回收，加工性高、识别性优良，能从外侧进行细胞状态的观察和检查。
解决技术问题所采用的技术方案
为了达到上述目的而完成的细胞保持容器是具有保持细胞的弹性体的细胞保持容器，上述细胞包括选自干细胞、前体细胞、体细胞和生殖细胞的粘附细胞、及选自血球系细胞、t细胞和b细胞的浮游细胞中的至少任一种，其特征是，上述弹性体由橡胶材料形成，上述橡胶材料包含含有加成交联型硅橡胶的橡胶成分，且能够保持上述细胞。
由上述细胞保持容器保持的上述干细胞优选为诱导性多能干细胞或胚性干细胞。
上述细胞保持容器可以是细胞培养用的细胞保持容器。
上述细胞保持容器优选在上述加成交联型硅橡胶中含有填料，上述填料包含干式二氧化硅粉末和/或湿式二氧化硅粉末。
上述细胞保持容器优选在上述加成交联型硅橡胶中含有填料，上述填料包含干式二氧化硅粉末和/或湿式二氧化硅粉末，上述填料相对于100质量份的总橡胶成分为5～40质量份。
上述细胞保持容器中，优选上述弹性体为透明的。
上述细胞保持容器中，优选上述弹性体的厚度最大为0.1mm、硬度以肖氏a硬度计最大为a40/s、拉伸强度最大为3.5mp。
上述细胞保持容器中，上述弹性体的一部分可以夹在支承体和侧壁之间，将它们嵌合而固定。
上述细胞保持容器中，上述弹性体通过受到外力，可以可逆地从平板形状变形为具有下沉的凹陷和/或具有起伏的凸起的凹凸形状。
上述细胞保持容器中，上述弹性体可以由能变形的软质部和非变形性的硬质部构成。
上述细胞保持容器中，优选上述软质部的厚度最大为0.1mm。
上述细胞保持容器中，优选上述弹性体的细胞接触面侧是开放的。
上述细胞保持容器中，上述橡胶成分可以包含选自三元乙丙橡胶、氟橡胶、加成交联型硅橡胶和含氟弹性体的至少任一种。
为了达到上述的目的而完成的细胞培养方法是使用上述细胞保持容器的细胞培养方法，其特征是，包括下述工序：将细胞悬浊液导入上述细胞保持容器后，将上述细胞保持容器的弹性体从平板形状变形为具有下沉的凹陷的凹凸形状的工序，上述细胞悬浊液中分散有包括选自干细胞、前体细胞、体细胞和生殖细胞的粘附细胞、及选自血球系细胞、t细胞和b细胞的浮游细胞中的至少任一种的细胞；以及在上述凹陷中播种上述细胞并形成细胞团块后，将上述凹凸形状变形为上述平板形状的工序。
发明效果
本发明的细胞保持容器能够在由作为橡胶成分至少包含加成交联型硅橡胶的橡胶材料形成的弹性体上保持诱导性多能干细胞及胚性干细胞这样的细胞，将所播种的细胞凝集以形成细胞团块并进行培养，还可对它们进行观察、检查。不论该细胞保持容器的弹性体是平板形状还是凹凸形状的任何状态下，细胞保持容器都可保持识别性不降低，无论是开放式细胞保持容器还是封闭式细胞保持容器，都能使用显微镜对保持于弹性体上的细胞进行观察。此外，该细胞保持容器能够在成形或变形为凹凸形状的弹性体上形成均匀大小的细胞团块，且能在对细胞不造成损害的情况下高效地进行传代培养。
该细胞保持容器中，可将弹性体的厚度设为能可逆地变形为任意形状的0.1mm以下，即使是这样薄的厚度也能显示出优良的加工性。藉此，伸缩性优良，能实现可逆的变形，能变形为任意的形状，并且能无形变地恢复到原来的形状。此外，能使该弹性体在任意的时刻可逆地变形，因此能根据需要实现识别性的提高，还能在不使气泡混入细胞保持容器内的情况下对细胞进行保持或培养。
根据本发明的细胞培养方法，能在不对细胞造成损害的情况下维持细胞的未分化状态，同时进行高效、均匀的传代培养。此外，根据该细胞培养方法，不会在细胞保持容器的孔内混入气泡，能使细胞的固定位置稳定并进行培养，还能选择性地改变细胞保持容器的弹性体的形状，所以识别性优良，能从外侧进行培养前后及培养中的细胞状态的观察和检查。
附图说明
图1是采用本发明的细胞保持容器的示意立体图及其沿a-a箭头方向观察到的示意剖视图。
图2是表示采用本发明的细胞保持容器的变形性弹性体中的变形前后的示意立体图。
图3是采用本发明的细胞保持容器的另一变形性弹性体的示意俯视图及其沿a-a箭头方向观察到的示意剖视图。
图4是采用本发明的细胞保持容器的另一变形性弹性体的示意俯视图及其沿a-a箭头方向观察到的示意剖视图。
图5是采用本发明的细胞保持容器的另一变形性弹性体的示意俯视图及其沿a-a箭头方向观察到的示意剖视图。
图6是采用本发明的另一细胞保持容器的示意立体图。
图7是采用本发明的另一细胞保持容器的示意俯视图。
图8是图7中的沿a-a箭头方向观察到的剖视图。
图9是表示对采用本发明的细胞培养方法中的细胞保持容器的弹性体进行变形的工序的示意剖视图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明，但本发明的范围并不局限于这些实施方式。
本发明的细胞保持容器的一种形态是具有由橡胶材料形成的弹性体的开放式的细胞保持容器，其中，将诱导性多能干细胞(ips细胞)及胚胎干细胞(es细胞)等万能细胞保持在弹性体上，用于细胞团块的形成、培养和观察。
作为开放式细胞保持容器，参照表示其一种形态的图1进行说明。
本发明的细胞保持容器1包括由橡胶材料形成的弹性体20、将其周围包围的侧壁2、和将弹性体20固定的支承体7。该细胞保持容器1的弹性体20中，如图1(a)和(b)所示，其一部分夹在支承体7和侧壁2之间，弹性体20通过使侧壁2嵌合在支承体7的槽8中而被物理地固定。
具体而言，细胞保持容器1是如下构成的：通过在具有槽8的框状的支承体7上重叠片状的弹性体20，从其之上使侧壁2的一部分嵌合在支承体7的槽8中，从而固定弹性体20。弹性体20由于其弹性和伸缩性而具有适度的张力，不会发生歪斜或弯曲，保持细胞的细胞接触面21及其相反侧、即成为外侧的细胞非接触面22形成为平面形状。细胞保持容器1在其弹性体20上粘附和保持细胞，能进行培养、观察和检查。此外，细胞保持容器1以弹性体20作为底部，可以在由侧壁2包围的细胞接触面21的一部分上将细胞保持为均匀或不均匀的点状，也可以将由侧壁2包围的细胞接触面21的整面浸渍以保持细胞。在培养保持的细胞时，由侧壁2包围的内侧是培养室4。这样的细胞培养容器1中，细胞接触面21、即培养室4是开放的状态，不需要繁杂的工序，选择性的细胞的除去及回收简便，操作性高。此外，根据该细胞培养容器1，能在维持细胞状态的同时高效地进行操作，且不会对细胞造成损害。
形成细胞保持容器1的弹性体20由橡胶材料形成，该橡胶材料至少包含加成交联型硅橡胶作为橡胶成分。橡胶成分可以是加成交联型硅橡胶，也可以是缩合型硅橡胶，也可以含有它们中的至少任一种的硅橡胶、和选自三元乙丙橡胶(epdm)、氟橡胶及含氟弹性体的至少一种。这些氟橡胶和含氟弹性体可以非熔融地混炼在橡胶材料中。从加工性的观点考虑，弹性体20优选仅由加成交联型硅橡胶作为橡胶成分而形成。
作为加成交联型硅橡胶，具体而言，可例举日本迈图高新材料股份有限公司(モメンティブ·パフォーマンス·マテリアルズ·ジャパン合同会社)制造的lsr7005、lsr7030、lsr7060、lsr7070、lsr7080。
橡胶材料可以含有填料。在含有填料的情况下，优选包含在加成交联型硅橡胶中。此外，橡胶成分中除加成交联型硅橡胶以外还含有三元乙丙橡胶(epdm)、氟橡胶或含氟弹性体时，优选包含在氟橡胶及含氟弹性体以外的橡胶成分中。例如，在将橡胶材料中的氟橡胶或含氟弹性体非熔融地混炼时，可以在除此以外的橡胶成分中含有填料。
作为填料，可例举例如干式二氧化硅粉末、湿式二氧化硅粉末、它们的混合物等。在仅使用加成交联型硅橡胶作为橡胶成分的情况下，更优选掺合有干式二氧化硅粉末。在弹性体20上进行培养时，这些填料能稳定地培养细胞。此外，该橡胶材料通过含有填料，能提高与后述的侧壁等其他构件的粘合性。另外，在不使用填料时、或以最大20phr使用干式二氧化硅时、或以最大5phr使用湿式二氧化硅时的细胞保持容器的情况下，培养性及识别性极为优良，但在以20phr以上使用湿式二氧化硅时的细胞保持容器的情况下，识别性稍微下降。
填料的含量随填料的种类及橡胶成分的种类而不同，相对于100质量份的总橡胶成分，最大为40质量份，优选5～40质量份。填料的含量超过40质量份时，培养性容易下降。使用干式二氧化硅粉末的情况下，从培养性的观点考虑，优选为0～20质量份。此外，在使用湿式二氧化硅粉末的情况下，从培养性的观点考虑，优选为0～20质量份，从识别性的观点考虑，优选为0～5质量份。在橡胶成分中包含epdm的形态的情况下，在使用干式二氧化硅粉末时，从培养性的观点考虑，优选为0～30质量份。此外，在使用湿式二氧化硅粉末的情况下，从培养性的观点考虑，优选为0～20质量份，从识别性的观点考虑，优选为0～5质量份。
从容易进行使用相位差显微镜等的显微镜观察的观点考虑，由上述橡胶材料形成的弹性体20优选为透明且识别性优良，更优选无色透明。从透明性的观点考虑，添加到橡胶材料中的填料优选为极少。
弹性体20通过具有伸缩性、保持细胞，在进行细胞团块的形成、培养、观察及检查时，能根据需要从平面形状变形为凹凸形状、或解除这些变形而恢复到原来的形状，能可逆地变形。凹凸形状是指弹性体20的一部分具有多个或单个的凹陷或凸起的形状。例如，当从细胞接触面21向弹性体20施加朝向细胞非接触面22的外力时，变形为具有下沉的凹陷的凹凸形状，相反地，当从细胞非接触面22施加朝向细胞接触面21的外力时，变形为具有起伏的凸起的凹凸形状。因为能根据需要变形为任意的形状，且能容易地解除该变形，无形变地恢复到原来的形状，所以能够根据情况，例如为了形成播种的细胞的细胞团块而变形为凹凸形状，或为了在培养细胞的观察及检查时提高识别性而解除凹凸形状。
作为具体的变形的一例，例示了由多个软质部24和硬质部23构成的弹性体20的情况。例如，如图2所示，在通常状态下，弹性体20的细胞接触面21和细胞非接触面22均呈现平面形状。另一方面，当对该细胞接触面21施加外力p1时，其硬质部23不变形，多个软质部24朝向外侧延伸，形成开口的四棱锥的凹陷25而变形。此外，但解除外力p1时，该变形也解除，无形变地恢复为原来的形状。这样形成的凹陷25能保持细胞，能进行细胞团块的形成、培养及观察。
凹陷25可用作用于形成细胞团块的孔(日文：ウェル)。为了将该孔与用于将通常的细胞培养中使用的多孔板的培养室划分的孔区别，将该孔称为“微孔”，但“微孔”并不是意在排除具有一边或直径为1mm以上的开口部的孔的技术用语，也包括具有一边或直径为1mm以上的开口部的孔。此外，以下，有时将微孔称为“凹陷”。
微孔中，注入细胞保持容器1的细胞悬浊液的细胞由于重力等而沉降，该沉降的细胞通过聚集在孔的底面可形成细胞团块。微孔的形状是沉降的细胞聚集的形状，优选其内周具有越接近底面越窄的形状。例如，优选具有锥形、圆底、v底及u底，更优选为四棱锥。此外，优选在市售的aggrewell(商标)(干细胞技术有限公司(stemcelltechnologies社)制)板底面刻着的微孔的形状。
微孔优选其斜面实施了镜面研磨，凹处的顶点即尖端部是圆滑形状。微孔的大小可根据欲制作的细胞团块进行适当选择，也可选择比欲制作的细胞团块的尺寸大的尺寸。
对于微孔的开口部的形状，可考虑加工的容易性及能大量地配置孔的形状进行适当选择，可以具有例如三角形、四角形或六角形等多角形的形状或圆的形状。
微孔的开口部的大小可根据所形成的细胞团块的大小进行选择。例如，可以具备具有与直径100μm～3mm、直径200μm～800μm、或直径400μm～600μm的圆同等的面积的开口部。
所形成的细胞团块优选统一为固定的大小，从能将所形成的细胞团块的大小统一的观点考虑，能形成细胞保持容器1的弹性体20的多个微孔优选其形状均匀、大小相等。使细胞较均匀地分散在微孔中变得容易，结果能形成均匀大小的细胞团块。
从能够大量地获得细胞团块的观点考虑，优选在弹性体20中配置多个微孔，优选以在相邻的孔之间不存在平坦的部分、且无间隙或使孔之间的间隙为最小限度的方式排列，且具有规则性地紧密配置。此外，从将细胞培养方法中形成的细胞团块均匀地播种在培养面上的观点考虑，微孔优选在平面上以等间隔整齐排列。
这样的变形性的弹性体20能变形为任意的形状，可以是如图3所示的由多个软质部24和硬质部23构成的弹性体20a，也可以是如图4所示的一部分的厚度不同的弹性体20b，也可以是如图5所示的形成多个开口部29的带有硬质框26的弹性体20c。
图3(a)是由作为变形部位的软质部24和作为非变形部位的硬质部23构成的弹性体20a的细胞非接触面22的示意俯视图，将其沿a-a箭头观察时的示意剖视图示于图3(b)。例如，当施加吸引细胞非接触面22的外力时，如上述图2所示，硬质部23不变形，例如在其各方格内或格子内存的多个软质部24a1、24a2、24a3、24a4受到拉引，形成下沉的凹陷，朝向外侧延伸而变形。相反地，当施加按压细胞非接触面22的外力时，同样地硬质部23不变形，软质部24a1、24a2、24a3、24a4受到按压而形成起伏的凸起，朝向内侧延伸而变形。
同样地，如图3(c)的示意剖视图所示，从使通过变形而形成的微孔的凹处的顶点、即尖端部(底端)变尖的观点考虑，可以是由作为非变形部位的硬质部23和作为变形部位的软质部24构成，且使它们的硬度逐渐变化的弹性体20a。可进行如下加工：从软质部24a1到软质部24b1膜的硬度逐渐减小，在形成微孔的底端的部分、即软质部24b1硬度变为最小，从此处到软质部24a1膜的硬度逐渐变大，作为非变形部位的硬质部23的硬度为最大。与上述同样地，当受到外力时，例如多个方格状或格子状且开设有矩形孔的硬质部23不变形，将软质部24b1、24b2、24b3、24b4作为凹陷的顶点，软质部24a1、24a2、24a3、24a4及软质部24b1、24b2、24b3、24b4变形为例如四棱锥状。硬质部23可以开设纵横排列的圆形孔、且该孔成为软质部。
具有这些硬质部23和软质部24的弹性体20是调整了弹性体20的硬度的弹性体。硬质部23可以由与软质部24相同的橡胶材料形成，只要不会因外力而发生形状变化即可，也可以是不同的构件。此外，这样的弹性体20可通过嵌件注塑成形方法(日文：インサート成形手法)等公知的方法形成。
图4(a)是以变形部位比例如多个方格状或格子状的非变形部位薄的方式厚度形成有高低的弹性体20b的细胞非接触面22的示意俯视图，其沿着a-a箭头观察时的示意剖视图示于图4(b)。弹性体20b是以细胞接触面21平坦、细胞非接触面22在变形部位和非变形部位处的厚度不同、且在变形部位形成薄壁部27的方式加工的弹性体。例如，当施加吸引细胞非接触面22的外力时，作为非变形部位的厚壁部28不变形，多个薄壁部27a1、27a2、27a3、27a4受到拉引而形成下沉的凹陷，朝向外侧延伸而变形。相反地，当施加按压细胞非接触面22的外力时，同样地作为非变形部位的厚壁部28不变形，薄壁部27a1、27a2、27a3、27a4受到按压而形成起伏的凸起，朝向内侧延伸而变形。
同样地，如图4(c)的示意剖视图所示，从使通过变形所形成的微孔的底端变尖的观点考虑，可以是在变形部位和非变形部位处的厚度不同、使厚度从变形部位朝向非变形部位逐渐变化的弹性体20b。可进行如下加工：从作为非变形部位的厚壁部28到凹陷的顶点厚度逐渐变薄，形成微孔的底端的部分为最薄，且从此处到厚壁部28逐渐变厚。
图5(a)是形成多个开口部29的例如大致矩形的硬质框26安装在细胞非接触面22上而成的弹性体20c的细胞非接触面22的示意俯视图，其沿着a-a箭头观察时的示意剖视图示于图5(b)。硬质框26相当于非变形部位，与该硬质框26的开口部29对应的区域相当于变形部位。例如，当施加吸引细胞非接触面22的外力时，与开口部29对应的区域可发生变形，在细胞接触面21形成下沉的凹陷，朝向外侧延伸而变形。
如图3～5所示，例示了形成为通过受到外力而能够可逆地变形的变形性弹性体，但是，弹性体20也可以是通过预先使用模具的成形加工而成型或形成为凹凸形状或平面形状等任意形状的非变形性弹性体。
变形性或非变形性的弹性体20的硬度以肖氏a硬度计，优选为a5/s～a90/s。其中，变形性弹性体20优选a40/s以下，当超过a40/s时，密合性容易降低。此外，在如图3(b)和(c)那样对弹性体20的硬度进行局部调整的情况下，变形部位的硬度优选为a5/s～a30/s，非变形部位的硬度优选为a50/s～a90/s。
变形性或非变形性的弹性体20的厚度没有特别限定，但优选为0.05mm～2.00mm。其中，变形性弹性体20优选为0.1mm以下，当超过0.1mm时，不易变形。在如图4(b)和(c)所示对弹性体20的厚度进行部分调整的情况下，变形部位的厚度优选为0.05mm～0.30mm，非变形部位的厚度优选为0.50mm～2.00mm。
变形性的弹性体20的拉伸强度优选为3.5mpa以下，若超过3.5mpa，则在施加如上所述的外力时，难以吸引。
细胞保持容器1只要至少底部的细胞接触面21是由橡胶材料形成的弹性体20即可，底部、侧壁2和支承体7分别相同或不同，可以是由同样的橡胶材料形成的橡胶制品，也可以是由聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和丙烯酸树脂等塑料材料形成的塑料制品。
细胞保持容器1可以通过使用具有槽的多个方格状的支承体、及可嵌合于该槽中的方格状的侧壁，将细胞接触面21划分为多个。此外，细胞保持容器1可以是具有由橡胶材料形成并成为底部的弹性体20、和包围该弹性体20的侧壁2的如培养皿那样的平皿。该细胞保持容器1可通过如丙烯酸改性硅树脂那样的粘合剂将平板形状的弹性体20和侧壁2化学粘接、固定。细胞保持容器1的弹性体20与上述同样，使细胞接触面21和细胞非接触面22均为平面形状。容器1的形状没有特别限定，可例举圆形、椭圆形、多边形等各种形状。
细胞保持容器1中，弹性体20是ips细胞或es细胞的粘附培养用弹性体，细胞保持容器1适合在将它们中的至少任一种细胞凝集而形成细胞团块，对细胞团块进行培养、观察、检查时使用，即使是其他粘附细胞或浮游细胞，也可用于其凝集、细胞团块形成、培养、观察、检查。作为粘附细胞，可例举多能性干细胞(pluripotentstemcell)、干细胞、前体细胞、体细胞、生殖细胞，作为浮游细胞，可例举血球系细胞、t细胞、b细胞。作为浮游细胞，优选t细胞、b细胞。
本发明的细胞保持容器1如图6所示，可以是由弹性体20构成的板，上述弹性体20由橡胶材料形成，作为上侧的细胞接触面21为具有多个呈四棱锥下沉的凹陷25的凹凸形状，作为下侧的细胞非接触面22为平面形状。该细胞保持容器1的细胞接触面21侧开放，在弹性体20的凹陷25中保持细胞，可使沉降在凹陷25内而播种的细胞发生凝集，形成细胞团块，进行培养，还可对其进行观察或检查。
弹性体20的细胞非接触面22不限定于平面形状，也可具有与细胞接触面21对应的凹凸形状。此外，优选对细胞非接触面22实施了镜面研磨。该弹性体20可以是变形性弹性体，也可以是非变形性弹性体。
此外，作为其他的细胞保持容器，参照表示其一种形态的图7和图8进行说明。图7是细胞保持容器的上方的示意俯视图，图8表示沿图7的a-a箭头观察时的示意剖视图。
该细胞保持容器1具有注入口5和排出口6，通过弹性体20和侧壁2形成培养室4和流路3。细胞保持容器1可通过用丙烯酸改性硅树脂等粘合剂将形成培养室4和流路3的侧壁2粘接在平板形状的弹性体20上而形成。细胞培养容器1的培养室4优选在作为弹性体20的内侧面的细胞接触面21的表面中的一部分或全部具有细胞粘附性。
向培养室4中输送、填充细胞悬浊液等含细胞的液体、作为培养基的细胞培养液。此外，根据需要，还可输送细胞剥离液或细胞回收液等。
细胞保持容器1中，多个培养室4通过流路3连通，并形成有所输送的液体的注入口5和排出口6。注入口5是指所输送的液体的入口，排出口6是指所输送的液体的出口。通过注入口5输送的液体从形成于培养室4的两端的流路3中的任一方的流路3流入培养室4后，从另一方的流路3流出。然后，流入下一个培养室4，从与其相连的流路3流出，通过单向性的流动，最终从排出口6排出。该稳定的单向性的流动因为在将细胞悬浊液注入细胞保持容器1而将细胞播种在培养室4中时，能够均匀地播种，所以是优选的。此外，通过单向性的稳定的流动，能够将培养播种的细胞时输送的细胞培养液均匀地灌流。
细胞保持容器1不限定于多个培养室4通过流路3连通的形状，也可以各个培养室4通过流路3分别具有注入口5和排出口6，独立地形成。此外，培养室4并不限定于形成多个，也可以仅为1个。还有，注入口5和排出口6不必单独设置，也可以一体地设置。
形成细胞保持容器1的弹性体20可以是细胞接触面21和细胞非接触面22均形成为具有平面形状的平板形状的变形性弹性体，也可以是预先利用模具成形加工所得的非变形性弹性体。
在变形性的弹性体20的情况下，至少形成培养室4的区域是能够变形的。该弹性体20与上述同样，可使用如图3～图5所示的变形性弹性体20a、20b、20c，在形成培养室4的区域播种细胞，形成细胞团块，进行培养、观察或检查时，能够根据需要从平面形状变形为凹凸形状，且解除它们的变形而恢复为原来的形状，能可逆地变形。例如，当从弹性体20的细胞非接触面22施加朝向培养室4的外力时，弹性体20中的形成培养室4的区域的一部分或全部变形为具有朝向培养室4起伏的凸起的凹凸形状。相反地，当从弹性体20的细胞接触面21施加朝向弹性体20的外侧的外力时，弹性体20中的形成培养室4的区域的一部分或全部变形为具有朝向培养室4下沉的凹陷的凹凸形状。根据需要能变形为任意的形状，此外能将该变形容易地消除，无形变地恢复为原来的形状，所以，在例如培养细胞的观察和检查时通过解除凹凸形状能提高识别性，根据情况通过解除凹凸形状，可节约培养基、试剂及试样。
另一方面，非变形性的弹性体20中，细胞接触面21预先成型为凹凸形状。细胞非接触面22可以是平面形状，也可具有与细胞接触面21对应的凹凸形状。细胞接触面21的凹凸形状是在形成细胞接触面21的培养室4的区域内形成有多个开口的四棱锥的凹陷25。优选对该凹陷25的斜面和细胞非接触面22分别实施了镜面研磨。
这样的细胞保持容器中的变形性或非变形性的弹性体20的凹陷25与上述例示的细胞保持容器的微孔同样，可保持细胞，进行细胞团块的形成、培养、观察和检查。
侧壁2可以由与弹性体20相同或同样的橡胶材料形成，也可由其他材料形成。此外，从显微镜观察的观点考虑，侧壁2优选为识别性优良的透明。
弹性体20和侧壁2由同样的橡胶材料形成的情况下，从该橡胶材料的折射率与充满培养室4的细胞培养液(培养基)的折射率的关系来看，识别性提高，容易进行使用显微镜的观察。充满培养室4的细胞培养液(培养基)几乎全部是水，其折射率为1.33，而加成交联型硅橡胶的折射率为1.40～1.43，能从细胞保持容器1的外侧直接识别细胞培养的状况，容易用显微镜等进行观察。
作为侧壁2，不限定于由橡胶材料形成的橡胶制品，也可以是由聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸树脂等形成的塑料制品。
细胞保持容器1的培养室4优选粘附细胞的面具有细胞粘附性，除此以外的面具有细胞非粘附性。培养室4中，作为其孔而形成或成型的凹陷25的全部或一部分可具有细胞粘附性，对于培养室4的必要部位也可选择性地赋予细胞粘附性。培养室4在凹陷25的斜面具有细胞粘附性的情况下，可将细胞固定在其斜面上。另一方面，培养室4在凹陷25的斜面不具有细胞粘附性的情况下，不会使细胞固定在斜面上，而是使细胞凝集在凹陷25的凹处的顶点。此外，对于粘附细胞的面以外的面，可以选择性地赋予细胞非粘附性。通过在粘附细胞的面以外的面上防止细胞的粘附，可在形成细胞团块后，将细胞团块高效地剥离。
细胞粘附面可通过细胞粘附性涂布赋予细胞粘附性。作为细胞粘附性涂布，当使用例如マトリゲル(商标)(日本bd株式会社(日本ベクトン·ディッキンソン株式会社)制造)等细胞粘附性的基底膜基体时，可对粘附面实施细胞粘附性涂布。作为使用市售的涂布剂的涂布方法，可使用公知的方法。此外，也可通过照射紫外线(uv)、等离子体而赋予细胞粘附性。
细胞非粘附面可通过细胞非粘附性涂布赋予细胞非粘附性。作为细胞非粘附涂布，只要是具有细胞非粘附性的涂布就没有特别限定，可例举例如使用下述物质的涂布：甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等纤维素类；聚氧化乙烯；羧基乙烯基聚合物；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙二醇；聚乳酸；聚丙烯酰胺、聚n-异丙基丙烯酰胺等聚酰胺；甲壳素、壳聚糖、透明质酸、醇酸(日文：アルキド酸)、淀粉、果胶、角叉菜聚糖、瓜尔胶、阿拉伯树胶、葡聚糖等多糖类，以及它们的细胞非粘附性的衍生物。从透明性高、识别性良好的观点考虑，优选聚乙二醇。
本发明的细胞保持容器1可根据需要具有能以暂时覆盖细胞接触面21、培养室4及流路3的方式装拆的盖、片、膜、板、基板等覆盖构件。此外，也可以是以与弹性体20的细胞接触面21相对并将培养室4和流路3密封、密闭的方式抵接平板形状的基板等覆盖构件、且无法装拆地封闭接合的细胞保持容器。该细胞保持容器1是例如在平板形状的弹性体20和与其相对配置的平板形状的覆盖构件即基板之间存在形成培养室4和流路3的侧壁2的状态下接合而成的。弹性体20和基板分别是形成培养室4的构件。通过使弹性体20的内侧面和基板的内侧面中的任一表面具有细胞粘附性，可形成具有细胞粘附面的培养室4。此外，通过使弹性体20的内侧面和基板的内侧面中的任一表面具有细胞粘附性、另一表面具有细胞非粘附性，可形成细胞粘附面和细胞非粘附面相对配置的培养室4。该细胞粘附性可以赋予弹性体20的内侧面和基板的内侧面中任一表面的全部，也可以赋予其一部分。此外，可以赋予成为培养室4的区域的全部，也可赋予其一部分。
覆盖构件可以是由与弹性体20相同或同样的橡胶材料形成的橡胶制品，也可以是由聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸树脂等形成的塑料制品。从保持培养室4内的氧浓度和二氧化碳浓度的观点考虑，覆盖构件优选为透气膜，例如可使用作为市售品的细胞培养用的聚苯乙烯制透气膜。透气膜在向培养室4内的培养基供给氧等的方面起到重要的作用。此外，利用作为覆盖构件使用了透气膜的细胞保持容器1来回收通过细胞培养方法培养的细胞时，能通过超声波振动有效地将细胞从膜表面剥离，所以在细胞的剥离方法的选择增多的方面是有利的。
在该细胞保持容器1的使用时，培养室4和流路3充满了细胞悬浊液或细胞培养液，因此，随着弹性体20的变形，培养室4的容积变动，需要从排出口6排出以进行调节。在覆盖构件由同样的橡胶材料形成的情况下，通过覆盖构件伸缩可吸收因弹性体20变形为凹凸形状而引起的培养室4的容积变动。藉此，在使用橡胶栓等密封注入口5和排出口6后，即使使弹性体20变形为凹凸形状，也能抑制自注入口5和排出口6的液体泄漏风险。
本发明中的细胞保持容器1可用作在由橡胶材料形成的弹性体20上使细胞凝集，形成细胞团块，对细胞团块进行培养、观察和检查的细胞保持系统。作为细胞保持系统，只要具备细胞保持容器1和使其弹性体20变形的变形单元即可。根据该细胞保持系统，能将粘附细胞或浮游细胞的细胞保持在弹性体20上，能进行均匀且高效的维持培养和传代培养。
以下，说明使用该细胞保持容器1的细胞培养方法。
本发明的细胞培养方法是依次进行下述工序的方法：在将分散有细胞的细胞悬浊液导入细胞保持容器1后，使该细胞保持容器1的弹性体20从平板形状变形为具有下沉的凹陷25的凹凸形状的工序；和在通过该弹性体20的变形而形成的凹陷中播种细胞以形成细胞团块后，以使该凹凸形状恢复为平板形状的方式使弹性体20变形的工序。
传代时分散的细胞90可以包含细胞块(以下有时简称为“细胞”)，在粘附培养中，可使用通过生理学的剥离法或物理的剥离法能从细胞粘附面剥离的多能性干细胞。
作为能使多能性干细胞从细胞粘附面剥离的生理学方法，可使用公知的方法，可例举例如使用酶的方法、或使用具有细胞剥离作用的化学物质的方法。作为酶，可使用常规方法中使用的酶，可例举例如胰蛋白酶、中性蛋白酶、accutase酶、胶原酶等。作为具有细胞剥离作用的化学物质，可例举例如乙二胺四乙酸(edta)等的二价离子(特别是mg2+)的螯合剂等。这些酶及具有细胞剥离作用的化学物质可单独使用，也可以同时使用。
作为使多能性干细胞从细胞粘附面剥离的物理方法，可使用公知的方法，可例举例如对细胞的附着表面施加高频振动等的振动的方法、或使用细胞刮棒的方法。这些生理学的剥离法及物理的剥离法可适当选择，可以单独使用或组合使用。
细胞块可解离至单一细胞级别。细胞块的解离可与细胞从培养面的剥离同时进行，也可在作为细胞块被剥离后进行。
作为细胞90的分散，在从粘附面剥离后的细胞保持为细胞块的形状的情况下，可利用例如移液管的水流将剥离后的细胞块解离并分散至单一细胞级别。“分散至单一细胞级别”是指将细胞块解离后分散，使得每一个细胞块中所含的细胞数的平均数为1～100个，优选为1～10个，包括完全解离至单一细胞后分散。细胞块可以在完全解离为单一细胞后分散，也可以在大部分解离为单一细胞后分散，也可以解离成大部分由1～100个、优选1～10个的细胞构成的细胞块后分散。在分散后的细胞块大的情况下，在将细胞块播种在微孔中时，播种在各微孔中的细胞数容易发生不均匀，分散后的细胞块优选较小。
此外，从培养面剥离后的细胞块可以通过使用酶进行进一步处理，分散至单一细胞级别。作为为了将细胞解离为单一细胞级别而能使用的酶，可使用公知的酶，可例举例如能将细胞-细胞间的连接切断的酶或能将细胞-细胞外基质(ecm)间的连接切断的酶。使用酶及水流的细胞块的解离可以自动化。
在将细胞解离至单一细胞级别并分散后，可在分散的细胞90的悬浊液中添加抑制因分散细胞90而引起的细胞死等对细胞的不良影响的化合物，例如y-27632等rock抑制剂。
将分散的细胞90的悬浊液导入细胞保持容器1后，作为使其弹性体20变形的工序，可以如图9所示，在弹性体20的外侧配置用于使其变形的变形单元30以形成细胞保持系统，通过减压、对弹性体20进行吸引而使其变形。同样地，在所形成的凹陷中播种细胞而形成细胞团块后，作为使弹性体20变形以将凹凸形状恢复为平板形状的工序，可通过解除减压状态来解除弹性体20的变形。变形解除后的弹性体20可在将细胞团块保持在细胞接触面21的状态下无形变地恢复为原来的平板形状，通过解除变形，能大大提高观察时的识别性。
变形单元30如图9所示，在与细胞保持容器1的弹性体20的细胞非接触面22相对的面、即凹凸面31一侧具有通过所连接的吸送气单元进行吸气或送气的吸送气口33，且具有单个或多个凹陷35。与细胞保持容器1的弹性体20的细胞非接触面22相对的面、即凹凸面31是朝向细胞非接触面22开口、有序地形成有呈四棱锥下沉的多个凹陷35的凹凸形状，在这些凹陷35的顶点(四棱锥的顶点)具有吸送气口33。该凹凸面31通过使其一部分与细胞保持容器1的弹性体20的细胞非接触面22接触，在凹凸面31与弹性体20之间形成由各凹陷35构成的真空室。该真空室通过利用吸送气单元进行减压或加压，可使弹性体20的形状变化。该真空室通过从吸送气口33吸气而变为减压状态，通过从吸送气口33送气而变为加压状态。作为吸送气单元，只要能从真空室吸引空气、且能向真空室吹送空气即可。这里，真空是指自大气压减压后的状态。
实施例
以下，详细说明本发明的实施例，但本发明的范围并不局限于这些实施例。
(实施例1)
用有机硅类粘合剂(思美定株式会社(セメダイン株式会社)制造，cemedinesuperx)将作为弹性体的由加成交联型硅橡胶(日本迈图高新材料股份有限公司制造)的橡胶材料形成的厚度0.05mm的橡胶板粘接在聚苯乙烯制的培养容器上而制成细胞保持容器，在该橡胶板上播种细胞。此外，作为添加到橡胶材料中的填料，使用湿式二氧化硅粉末(东曹硅化工株式会社(東ソー·シリカ株式会社)制造，nipsilvn3)和干式二氧化硅粉末(日本aerosil株式会社制造，aerosil200)。作为uv灭菌处理，使用gl灭菌灯(东芝株式会社制造)。照射条件采用距离1m，照射时间设为24小时。将各橡胶板的uv处理的结果、基于显微镜的识别性、橡胶板的厚度为0.1mm以下时的加工性、以及用显微镜观察培养状况的结果示于下述表1中。
(比较例1)
除了将橡胶材料由加成交联型硅橡胶替换为epdm(jsr株式会社制造)、氟橡胶(大金工业株式会社制造)以外，利用与实施例1同样的方法和条件制作细胞保持容器，播种细胞。将各橡胶板的uv处理的结果、基于显微镜的识别性、加工性及用显微镜观察培养状况的结果示于下述表1。
[表1]
从表1可明确确认到由epdm、氟橡胶或加成交联型硅橡胶形成的弹性体的识别性优良，能在该弹性体上进行细胞的培养。
(比较例2)
与实施例1同样地在作为弹性体的有机过氧化物型硅橡胶(日本迈图高新材料股份有限公司制造，tse221-5u)的橡胶板上播种了细胞，但是无法进行培养。
产业上利用的可能性
本发明的细胞保持容器作为诱导性多能干细胞或胚性干细胞等粘附细胞或浮游细胞等各种细胞的细胞团块形成用、细胞培养用、观察用、检查用的容器是有用的。使用该细胞保持容器的细胞培养系统和细胞培养方法在浮游细胞或粘附细胞的培养中是有用的，可用于这些细胞的维持培养和传代培养。
符号说明
1细胞保持容器；2侧壁；3流路；4培养室；5注入口；6排出口；7支承体；8槽；20、20a、20b、20c弹性体；21细胞接触面；22细胞非接触面；23硬质部；24、24a1、24a2、24a3、24a4软质部；25凹陷；26硬质框；27、27a1、27a2、27a3、27a4薄壁部；28厚壁部；29开口部；30变形单元；31凹凸面；33吸送气口；35凹陷；90细胞；p1外力。