CD8+CD45RC低TREG的新亚群及其用途的制作方法

本发明涉及鉴定高度抑制性的人cd8⁺cd45rc^低treg亚群的细胞治疗领域。

发明背景:

免疫抑制方案仍然是移植患者长期存活和移植患者福利的重要障碍，并且近年来，同种异体移植存活的改进已经停滞，主要是由于继发效应和非特异性免疫抑制(feng2008)。在人中对供体抗原具有优异的抑制能力和特异性的调节性群体的鉴定对人类移植和许多具有调节性t细胞(treg)/效应t细胞(teff)失调的疾病具有极大的益处。

实际上，包括foxp3⁺treg细胞和cd45rc^低treg的调节性t细胞或“treg”在控制各种免疫应答方面是基础性的，因为treg能够快速抑制其它免疫细胞的活性。具体而言，treg对于通过下调对自体和非自体抗原的不期望的免疫应答而维持耐受性是关键的。例如，已经在患有多发性硬化症(ms)、i型糖尿病(tld)、银屑病、重症肌无力(mg)和其它自身免疫性疾病的患者中发现了treg缺陷。特应性疾病和变态反应性疾病也可能存在类似的联系。对于所有这些疾病，报道指出患者的treg细胞的体外免疫抑制减少。这已经导致对在免疫疗法中使用treg以治疗或预防自身免疫性疾病、变态反应、抗治疗性蛋白质免疫应答(即因子viii)和移植相关并发症的可能性的兴趣增加。

因此，特别需要具有高度抑制特性的treg细胞亚群，其基本上不含cd4⁺和cd8⁺效应t细胞，以获得分离的treg细胞群。事实上，高度抑制性的分离的treg可随后被扩增并用有效诱导抗原特异性免疫耐受的感兴趣的或遗传修饰的(例如为了表达也被称为car的给定的嵌合抗体受体或表达嵌合t细胞受体(tcr))抗原或其它嵌合抗原受体类型进行脉冲刺激。这类扩增的treg细胞群在慢性炎症、自身免疫、变态反应、移植、治疗性蛋白质治疗和基因治疗的领域具有特别的意义，以避免免疫系统对自身或治疗性分子/组织的降解。

发明概述:

在第一方面，本发明涉及分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低t调节(treg)细胞的分离群体。

在第二方面，本发明涉及从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品检测和/或分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述人pbmc或淋巴细胞的群体与用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的物品(means)接触；(b)将在步骤(a)中获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触。

在第三方面，本发明涉及扩增分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法，该方法包括将分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与适用于扩增treg细胞的培养基接触的步骤。本发明还涉及产生分泌ifnγ+il-10+il-34+的人cd8+cd45rc低treg细胞的方法，包括：(i)从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺cd45rc^低treg细胞，任选从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺cd45rc^低gitr⁺treg细胞，(ii)任选冷冻并随后解冻所分离的treg细胞，和(iii)在培养中扩增所述细胞。

在第四方面，本发明涉及经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。

在第五方面，本发明涉及包含根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体(经或未经扩增)的药物组合物。

在第六方面，本发明涉及根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体(经或未经扩增)，其用作药物。

在第七方面，本发明涉及根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体(经或未经扩增)，其用于在有此需要的患者中预防或治疗移植排斥、gvhd(移植物抗宿主病)、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、针对治疗性蛋白质的不希望的免疫应答或变态反应的方法中。

在最后一个方面，本发明涉及确定患者是否处于移植排斥、gvhd、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、针对治疗性蛋白质的不希望的免疫应答或变态反应的风险中的体外方法，其包括确定在通过根据本发明所述的方法从所述患者获得的生物样品中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的存在的步骤，其中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的存在指示移植排斥、gvhd、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、针对治疗性蛋白质的不希望的免疫应答或变态反应的风险下降。

发明详述

本发明由鉴定高度抑制性的cd8⁺treg亚群而产生。具体而言，本发明人鉴定出高度抑制性的cd8⁺cd45rc^低treg的分泌ifn⁺il-10⁺il-34⁺的亚群。本发明人证明了其与经典的cd4⁺cd25^高cd127^低treg对抗供体cd4⁺cd25^-效应t细胞应答以及ifnγ、il-10和il-34在其抑制活性中的作用相比的优越潜力。此外，本发明人通过使用人源化小鼠描述了分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的cd8⁺cd45rc^低treg的特异性扩增及其在移植中作为基于细胞的疗法以抑制人皮肤移植排斥和gvhd的的潜力。

本发明的treg细胞群

在第一方面，本发明涉及cd8⁺treg的分离群体，特别是涉及分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低t调节(treg)细胞的分离群体。本发明还涉及分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低t调节(treg)细胞的分离群体，其中所述treg细胞是gitr⁺和/或foxp3⁺。

在一个实施方案中，本发明涉及cd8+cd45rc低treg的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及cd8+gitr+treg的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及cd8+foxp3+treg的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及cd8+cd45rc低gitr+treg的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及cd8+cd45rc低foxp3+treg的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及cd8⁺gitr⁺foxp3⁺treg的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及cd8⁺cd45rc^低gitr⁺foxp3⁺treg的分离群体。

在一个实施方案中，根据本发明的cd8⁺treg的分离群体分泌ifnγ、il-10和il-34中的至少一种细胞因子。因此，在一个实施方案中，根据本发明的cd8⁺treg的分离群体分泌ifnγ、或il-10、或il-34。

在另一个实施方案中，根据本发明的cd8⁺treg的分离群体分泌ifnγ、il-10和il-34中的至少两种细胞因子。因此，在一个实施方案中，根据本发明的cd8⁺treg的分离群体分泌ifnγ和il-10、或ifnγ和il-34、或il-10和il-34。

在又一个实施方案中，根据本发明的cd8⁺treg的分离群体分泌ifnγ、il-10和il-34。

在一个实施方案中，本文上述的cd8⁺treg的分离群体进一步分泌il-2和/或tgfβ-1。

具体而言，在人cd8⁺cd45rc^低t调节细胞中，本发明人鉴定了分泌ifnγ、和il-10、和il-34的cd8⁺cd45rc^低t调节细胞的亚群。因此，在一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10和il-34。

在一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10和il-34并表达gitr。在一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10和il-34并表达foxp3。在一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10、il-34和tgfβ-1。

在另一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10和il-34并表达foxp3和gitr。在一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10、il-34和tgfβ-1并表达foxp3。在另一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10、il-34和tgfβ-1并表达gitr。

在又一个实施方案中，本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌ifnγ、il-10、il-34和tgfβ-1并表达foxp3和gitr。

在一个实施方案中，本文上述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg分泌il-2。

在本发明的一个实施方案中，本文上述的cd8⁺treg的分离群体可以被冷冻以保存。在本发明的具体实施方案中，本文上述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg的分离群体可以被冷冻以保存。在一个实施方案中，本文上述的人cd8+treg的分离群体已经被冷冻并且被解冻。在具体实施方案中，本文上述的分泌ifnγ+il-10+il-34+的人cd8+cd45rc低treg的分离群体已经被冷冻并且被解冻。

如本文所用，术语“调节性t细胞”或“treg”(以前称为抑制性t细胞)是指调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性和消除自身免疫性疾病的t细胞亚群。这些细胞通常抑制或下调效应t细胞的诱导和增殖。

如本文所用，术语“群体”是指细胞群体，其中大部分(例如，至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，甚至更优选至少约80％)的细胞总数具有目标细胞的特定特征并表达目标标志物(例如，人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群包含至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，并且甚至更优选至少约80％的细胞具有高度抑制性功能并且表达目标特定标志物，例如ifnγ、il-10、il-34、foxp3、gitr或tgfβ-1⁺)。如本文所用，数字前的术语“约”是指所述数字的值的正或负10％。

如本文所用，“分离的”是指从其天然环境(例如外周血)中取出的细胞或细胞群并且是分离的、纯化的或分开的，并且至少约75％不含，80％不含，85％不含并优选约90％，95％，96％，97％，98％，99％不含与其一起天然存在但缺乏细胞分离所基于的细胞表面标志物的其他细胞。

如本文所用，术语“标志物”是指在细胞表面或细胞中表达或由细胞分泌并且能够用于帮助鉴定细胞的蛋白质、糖蛋白或任何其他分子。通常能够通过常规方法检测标志物。能够用于检测细胞表面标志物的方法的具体非限制性实例是免疫细胞化学、荧光激活细胞分选(facs)和酶分析，但也能够用rt-pcr和分子生物学方法检测蛋白质的mrna。

如本文所用，本领域众所周知的术语“cd8”(分化群8)是指用作t细胞受体(tcr)的共受体的跨膜糖蛋白。为了起作用，cd8形成二聚体，由一对cd8链组成。最常见的cd8形式由cd8-α和cd8-β链组成。天然存在的人cd8-α蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号p01732提供的氨基酸序列。天然存在的人cd8-β蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号p10966提供的氨基酸序列。

如本文所用，术语“cd45”(也称为lca或ptprc)是指以先前在streuli等人，1996中描述的不同同种型形式存在的跨膜糖蛋白。cd45的这些不同同种型在其胞外域结构上不同，所述胞外域结构来自编码部分cd45胞外区的3个可变外显子的选择性剪接。cd45的各种同种型具有不同的胞外域，但具有相同的跨膜和细胞质区段，其具有约300个氨基酸残基的两个同源的、高度保守的磷酸酶结构域。天然存在的人cd45蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号p08575提供的氨基酸序列。如本文所用，术语“cd45rc”是指酪氨酸磷酸酶cd45的外显子6剪接变体(外显子c)。cd45rc同种型在b细胞和cd4⁺和cd8⁺t细胞亚群上表达。

如本文所用，术语“干扰素γ”或“ifnγ”或“ifng”或“ii型干扰素”在本领域是众所周知的，并且指对先天免疫和适应性免疫至关重要的细胞因子。天然存在的人ifnγ蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号p01579提供的146个氨基酸的氨基酸序列。

根据本发明，本发明的分泌ifnγ的cd8⁺treg分泌至少约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000pg/mlifnγ。

如本文所用，术语“白细胞介素-10”或“il-10”在本领域中是众所周知的，并且是指抗炎细胞因子。天然存在的人il-10蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号p22301提供的178个氨基酸的氨基酸序列。

根据本发明，本发明的分泌il-10的cd8⁺treg分泌至少约0.1、0.5、1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000pg/mlil-10。

如本文所用，术语“白细胞介素-34”或“il-34”在本领域是众所周知的，并且是指促进单核细胞和巨噬细胞的增殖、存活和分化的细胞因子。天然存在的人il-34蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号q6zmj4提供的242个氨基酸的氨基酸序列。

根据本发明，本发明的分泌il-34的cd8⁺treg分泌至少约0.1、0.5、1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000pg/mlil-34。

如本文所用，术语“糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白”或“gitr”或“肿瘤坏死因子受体超家族成员18”或“tnfrsf18”在本领域是众所周知的，并且指的是tnf受体超家族的表面受体分子。天然存在的人gitr蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号q9y5u5提供的241个氨基酸的氨基酸序列。

如本文所用，术语“叉头框p3”或“foxp3”在本领域中是众所周知的，并且指的是被认为充当t调节细胞的转录因子、标志物的核蛋白。天然存在的人foxp3蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号q9bzs1提供的431个氨基酸的氨基酸序列。

如本文所用，术语“转化生长因子β1”或“tgfβ-1”或“tgfb1”在本领域中是众所周知的，并且是指在控制免疫系统中起重要作用的细胞因子。天然存在的人tgfβ-1蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号p01137提供的390个氨基酸的氨基酸序列。

根据本发明，本发明的分泌tgfβ-1的cd8⁺treg分泌至少约0.1、0.5、1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000pg/mltgfβ-1。

如本文所用，术语“白细胞介素-2”或“il-2”在本领域是众所周知的，并且是指在调节免疫激活和内环境稳定方面起着至关重要的作用的细胞因子。天然存在的人il-2蛋白质具有在uniprot数据库中以登录号p60568提供的153个氨基酸的氨基酸序列。

根据本发明，本发明的分泌il-2的cd8⁺treg分泌至少约0.1、0.5、1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000pg/mlil-2。

根据本发明，细胞因子分泌通常在用至少一种刺激剂激活后在细胞培养物中评估。刺激剂的实例包括但不限于抗原、细胞、mhc聚合物、抗体和凝集素(lectin)。在一个实施方案中，所述至少一种促进剂选自包含同种异基因抗原呈递细胞、抗cd3抗体和/或抗cd8抗体、il-2、pma+离子霉素的组。

在一个实施方案中，细胞因子分泌通常在培养6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天之后、优选在培养12、13、14、15、16或17天之后和更优选在培养14天之后进行评估。在另一个实施方案中，细胞因子分泌通常在以约2x10⁵、3x10⁵、或4x10⁵个小细胞/ml、优选以约2.5x10⁵、3x10⁵、或3.5x10⁵个小细胞/ml、更优选以约3x10⁵个小细胞/ml开始的培养物中进行评估。在一个实施方案中，细胞因子分泌在以约3.5x10⁵个小细胞/ml开始的培养物中在培养14天之后进行评估。

在本发明的一个实施方案中，本发明的cd8⁺人treg(并且特别是上文所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低t调节(treg)细胞)可以被遗传修饰以编码所期望的表达产物，如下文将进一步描述的。

术语“遗传修饰的”表示细胞包含不是天然存在于本发明的未经修饰的cd8⁺人treg、特别是不是天然存在于分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞中的核酸分子，或者存在于本发明的所述cd8⁺人treg、特别是存在于分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞中的非天然状态中的核酸分子(例如经扩增的)。核酸分子可能已被引入到所述细胞或其祖先中。

许多方法可用于遗传修饰本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞，如病毒介导的基因递送、非病毒介导的基因递送、裸dna、物理处理等。为此，通常将核酸并入载体中，如重组病毒、质粒、噬菌体、附加体、人工染色体等。携带基因的核酸可以被引入细胞的手段的实例包括但不限于显微注射、电穿孔、转导或使用deae-葡聚糖、脂质体转染、磷酸钙或本领域技术人员已知的其他程序的转染方法。

在本发明的具体实施方案中，通过使用载体颗粒如病毒载体(或重组病毒)或病毒样颗粒(vlp)对本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞进行遗传修饰。在该实施方案中，例如，将异源核酸引入重组病毒，其然后用于感染本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞。可以使用不同类型的重组病毒，特别是重组反转录病毒。反转录病毒是优选载体，因为反转录病毒感染导致稳定整合到细胞的基因组中。这是一个重要的特性，因为在注射入受试者后体外或体内的淋巴细胞扩增需要转基因在分离过程中保持稳定以便在每个细胞分裂时传播。可以使用的反转录病毒类型的实例是来自肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒家族的反转录病毒。肿瘤病毒家族的具体实例是慢肿瘤病毒、非癌基因承载体，如momlv、alv、blv或mmtv，和快肿瘤病毒，如rsv。来自慢病毒家族的实例是hiv、siv、fiv或caev。

用于构建缺陷重组反转录病毒的技术已经被充分描述于文献中(wo89/07150、wo90/02806和wo94/19478)。这些技术通常包括将包含转基因的逆转录病毒载体引入合适的包装细胞系，然后回收产生的病毒，所述病毒在其基因组中包含转基因。本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞可以使用各种操作方案用重组病毒进行感染，例如通过与病毒上清、与纯化的病毒孵育，通过将所述treg细胞与病毒包装细胞一起共培养，通过transwell技术等。

如本文所用，术语“病毒样颗粒(vlp)”是指类似病毒颗粒的结构。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性的，因为它缺少全部或部分病毒基因组，通常并且优选缺少病毒基因组的全部或部分复制性和感染性组分。如本文所用，术语“非复制性”是指不能复制包括在vlp中或不在其中的基因组。可以根据本领域已知的技术和例如如以wo02/34893公开的国际专利申请中所述制备vlp。

用于遗传修饰本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的核酸可以编码各种生物活性产品，包括多肽(例如蛋白质、肽等)、rna等。在具体实施方案中，所述核酸编码具有免疫抑制活性的多肽。在另一实施方案中，所述核酸编码对细胞有毒性或者在一定条件下有毒性的多肽。优选实例包括胸苷激酶(其在核苷类似物存在下赋予毒性)，例如hsv-1tk、胞嘧啶脱氨酶等。

另一类优选的核酸是编码t细胞受体或其亚单位或其功能等价物的那些，例如对目标抗原特异性的嵌合抗原受体(car)或包含自身抗原的嵌合自身抗体受体(caar)。例如，特异性针对抗原的重组tcr或car的表达产生本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞，其能够更特异和有效地作用于效应t细胞以抑制有需要的患者的免疫应答。已经广泛描述了嵌合抗原受体(car)设计的基本原理(例如sadelain等人，2013)。

car包含细胞外抗原识别部分，其通常通过间隔物/铰链和跨膜结构域与细胞内信号传导结构域连接。“第一代”car的细胞内信号传导结构域仅包含t细胞激活部分。“第二代”car的细胞内结构域包含与激活部分例如cd3ζ串联的共刺激部分。共刺激结构域的实例包括但不限于icos、ox40(cd134)、cd28、4-1bb(cd137)、cd27和dap10。“第三代”car的细胞内结构域包含与激活部分串联的两个共刺激结构域，例如cd28，肿瘤坏死因子受体(tnfr)如ox40或4-1bb和cd3ζ的组合。

通常通过将细胞外抗原结合结构域与源自t细胞受体的cd3-ζ链的细胞内信号传导结构域，与共刺激内结构域串联以支持存活和增殖信号来获得car。因为car修饰的t细胞功能不依赖于患者的mhc并且能够易于被产生用于临床用途，如下所述的用基于car的方法靶向致病性抗原是有用的。

caar包含与细胞内信号传导结构域融合的细胞外自身抗原，例如涉及自身免疫性疾病的自身抗原。caar的细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于t或nk受体信号传导结构域如cd137cd3ζ信号传导结构域。

在一个实施方案中，本发明的cd8+treg被遗传修饰并且表达与细胞内信号传导分子连接的至少一种car、至少一种caar和/或至少一种天然受体。car的实例包括但不限于第一代car、第二代car、第三代car、包含超过三个信号传导结构域的car(共刺激结构域和激活结构域)和抑制性car(icar)。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及本发明的cd8⁺人treg细胞的分离群体、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其中所述treg细胞是经遗传修饰的包含嵌合抗原受体的treg细胞。

根据本发明，识别目标抗原的car的细胞外结构域可以包含结合所述抗原的受体或受体片段，诸如抗体或其抗原结合片段。根据本发明，car的细胞外结构域可以包含人抗体或源自任何其他物种的抗体。

如本文所用，术语“抗体片段”是指保留与抗原表位特异性相互作用的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括但不限于fab，fab'，f(ab')2，fv片段，scfv抗体片段，二硫键连接的fv(sdfv)，由vh和ch1结构域组成的fd片段，线性抗体，诸如sdab(vl或vh)的单结构域抗体，骆驼抗体vhh结构域，由抗体片段形成的多特异性抗体，所述多特异性抗体例如包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段，和分离的cdr或抗体的其他表位结合片段。

在另一实施方案中，本发明的cd8+treg被遗传修饰并且缺少功能性t细胞受体(tcr)和/或人白细胞抗原(hla)例如hlai类和/或hlaii类的表达。在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的缺少功能性tcr和/或hla的cd8+treg是同种异基因treg。

用于捕获本发明的treg细胞的手段：

如上所述的本发明的cd8⁺人treg的亚群、特别是cd8⁺cd45rc^低treg细胞的亚群可以通过其细胞表面标志物和它们产生ifnγ、il-10和il-34的能力进行操作性表征。

在第二方面，本发明因此涉及从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品检测和/或分离如上所述的本发明的cd8⁺人treg亚群、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述人pbmc或淋巴细胞的群体与用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的物品接触；(b)将在步骤(a)中获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触。

本发明还涉及从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品检测和/或分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法，其中所述treg细胞任选为gitr+和/或foxp3⁺，所述方法包括以下步骤：(a)将所述人pbmc或淋巴细胞的群体与用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的物品、任选与用于分离gitr⁺和/或foxp3⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的物品接触；(b)将在步骤(a)中获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触。

在一个实施方案中，本发明的方法的步骤(b)包括将步骤(a)中获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与用于分离还表达gitr、foxp3和tgfβ-1中至少一种的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触。

在另一个实施方案中，本发明的方法的步骤(b)包括将步骤(a)中获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与用于分离还表达foxp3和gitr、或foxp3和tgfβ-1、或gitr和tgfβ-1的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触。

在又一个实施方案中，本发明的方法的步骤(b)包括将步骤(a)中获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与用于分离还表达gitr和foxp3和tgfβ-1的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触。

根据一个实施方案，本发明的方法的步骤(a)的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群的分离不要求激活本发明的cd8⁺treg细胞。根据一个实施方案，在用至少一种刺激剂刺激步骤(a)获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体之后进行本发明的方法的步骤(b)的本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离。刺激剂的实例是上文中描述的那些刺激剂。

如本文所用，术语“生物样品”是指含有外周血单核细胞“pbmc”或淋巴细胞的任何体液或组织。在本发明的范围内，“含有pbmc或淋巴细胞的液体”包括血液(全血样品、血清样品或血浆样品)和滑液。“含淋巴细胞的组织”包括脾、胸腺、淋巴结、骨髓、派尔集合淋巴结和扁桃体。

在一个实施方案中，本发明的方法用于从诱导的多能干细胞(ipsc)或ipsc衍生的cd34⁺细胞获得和/或分离上文所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞。在本发明的范围内，ipsc或ipsc衍生的cd34⁺细胞的培养物可以例如从含有人外周血单核细胞(pbmc)的生物样品中获得。

在步骤(a)和(b)中，可以通过利用技术人员可用的用于检测特定免疫细胞群的多种方法来分离目标人细胞群，所述方法包括免疫选择技术，例如使用流式细胞术方法的高通量细胞分选，使用标记有磁珠、可生物降解的珠、不可生物降解的珠的抗体的亲和方法以及这些方法的组合。

如本文所用，术语“流式细胞术方法”是指通过将目标细胞悬浮在流体流中并使它们通过电子检测装置来计数目标细胞的技术。流式细胞术方法允许同时多参数分析每秒多达数千个粒子的物理和/或化学参数，例如荧光参数。现代流式细胞仪通常具有多个激光器和荧光检测器。流式细胞术技术的一个常见变化是基于其性质对颗粒进行物理分选，以便使用“荧光激活细胞分选”来纯化或检测目标群体。

如本文所用，“荧光激活细胞分选”(facs)是指这样的流式细胞术方法，其用于基于每个细胞的特定光散射和荧光特性将来自生物样品的异质细胞混合物分拣到两个或更多个容器中，一次一个细胞。facs可快速、客观和定量记录来自单个细胞的荧光信号以及特别感兴趣的细胞的物理分离。因此，facs能够与本文所述的方法一起使用以分离例如人类cd8⁺treg细胞。

或者，可以使用基于珠的分选方法如磁珠来分离本发明的人cd8⁺人treg、特别是本发明的cd8⁺cd45rc^低treg细胞。

通过使用这样的方法，细胞能够相对于特定的细胞表面标记被阳性或阴性分开和分离。如本文所定义的，“阳性选择”是指导致分离和检测表达特定细胞表面标志物的细胞的技术，而“阴性选择”是指导致分离和检测没有表达特定细胞表面标志物的细胞的技术。在一些实施方案中，技术人员可以通过使用本领域已知的标准技术如市售的珠缀合试剂盒来用抗体包被珠粒。在一些实施方案中，进行阴性选择步骤以去除表达一种或多种谱系标志物的细胞，接着进行荧光激活细胞分选以阳性选择目标人treg细胞(即如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg)。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括：(a)将人pbmc或淋巴细胞的群体与用于耗尽非cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触；(b)将在步骤(a)中获得的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的物品接触。

通常，用于分离细胞群体例如人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是结合至合适的细胞表面分子或标志物的伴侣(例如抗体)。

特异性的结合伴侣包括捕获部分和标记部分。捕获部分是直接或间接连接细胞和产物的部分。标记部分是附接至产物的部分，并且可以是直接或间接标记的。特异性的结合伴侣包括任何部分，其中在产物及其结合伴侣之间存在相对高的亲和力和特异性，并且产物:伴侣复合物的解离相对较慢，使得在标记或细胞分离技术过程中检测到产物:伴侣复合物。

捕获部分可以任选通过连接部分偶联至锚定物品(“锚定部分”)，并且还可以包括连接部分，这增加了可用捕获部分的数量并因此增加了捕获产物(例如支化聚合物，包括例如改性葡聚糖分子，聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)的可能性。

能够缀合至捕获部分例如抗体的标记部分是本领域技术人员众所周知的。例如，放射性同位素如³²p、³⁵s或³h；荧光或发光标志物如荧光素(fitc)、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白、多甲藻素-叶绿素蛋白复合物(percp)、6-羧基荧光素(6-fam)、2'、7'-二甲氧基-4'、5'-二氯-6-羧基荧光素(joe)、6-羧基-x-罗丹明(6-rox)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(hex)、5-羧基荧光素(5-fam)或n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)；抗体或抗体片段如f(ab)2片段；亲和标记如生物素、抗生物素蛋白、琼脂糖、骨形态发生蛋白(bmp)、基质结合、半抗原；和酶或酶底物如碱性磷酸酶(ap)和辣根过氧化物酶(hrp)。

合适的细胞分子包括但不限于人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞表面标志物，如cd3(t细胞(激活))、cd8和cd45rc以及其他cd标志物或特异性针对这些cd8⁺t细胞的细胞粘附分子。

在本发明的一个实施方案中，步骤(a)的用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的抗体。

在本发明的一个实施方案中，步骤(a)的用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是由单克隆抗人cd3的抗体、单克隆抗人cd8的抗体和单克隆抗人cd45rc的抗体组成的至少三种抗体的组合，其任选进一步包含抗人gitr的抗体(优选单克隆抗人gitr抗体)。

在本发明的一个实施方案中，步骤(a)的用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是由单克隆抗人cd3的抗体、单克隆抗人cd8的抗体和单克隆抗人cd45rc的抗体组成的至少三种抗体的组合，其任选进一步包含抗人gitr的抗体(优选单克隆抗人gitr抗体)和/或抗人foxp3抗体(优选单克隆抗人foxp3抗体)。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。根据本发明的“抗x抗体”或“x抗体”是可以与x特异性结合的抗体。

在本发明的具体实施方案中，用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是抗人cd3抗体、抗人cd8抗体和抗人cd45rc抗体，优选单克隆抗人cd3抗体、单克隆抗人cd8抗体和单克隆抗人cd45rc抗体。本发明所考虑的结合人cd3抗原的抗体的实例包括单克隆抗体okt3、ucht1、hit3a、s4.1和sk7。本发明所考虑的结合人cd8抗原的抗体的实例包括单克隆抗体c8/144b、sk1、3b5、okt8、bw135/80和rpa-t8。本发明所考虑的结合人cd45rc抗原的抗体的实例包括单克隆抗体mt2和rp1/12。

在本发明的一个实施方案中，步骤(b)的用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的抗体。

更具体地，用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的抗体是双特异性抗体，其结合本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞分泌的细胞因子之一(即ifnγ、il-10和il-34)并结合特异性针对t细胞、优选针对cd8⁺t细胞的细胞表面分子(例如cd3、cd8、cd45)。本发明考虑的双特异性抗体的实例包括结合人ifnγ和人cd45的双特异性抗体、结合人ifnγ和人cd3的双特异性抗体、结合人ifnγ和人cd8的双特异性抗体、结合人il-10和人cd45的双特异性抗体、结合人il-10和人cd3的双特异性抗体、结合人il-10和人cd8的双特异性抗体、结合人il-34和人cd45的双特异性抗体、结合人il-34和人cd3的双特异性抗体、结合人il-34和人cd8的双特异性抗体。例如，ifnγ或il-10分泌测定检测试剂盒是市售可得的(miltenyibiotec)。

在一个实施方案中，为了分离如上所述的人分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体，本发明的方法的步骤(b)包括组合至少两种双特异性抗体，所述双特异性抗体选自由结合ifnγ和结合特异性针对t细胞、优选针对cd8⁺t细胞的细胞表面分子(例如cd3、cd8、cd45)的双特异性抗体、结合il-10和结合特异性针对t细胞、优选针对cd8⁺t细胞的细胞表面分子(例如cd3、cd8、cd45)的双特异性抗体和结合il-34和结合特异性针对t细胞、优选针对cd8⁺t细胞的细胞表面分子(例如cd3、cd8、cd45)的双特异性抗体组成的组。

在分泌ifnγ⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞中，只有10或20％是il-10⁺。根据申请人获得的结果，人cd8⁺cd45rc^低treg细胞通常共表达il-10和il-34。因此，在一个实施方案中，用于从步骤(a)分离的cd8⁺cd45rc^低treg分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg的双特异性抗体的组合包括至少结合ifnγ和结合特异性针对t细胞的细胞表面分子的双特异性抗体和结合il-10和结合特异性针对t细胞的细胞表面分子的双特异性抗体或结合il-34和结合特异性针对t细胞的细胞表面分子的双特异性抗体。

在具体实施方案中，使用结合ifnγ和结合特异性针对t细胞的细胞表面分子的双特异性抗体、结合il-10和结合特异性针对t细胞的细胞表面分子的双特异性抗体和结合il-34和结合特异性针对t细胞的细胞表面分子的双特异性抗体以分离目标群体。

双特异性抗体(也称为双功能抗体)具有针对第一抗原的至少一个抗原识别位点和针对第二抗原的至少一个抗原识别位点。这样的抗体可以通过本领域已知的重组dna方法或通过化学方法产生。化学产生的双特异性抗体包括但不限于已被还原和重新形成以便保留其二价特征的抗体和已经化学偶联使得它们对于每种抗原具有至少两个抗原识别位点的抗体。双特异性抗体包括能够识别两种不同抗原的所有抗体或抗体的缀合物、或抗体的聚合形式。抗体可以固定在聚合物或颗粒上。

在国际专利申请wo94/09117中已经充分描述了用于获得这样的双特异性抗体的技术。

在一个实施方案中，为了分离如上所述的人分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体，本发明的方法的步骤(b)包括使用结合ifnγ、结合il-10和结合特异性针对t细胞的细胞表面分子的三特异性抗体。

在wo2016105450中已经描述了共同结合三种抗原的三特异性抗体。

在本发明的一个实施方案中，步骤(b)的用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是用于分离如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的抗体和用于检测gitr和/或foxp3和/或tgfβ-1的抗体。

更具体地，用于检测gitr的抗体是人抗gitr抗体。结合人gitr抗原的抗体的实例包括但不限于单克隆抗体mab689-100、621、ebioaitr、110416。

更具体地，用于检测foxp3的抗体是人抗foxp3抗体。结合人foxp3抗原的抗体的实例包括但不限于单克隆抗体pch101、259d、206d和236a/e7。

更具体地，用于检测tgfβ-1的抗体是人抗tgfβ-1抗体。结合人tgfβ-1抗原的抗体的实例包括但不限于单克隆抗体mab2463、tw4-6h10、19d8和ebio16tfb。

在本发明的一个实施方案中，步骤(b)的用于分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品是用于分离如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的抗体和用于检测il-2的抗体。

更具体地，用于检测il-2的抗体是人抗il-2抗体。结合人il-2抗原的抗体的实例包括但不限于单克隆抗体mq1-17h12和5344.111。

在一个实施方案中，伴随进行本发明的方法的步骤(a)和步骤(b)。换言之，在一个实施方案中，本发明的用于从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品中检测和/或分离如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法包括将所述人pbmc或淋巴细胞群体与用于分离人分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg群体的物品接触。合适的物品的实例是上文中描述的那些物品。

本发明还涉及用于产生根据本发明的cd8⁺cd45rc^低treg群体的体外或离体方法，其包括在树突细胞群体的存在下、优选在浆细胞样树突细胞(pdc)的存在下用包含来源于ii类mhc分子的分离肽或其功能片段的培养基培养cd8⁺t细胞群体的步骤。

在一个实施方案中，来源于ii类mhc分子的分离肽具有5至40个氨基酸范围内的长度并且包含来自氨基酸序列：reeyarfdsdvgeyr(seqidno:1)或其功能保守变体的至少5个连续氨基酸。优选地，来源于ii类mhc分子的分离肽具有15至40个氨基酸范围内的长度并且包含氨基酸序列：reeyarfdsdvgeyr(seqidno:1)或其功能保守变体。

在另一个实施方案中，来源于ii类mhc分子的分离肽具有11至16个氨基酸范围内的长度并且包含氨基酸序列：sdvgeyr(seqidno:18)或其功能保守变体。

根据本发明，术语“功能保守变体”是指这样的肽，其包含与参考肽(例如seqidno:1或seqidno:18)具有至少约70％的同一性，甚至更优选至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％，并且其仍然具有功能，即仍然能够以与参考肽(例如seqidno:1或seqidno:12)基本上相同的方式诱导cd8⁺cd45rc^低treg群体的产生。

优选地，所述来源于ii类mhc分子的肽选自由以下组成的组：

reeyarfdsdvgeyr(seqidno:1)；

nreeyarfdsdvgeyr(seqidno:2)；

reeyarfdsdvgefr(seqidno:3)；

reeyvrfdsdvgeyr(seqidno:4)；

qeeyarfdsdvgeyr(seqidno:5)；

reeyarfdsdvgvyr(seqidno:6)；

nreeyarfdsdvgefr(seqidno:7)；

nreeyvrfdsdvgeyr(seqidno:8)；

nqeeyarfdsdvgeyr(seqidno:9)；

nreeyarfdsdvgvyr(seqidno:10)；

rllarliynreeyarfdsdvgeyravtelgrpsaeyrnkq(seqidno:11)；

ylrydsdvgeyravte(seqidno:12)；

dsdvgeyravtelgrp(seqidno:13)；

ylrydsdvgeyr(seqidno:14)；

ylrydsdvgeyrav(seqidno:15)；

sdvgeyravtelgr(seqidno:16)；

lrydsdvgeyravte(seqidno:17)。

在一个实施方案中，所述方法包括用包含mhc/肽多聚体的培养基培养cd8⁺t群体的步骤，所述mhc/肽多聚体包含如上所述的来源于ii类mhc分子的肽。

根据本发明，术语“mhc/肽多聚体”是指由装载有来自如上所述的ii类mhc分子的肽的主要组织相容性复合体(mhc)蛋白亚单位组成的稳定的多聚体复合物。所述mhc/肽多聚体(本文也称为mhc/肽复合体)包括但不限于mhc/肽二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。优选地，所述mhc/肽多聚体是四聚体。

所述的来源于ii类mhc分子的肽和mhc/肽多聚体描述于wo2015150491和wo2015150492中，其通过引用并入本文。

富集方法/耗尽方法/试剂盒

本发明还涉及用于富集如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的方法，包括：

-检测在如上所述的含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品中的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的cd8⁺cd45rc^低treg细胞，

-选择所述细胞，

由此获得富集分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。

因此，在一个实施方案中，用于富集如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的方法包括：

-将含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品与用于分离人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体的物品接触，

-从cd8⁺cd45rc^低treg细胞检测并选择分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞，

由此获得富集分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。

用于检测和/或选择分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法如上所述。例如，用于分开、分离或选择细胞的方法包括但不限于使用抗体包被的磁珠的磁选(schwartz等人的美国专利号5,759,793)和使用附接至固体基质(例如板)的抗体的亲和层析或“淘选”。提供精确分离的其他技术包括荧光激活细胞分选仪(facs)，其可以具有不同程度的复杂性，例如具有多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道或阻抗通道。可以通过用与死细胞相关的染料例如(碘化丙啶、lds)进行选择来消除死细胞。可以通过例如淘洗、溶血或ficoll-paque梯度去除红细胞。可以使用本领域众所周知的不会对选定细胞的生存能力造成不适当损害的任何技术。

根据本发明，用于富集分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的方法包括：

-将含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品与结合非cd8⁺细胞的标志物的至少一种试剂接触并由此耗尽非cd8⁺细胞，

-如上所述检测分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞并选择它们，

由此获得富集分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。

在一个实施方案中，用于富集分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的方法包括：

-将含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品与结合非cd8⁺细胞的标志物的至少一种试剂接触并由此耗尽非cd8⁺细胞，

-如上所述检测并分离cd8⁺cd45rc^低treg细胞，以及

-从cd8⁺cd45rc^低treg细胞检测并选择如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞，

由此获得富集分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。

结合非cd8⁺细胞的标志物的实例包括但不限于cd4、cd14、cd16、cd19。

结合所述标志物的优选试剂是抗体。在一个实施方案中，抗体缀合至荧光色素或磁性颗粒。在另一实施方案中，通过流式细胞术、荧光激活细胞分选、磁性选择、亲和层析或淘选或其组合进行细胞选择。

在另一方面，本发明涉及分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的富集群体。所述分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的富集群体可以通过如上所述的用于富集分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的方法获得。

如本文所用，分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的富集群体是这样的群体，其中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数高于原始获得的细胞群体中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数。尽管可能，分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的富集群体不需要含有分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的同质群体。在具体实施方案中，组合物中所述细胞的至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞。在另一个实施方案中，富集群体中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数是富集前分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数的至少两倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。

富集方法可以基于与富集过程中的每一步相关的富集水平而变化。分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的富集水平和纯度百分数取决于许多因素，包括但不限于供体，供体的细胞/组织来源和疾病状态。在具体的实施方案中，分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞富集至少约2倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍、约100倍、约105倍、约110倍、约115倍、约120倍、约130倍、约140倍、约150倍、或约200倍。

本发明还涉及用于耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的方法，包括：

-在如上所述的含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品中检测分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞，

-耗尽所述细胞，

-由此获得耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体。

用于检测和/或选择分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法如上所述。

在另一方面，本发明涉及耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体。所述耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体可以通过如上所述的用于耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的方法获得。

如本文所用，耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体是这样的群体，其中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数低于原始获得的细胞群体中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数。

在一个实施方案中，耗尽群体中分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数是耗尽前分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的百分数的至多0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.25倍、0.2倍、0.15倍、0.1倍。

已经显示调节性t细胞的耗尽增强癌症患者中的疫苗介导的免疫(dannull等人，2005,115(12):3623-3633)。因此，在本发明的另一个实施方案中，提出了本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的耗尽可以用于治疗癌症或传染性疾病的细胞治疗中，其中所述treg细胞可能对治疗有害或有毒。例如，在癌症治疗中，在疫苗接种/免疫治疗操作方案之前短暂耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞可能是有趣的，所述短暂耗尽是通过根据本发明的耗尽方法通过装置离体耗尽患者的血液并立即将其重新注射到患者而获得的。因此，在所述实施方案中，从患者血液耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞是通过装置离体进行的。

本发明还涉及用于鉴定或分离分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体、或用于富集或耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测cd3、cd8、cd45rc的细胞表面表达的试剂和用于检测ifnγ和il-10和/或il-34的分泌的物品。

优选地，所述试剂是抗体。更优选地，这些抗体缀合至荧光色素或磁性颗粒。

在一个具体实施方案中，所述试剂是缀合至细胞毒性药物如抗微管剂、烷化剂和dna小沟结合剂的抗体。细胞毒性药物的实例包括但不限于丝裂霉素、奥瑞他汀和美登素衍生物。

在另一实施方案中，所述试剂是缀合至抗生素的抗体。抗生素的实例包括但不限于氯霉素，红霉素，林可霉素，夫西地酸，链霉素，氨基糖苷类抗生素，四环素，多粘菌素，磷霉素，万古霉素，利托菌素，杆菌肽，短杆菌肽，青霉素和头孢菌素。

在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于检测foxp3表达和/或gitr表达和/或tgfβ-1表达和/或il-2表达的试剂。优选地，所述试剂是抗体。更优选地，所述抗体缀合至荧光色素。

用于扩增本发明的treg细胞的手段(means)：

在第三方面，本发明涉及扩增如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法，该方法包括培养分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体的步骤，优选地，将分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与适用于扩增treg细胞的培养基接触的步骤。

在一个实施方案中，本发明涉及扩增分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法，所述treg细胞任选为gitr+和/或foxp3+，该方法包括将分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与适用于扩增treg细胞的培养基接触的步骤。

在一个实施方案中，本发明涉及扩增表达gitr、foxp3和tgfβ-1中至少一种的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的方法，该方法包括将分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体与适用于扩增treg细胞的培养基接触的步骤。

在一个实施方案中，将本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体冷冻并且随后解冻，然后将细胞与适用于扩增treg细胞的培养基接触。本发明人证实，本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞能够有效扩增，解冻后更是如此。实际上，本发明人观察到本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞解冻时比新鲜分选时更有效地增殖。

如本文所用，术语“扩增”是指转化和/或扩增给定细胞群体(例如免疫细胞如t细胞)的过程。优选通过在抗原特异性刺激剂的存在下培养包含t细胞的细胞群体来进行t细胞的扩增，所述抗原特异性刺激剂是例如抗原、细胞(如在同种异体移植的情况下的供体细胞)、mhc聚合物、抗体(如抗cd3抗体和/或抗cd28抗体)、凝集素(如pha)等。扩增也可以要求在细胞因子(如il-15、il-12、il-4、il-7、il-2、ifnγ、il-34和促炎细胞因子(诸如例如il-1(特别是il-1β)、il-6和tnfα))的存在下培养t细胞。

如本文所用，术语“培养基”是指用于维持细胞群体或培养细胞群体的培养基，其含有维持细胞活力和支持增殖的营养素。培养基可以含有合适组合的以下任意：盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代品、以及其它组分如生长因子、细胞因子等。通常用于特定细胞类型的培养基是本领域技术人员已知的。本发明的培养基可以基于市售可得培养基，如来自invitrogen的rpmi1640。

在一个实施方案中，适用于扩增本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg的培养基包含至少一种刺激剂。在一个实施方案中，所述至少一种刺激剂选自包含抗原、细胞、mhc聚合物、抗体和凝集素的组。在一个实施方案中，所述至少一种刺激剂是抗原特异性的并且选自由抗原、细胞、mhc聚合物和抗体组成的组。在一个实施方案中，所述至少一种刺激剂选自包含同种异基因抗原呈递细胞、抗cd3抗体和/或抗cd8抗体、pma+离子霉素的组。

在一个实施方案中，适用于扩增本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg的培养基包含一定量的至少一种细胞因子。可以存在于适用于扩增treg的培养基中的细胞因子的范例包括但不限于il-15、il-12、il-4、il-7、il-2、ifnγ、il-34和促炎细胞因子(如il-1(特别是il-1β)、il-6和tnfα)

在一个实施方案中，适用于扩增treg细胞的培养基包含一定量的白介素-2(il-2)和/或一定量的白介素-15(il-15)。

在具体实施方案中，il-2是人白介素-2(hil-2)，优选重组人白介素-2(rhil-2)。应该进一步注意的是，rhil-2是药物用途上市售可得的。合适的商业形式包括例如重组人il-2组合物

在具体实施方案中，il-15是人白介素-15(hil-15)，优选重组人白介素-15(rhil-15)。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-2：100至10000u/ml，优选500至5000u/ml，更优选1000u/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-15：1至100ng/ml，优选2.5至50ng/ml，更优选10ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-12：0.01至500ng/ml，优选1至50ng/ml，更优选5ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-4：0.01至500ng/ml，优选1至20ng/ml，更优选5ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-7：0.01至500ng/ml，优选2.5至50ng/ml，更优选10ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加ifnγ：0.01至500ng/ml，优选5至100ng/ml，更优选20ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-34：0.01至500ng/ml，优选10至100ng/ml，更优选50ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-1：0.01至500ng/ml，优选2.5至50ng/ml，更优选10ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加il-6：0.01至500ng/ml，优选5至100ng/ml，更优选20ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加tnf：0.01至500ng/ml，优选5至100ng/ml，更优选20ng/ml。

通常，以下面的浓度范围向本发明的培养基中添加tgfβ：0.01至500ng/ml，优选0.1至10ng/ml，更优选1ng/ml。

通常，用目标培养基培养本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞应进行至少6天，诸如例如至少6天至不超过15天，或至少6天至不超过20天，或至少6天至不超过6-8周，优选14天。在一个实施方案中，用目标培养基培养本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞应进行6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。在一个实施方案中，用目标培养基培养本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞应进行1周、2周、3、4、5、6、7、8、9、或10周或更多。

在一个实施方案中，细胞因子优选il-2和/或il-15在培养本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的第0天添加至培养基。在另一实施方案中，细胞因子优选il-2和/或il-15在例如第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20天再添加至培养基中一次、两次或三次或四次或更多次。在一个实施方案中，细胞因子优选il-2和/或il-15在培养本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的第0天和在第5、6、7、8或9天添加至培养基，优选在第0天和第7天。在另一实施方案中，细胞因子优选il-2和/或il-15添加至培养基三次，优选在第0天和另外两次。在另一实施方案中，细胞因子优选il-2和/或il-15添加至培养基四次，优选在第0天和另外三次。在另一实施方案中，细胞因子优选il-2和/或il-15添加至培养基5次，优选在第0天和另外4次，诸如例如在第0、6、13、16和18天。在一个实施方案中，细胞因子优选il-2和/或il-15在第0天和每个2、3或4天添加至培养基，直到培养结束。

在一个实施方案中，适用于扩增treg的培养基包含一定量的至少一种目标抗原。通常，以1μg/ml的浓度将给定抗原添加至本发明的培养基。

在具体实施方案中，扩增是多克隆扩增。可以通过使用抗cd3抗体和抗cd28抗体和/或同种异基因抗原呈递细胞(apc)获得多克隆扩增。

在一个实施方案中，0.1至10μg/ml，优选0.25至4μg/ml，更优选1μg/ml的抗cd3抗体和/或0.1至10μg/ml，优选0.25至4μg/ml，更优选1μg/ml的抗cd28抗体添加至培养基。

在一个实施方案中，同种异基因抗原呈递细胞(apc)以范围为1:1至1:10、优选1:2至1:6和更优选1:4的treg:apc的比添加至培养基。

在本发明的环境下，然后可以用目标抗原脉冲刺激如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体(扩增或未扩增)以获得抗原特异性的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞，所述抗原以有效量提供，所述有效量“致敏”本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，从而获得特异性针对所述抗原的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体。实际上，这样扩增的抗原特异性的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞可用于预防或治疗不需要的免疫应答，例如涉及自身免疫性疾病的那些、针对治疗蛋白的免疫反应和/或变态反应。

因此，应当获得特异性针对与这些待治疗疾病相关的抗原(致病性抗原)的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体。因此，目标抗原选自由自身抗原、异型抗原、来自普通人类饮食的食物抗原、炎性抗原和变应原组成的组。

术语“自身抗原”是指衍生自个体的蛋白质的免疫原性肽。举例说明，它可以是以下非限制性列表中的自身抗原：乙酰胆碱受体、肌动蛋白、腺嘌呤核苷酸转运体、肾上腺素受体、芳香族l-氨基酸脱羧酶、去唾液酸糖蛋白受体、杀菌/通透性增加蛋白(bpi)、钙敏感受体、胆固醇侧链切割酶、iv型胶原链、细胞色素p4502d6、结蛋白、桥粒粘蛋白-1、桥粒粘蛋白-3、f-肌动蛋白、gm-神经节苷脂、谷氨酸脱羧酶、谷氨酸受体、h/katp酶、17-α-羟化酶、21-羟化酶、ia-2(icas12)、胰岛素、胰岛素受体、1型内因子、白细胞功能抗原1、髓鞘相关糖蛋白、髓鞘碱性蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白、肌球蛋白、p80-coilin、丙酮酸脱氢酶复合体e2(pdc-e2)、钠碘转运体、sox-10、甲状腺和眼肌共享蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、促甲状腺激素受体、组织型转谷氨酰胺酶、转录辅激活物p75、色氨酸羟化酶、酪氨酸酶、酪氨酸羟化酶、acth、氨酰-trna-组氨酰合成酶、心磷脂、碳酸酐酶ii、着丝粒相关蛋白、dna依赖性核小体激发atp酶、核仁纤维蛋白、纤连蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶、β2-糖蛋白i、高尔基体蛋白(95、97、160、180)、热休克蛋白、半桥粒蛋白180、组蛋白h2a、h2b、角蛋白、ige受体、ku-dna蛋白激酶、ku-核蛋白、la磷蛋白、髓过氧化物酶、蛋白酶3、rna聚合酶i-iii、信号识别蛋白、拓扑异构酶i、微管蛋白、波形蛋白、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(osp/密封蛋白11)、2’,3'-环核苷酸3-磷酸二酯酶(cnp酶)、bp抗原1(bpag1-e)、转醛醇酶(tal)、人线粒体自身抗原pdc-e2(novo1和2)、ogdc-e2(novo3)、和bcoadc-e2(novo4)、大疱性类天疱疮(bp)180、层粘连蛋白5(ln5)、dead-框蛋白48(ddx48)或胰岛瘤相关抗原-2。

术语“来自普通人类饮食的食物抗原”是指免疫原性肽，其来自人类常见的食物，例如以下非限制性列表的食物抗原：牛抗原如脂质运载蛋白，ca结合s100，α-乳清蛋白，乳球蛋白如β-乳球蛋白，牛血清白蛋白，酪蛋白。食物抗原还可以是大西洋鲑鱼抗原如小清蛋白，鸡抗原如卵类粘蛋白，卵清蛋白，ag22，伴清蛋白，溶菌酶或鸡血清白蛋白，花生，虾抗原如原肌球蛋白，小麦抗原如凝集素(agglutinin)或麦醇溶蛋白，芹菜抗原如芹菜肌动蛋白抑制蛋白(profilin)，胡萝卜抗原如胡萝卜肌动蛋白抑制蛋白，苹果抗原如奇异果甜蛋白(thaumatin)，苹果脂质转移蛋白，苹果肌动蛋白抑制蛋白，梨抗原如梨肌动蛋白抑制蛋白，异黄酮还原酶，油梨抗原如内切几丁质酶，杏抗原如杏脂质转移蛋白，桃抗原如桃脂质转移蛋白或桃肌动蛋白抑制蛋白，大豆抗原如hps，大豆肌动蛋白抑制蛋白或(sam22)pr-10蛋白。

术语“炎性抗原”是指髓鞘碱性蛋白(mbp)，髓鞘相关糖蛋白(mag)，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)，蛋白脂质蛋白(plp)，少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白(omgp)，髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)，少突胶质细胞特异性蛋白(osp/密封蛋白1)，热休克蛋白，少突胶质细胞特异性蛋白(osp)，nogoa，糖蛋白po，外周髓鞘蛋白22(pmp22)，2',3'-环核苷酸3-磷酸二酯酶(cnp酶)，瓜氨酸取代的环状和线性聚丝蛋白肽，ii型胶原肽，人软骨糖蛋白39(hcgp39)肽，hsp，异质核核糖核蛋白(hnrnp)a2肽，hnrnpb1，hnrnpd，ro60/52，hsp60,65,70和90、bip、角蛋白、波形蛋白、血纤蛋白原、i、iii、iv和v型胶原肽、膜联蛋白v、葡萄糖6磷酸异构酶(gpi)、乙酰-钙蛋白酶抑制剂、丙酮酸脱氢酶(pdh)、醛缩酶、拓扑异构酶i、snrnp、parp、scl-70、scl-100、包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸、带中性电荷的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的磷脂抗原、基质金属蛋白酶、原纤蛋白、聚集蛋白聚糖。

术语“变应原”是指吸入变应原、摄入变应原或接触变应原。变应原的实例包括但不限于衍生自花粉(cup,jun)、房尘螨(der,gly,tyr,lep)、狗、猫和啮齿动物(can,fel,mus,rat)的吸入变应原。接触变应原的实例包括但不限于重金属(如镍、铬、金)、乳胶、半抗原如氟烷、肼苯哒嗪。

因此，在一个实施方案中，当自身免疫性疾病是多发性硬化症时，自身抗原选自由髓鞘相关抗原(如髓鞘碱性蛋白(mbp))(如mbp83-102肽)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)(如mog35-55肽)和蛋白脂质蛋白(plp)(如plp139-151肽)组成的组。当自身免疫性疾病是i型糖尿病(t1d)，自身抗原选自由胰岛素、胰岛素前体胰岛素原(proins)、谷氨酸脱羧酶65(gad65)、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚单位相关蛋白(igrp)、胰岛瘤相关抗原-2(ia-2)和锌转运蛋白8(znt8)组成的组。当自身免疫性疾病是类风湿性关节炎时，自身抗原是ii型胶原蛋白(ctii)。

还希望异型抗原包括但不限于同种异体移植物表达的抗原、在基因治疗过程中表达的蛋白质(以及从所使用的病毒载体表达的病毒抗原)以及治疗性蛋白质。异型抗原选自由hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g、hla-dm、hla-do、hla-dp、hla-dq、hla-dr,次要抗原如ha-1、ha-2、ha-3、ha-8、hb-1、ugt2b17、bcl2a1、hyb7、hya2、hya1、hyb60、hyb8、hydq5、hydrb3、和血型抗原a和b组成的组。

因此，“同种异体移植物”是具有两种遗传上不同的mhc单体型但同时具有次要组织相容性抗原和血型组的相同物种的两个个体之间的移植物。因此，为了预防或治疗同种异体移植物排斥，分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞通常分离自该患者(或接受者)并使用来自供体的细胞进行扩增。或者，可以使用从供体获得的抗原混合物来扩增分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞。

术语“治疗性蛋白质”是指蛋白质或肽以及它们在任何给定病况或疾病的治疗中的施用。治疗性蛋白质涉及施用于患者的任何蛋白质或肽，例如治疗性抗体、细胞因子、酶或任何其它蛋白质。蛋白质疗法的实例涉及通过施用血浆来源的或重组的凝血因子浓缩物(例如因子viii和因子ix)治疗血友病，使用单克隆抗体治疗癌症或心血管疾病或通过酶替代疗法治疗代谢或溶酶体疾病。

在具体实施方案中，适用于扩增treg细胞的培养基包含一定量的白介素-2(il-2)和/或一定量的白介素-15(il-15)和一定量的至少一种目标抗原。

在另一方面，本发明涉及经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人foxp3⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在一个实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌tgfβ-1⁺ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在另一实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其中所述treg细胞是gitr⁺和/或foxp3⁺。在另一实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人foxp3⁺gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在另一实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌tgfβ-1⁺ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人foxp3⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在另一实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌tgfβ-1⁺ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在又一实施方案中，本发明涉及经扩增的分泌tgfβ-1⁺ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人foxp3⁺gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。

可以通过本发明如上所述的扩增treg细胞的方法获得如上所述的所述经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在具体实施方案中，所述经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体是抗原特异性的。

本发明还涉及产生根据本发明的cd8⁺treg群体的方法，包括：

-从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺gitr⁺treg细胞，任选从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺cd45rc^低gitr⁺treg细胞，

-任选冷冻并随后解冻所分离的treg细胞，和

-在培养中扩增所述细胞。

在一个实施方案中，所述方法包括：

-从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺gitr⁺treg细胞，其中该分离的cd8⁺gitr⁺treg细胞是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞，

-任选冷冻并随后解冻所分离的treg细胞，和

-在培养中扩增所述细胞。

实际上，本发明人证实gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg细胞亚群具有高抑制性活性。

在一个实施方案中，本发明涉及用于产生分泌ifnγ⁺il^-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的方法，包括：

-从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺gitr⁺treg细胞，任选从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺cd45rc^低gitr⁺treg细胞，

-任选冷冻并随后解冻所分离的treg细胞，和

-在培养中扩增所述细胞。

在一个实施方案中，所述方法包括：

-从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺gitr⁺treg细胞，

任选冷冻并随后解冻所分离的treg细胞，和

-在培养中扩增所述细胞。

在另一个实施方案中，所述方法包括：

-从含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品分离cd8⁺cd45rc^低gitr⁺treg细胞，

-任选冷冻并随后解冻所分离的treg细胞，和

-在培养中扩增所述细胞。

用于分离人cd8⁺treg细胞和用于扩增treg细胞的方法如上所述。

在一个实施方案中，可以用用于检测gitr的抗体分离cd8⁺gitr⁺treg细胞。结合人gitr抗原的抗体的实例包括但不限于单克隆抗体mab689-100、621、ebioaitr、110416。

在另一实施方案中，可以用用于检测git的抗体和用于检测cd45rc的抗体分离cd8⁺cd45rc^低gitr⁺treg细胞。结合人gitr抗原的抗体的实例包括但不限于单克隆抗体mab689-100、621、ebioaitr、110416。结合人cd45rc抗原的抗体的实例包括单克隆抗体mt2和rp1/12。

在一个实施方案中，在用至少一种刺激剂激活pbmc或淋巴细胞之后根据本发明的方法分离cd8⁺gitr⁺treg细胞或cd8⁺cd45rc^低gitr⁺treg细胞。刺激剂的实例是上文中描述的那些刺激剂。

在一个实施方案中，从诱导的多能干细胞(ipsc)或ipsc衍生的cd34⁺细胞的培养物衍生并分离如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞。在本发明的范围内，ipsc或ipsc衍生的cd34⁺细胞的培养物可以例如从含有人外周血单核细胞(pbmc)的生物样品中获得。

本发明还涉及耗尽根据本发明的cd8⁺treg群体的方法，包括：

-检测含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品中的cd8⁺gitr⁺treg细胞，任选检测含有人外周血单核细胞(pbmc)或淋巴细胞的生物样品中的cd8⁺cd45rc^低gitr⁺treg细胞，并且

-耗尽所述细胞，

-由此获得耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的细胞群体。

本发明的药物组合物：

本发明还提供组合物，其包含本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体，优选本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含本发明的富集cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体。在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含耗尽本发明的cd8⁺人treg、特别是耗尽分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg群体的细胞群体。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含本发明的遗传修饰的cd8⁺人treg群体、特别是遗传修饰的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞群体。

在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的扩增群体。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含本发明的抗原特异性cd8⁺人treg的扩增群体、特别是抗原特异性的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的扩增群体。

本发明还提供药物组合物，其包含本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体。

在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的cd8⁺人treg、特别是如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的cd8⁺人treg、特别是如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的cd8⁺人treg、特别是如上所述的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的富集群体和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的遗传修饰的cd8⁺人treg、特别是如上所述的遗传修饰的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体和药学上可接受的载体。

在另一实施方案中，药物组合物包含本发明的经扩增的cd8⁺人treg、特别是如上所述的经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体和药学上可接受的载体。在具体实施方案中，药物组合物包含本发明的经扩增的抗原特异性cd8⁺人treg、特别是如上所述的经扩增的抗原特异性的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体和药学上可接受的载体。

药物组合物一般可以包括一种或多种药学上可接受的和/或经批准的添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。这样的辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化剂、ph缓冲物质等。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。该药物组合物能够含有另外的添加剂如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其他添加剂如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或适合用于体内施用的重组蛋白(例如人血清白蛋白)。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当适当时对哺乳动物、尤其是人施用时不产生不利反应、变态反应或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。

本发明还提供药物，其包含本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体。在一个实施方案中，本发明的药物包含本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体。在一个实施方案中，本发明的药物包含本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的富集群体。在一个实施方案中，本发明的药物包含本发明的遗传修饰的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的遗传修饰的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体。

在一个实施方案中，本发明的药物包含本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的扩增群体。在一个实施方案中，本发明的药物包含本发明的抗原特异性cd8⁺人treg的扩增群体、特别是根据本发明的抗原特异性的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的扩增群体。

本发明的treg细胞的治疗方法和用途

如上所述，本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体在自身免疫、慢性炎症、变态反应、移植(用于预防或治疗移植物排斥或gvhd)、基因疗法和用治疗性蛋白质的治疗领域中具有益处，以避免免疫系统对自身组织或治疗性蛋白质的降解。根据本发明的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体确实表现出诱导免疫耐受和/或阻止和/或抑制免疫应答的能力，优选针对参与待治疗的疾病的抗原的抗原特异性免疫应答，和/或由cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞介导的不需要的适应性免疫应答，优选免疫t细胞耐受或减少的t细胞激活。优选地，从待治疗的患者分离本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体(并在离体扩增之后重新施用于该患者)。

因此，本发明的一个方面涉及本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用作药物。本发明的另一个方面涉及本发明的经扩增的cd8⁺人treg、特别是本发明的经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用作药物。

本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体(优选经扩增的抗原特异性群体)可以通过许多方法重新引入该患者。优选地，它们被静脉内注射。在一个实施方案中，约1×10⁴至约1×10⁸个细胞被重新引入该患者。在另一个实施方案中，约1×10⁶至约10×10⁶个细胞/kg患者体重被重新引入该患者体内。

本文的术语“预防(prevent、preventing和prevention)”是指本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的施用导致抑制受试者中疾病的发展或发作或预防疾病的一个或多个症状的复发、发作或发展。

如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)及防止性(preventive)措施，其中目的是预防或减缓(减轻、减少)靶向病理性疾病或病况。需要治疗的患者包括已经患有该疾病的患者以及那些容易患有该疾病的患者。如果在接受治疗量的本发明的cd8⁺人treg、特别是根据本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞后，该患者显示出可观察和/或可测量的以下一种或多种的减少或不存在则患者成功“治疗”了不希望的免疫应答：致病性细胞数量的减少；致病性细胞总数的百分数的减少；和/或在一定程度上缓解与特定疾病或病况相关的一种或多种症状；发病率和死亡率的降低，生活问题质量的改善。用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数可以通过医生熟悉的常规程序容易地测量。

如本文所用，术语“患者”是指正在等待接受或正在接受医疗护理，或者过去是/现在是/将来是医疗程序的主体，或者就疾病的发展或进展被监测的人。在一个实施方案中，患者是成人(例如年龄大于18的患者)。在另一个实施方案中，患者是儿童(例如年龄小于18的患者)。在一个实施方案中，患者是男性。在另一个实施方案中，患者是女性。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的数量，其旨在对靶标没有显著的负面或不利副作用的情况下，(1)延迟或预防不需要的免疫应答的发作；(2)减缓或停止不需要的免疫应答的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)引起不需要的免疫应答症状的改善；(4)降低不需要的免疫应答的严重性或发生率；或(5)治愈不需要的免疫应答。可以在不需要的免疫应答发作之前施用治疗有效量，用于预防性(prophylactic)或防止性(preventive)作用。备选地或另外，可以在不需要的免疫应答开始之后施用治疗有效量，用于治疗作用。有效量将随患者的年龄、性别、种族、一般状况等，所治疗病况的严重程度，治疗持续时间，任何同时治疗的性质，所用的药学上可接受的载体，以及在本领域技术人员的知识和专业知识范围内的类似因素而变化。在适当的情况下，任何个别情况下的“有效量”可以由本领域的普通技术人员通过参考相关文本和文献和/或通过使用常规实验来确定，(例如，参见gennaro等人,编.remington'sthescienceandpracticeofpharmacy,第20版,(2000),lippincottwilliamsandwilkins,baltimoremd；braunwald等人,编.harrison'sprinciplesofinternalmedicine,第15编,(2001),mcgrawhill,ny；berkow等人,编.themerckmanualofdiagnosisandtherapy,(1992),merckresearchlaboratories,rahwaynj)。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗自身免疫性疾病的方法中。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的经扩增的cd8⁺人treg、特别是本发明的经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗自身免疫性疾病的方法中。

本发明还涉及用于预防或治疗自身免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的患者施用药学上有效量的本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的步骤。

如本文所用，术语“自身免疫性疾病”是指这样的疾病，其中免疫系统产生针对作为正常宿主的一部分的抗原(即自身抗原)的免疫应答(例如，b细胞或t细胞应答)，从而对组织造成伤害。在自身免疫性疾病中，宿主的免疫系统不能识别特定抗原为“自身”抗原并且产生针对表达该抗原的宿主组织的免疫反应。

影响人类的示例性自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎，青少年少数关节关节炎，胶原诱导的关节炎，佐剂诱导的关节炎，葡萄膜炎，舍格伦综合征，多发性硬化症，实验性自身免疫性脑脊髓炎，炎性肠病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)，自身免疫性胃萎缩，寻常型天疱疮，银屑病，白癜风，1型糖尿病，非肥胖型糖尿病，重症肌无力，格雷夫斯病，桥本甲状腺炎，硬化性胆管炎，硬化性涎腺炎，系统性红斑狼疮，自身免疫性血小板减少性紫癜，肺出血-肾炎综合征，艾迪生病，系统性硬化病，多肌炎，皮肌炎，后天性血友病，血栓性血小板减少性紫癜等。

在另一个实施方案中，本发明的一个方面涉及本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗慢性炎性疾病的方法中。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的经扩增的cd8⁺人treg、特别是本发明的经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗慢性炎性疾病的方法中。

影响人类的慢性炎性疾病的实例包括但不限于非自身免疫性炎性肠病，术后粘连，冠状动脉疾病，肝纤维化，急性呼吸窘迫综合征，急性炎性胰腺炎，内镜逆行胰胆管造影诱导的胰腺炎，烧伤，冠状动脉、大脑和外周动脉的动脉粥样化形成，阑尾炎，胆囊炎，憩室炎，内脏纤维化病症，伤口愈合，皮肤瘢痕形成病症(瘢痕疙瘩，化脓性汗腺炎)，肉芽肿性病症(结节病，原发性胆汁性肝硬化)，哮喘，坏疽性脓皮病，sweet综合征，白塞病，原发性硬化性胆管炎和脓肿。

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗移植物排斥(或用于诱导移植物耐受)或用于预防或治疗gvhd的方法中。

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的经扩增的cd8⁺人treg、特别是本发明的经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗移植物排斥(或用于诱导移植物耐受)或用于预防或治疗gvhd的方法中。

本发明还涉及用于预防或治疗移植物抗宿主病(gvhd)和移植物排斥(或诱导移植物耐受)的方法，包括向有此需要的患者施用药学上有效量的本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的步骤。

如本文所用，术语“移植物排斥”包括急性和慢性移植物排斥。“急性排斥”是当移植的组织是免疫上外来的时，免疫系统对组织移植接受者的排斥。急性排斥的特征在于接受者的免疫细胞浸润移植组织，其执行其效应物功能并破坏移植组织。急性排斥的发作快速，通常在移植手术后的几周内发生在人体内。一般来说，诸如雷帕霉素、环孢菌素、抗cd40l单克隆抗体等免疫抑制药能够抑制或阻止急性排斥。“慢性移植排斥”一般在植入后数月至数年内在人体中发生，即使存在急性排斥的成功免疫抑制。纤维化是所有类型的器官移植的慢性排斥的常见因素。

术语“移植”及其变化形式是指将移植(也称为移植物)插入接受者，无论移植是同基因的(其中供体和接受者在遗传上是相同的)、同种异基因的(其中供体和接受者具有不同遗传起源但属于同一物种)，还是异种的(其中供体和接受者来自不同物种)。因此，在典型的情况下，宿主是人，而移植物是同基因移植物，来源于具有相同或不同遗传起源的人。在另一种情况下，移植物来源于不同于向其中移植的物种的物种，包括来自种系发生广泛分离物种的动物，例如狒狒心脏被移植到人体宿主中。

在一个实施方案中，移植供体是人。移植供体可以是活体供体或死亡供体，即尸体供体。

在一个实施方案中，移植是器官、组织或细胞。

如本文所用，术语“器官”是指在生物体内执行特定功能或功能组的实体血管化器官。术语器官包括但不限于心，肺，肾，肝，胰腺，皮肤，子宫，骨，软骨，小肠或大肠，膀胱，脑，乳房，血管，食管，输卵管，胆囊，卵巢，胰腺，前列腺，胎盘，脊髓，肢包括上下肢，脾，胃，睾丸，胸腺，甲状腺，气管，输尿管，尿道。如本文所用，术语“组织”是指人或动物中的任何类型的组织，并且包括但不限于血管组织，皮肤组织，肝组织，胰腺组织，神经组织，泌尿生殖组织，胃肠组织，包括骨和软骨的骨骼组织，脂肪组织，包括肌腱和韧带的结缔组织，羊膜组织，绒毛膜组织，硬膜，心包膜，肌肉组织，腺组织，面部组织，眼组织。

如本文所用，术语“细胞”是指富含目标细胞的组合物，优选包含至少约20％，约30％，约40％，优选至少约50％，约60％，甚至更优选至少约65％，约70％，约75％，约80％所述细胞的组合物。

在某些实施方案，细胞选自由衍生自骨髓、外周血或脐带血的多能造血干细胞；或衍生自多能(pluripotent)(即胚胎干细胞(es)或诱导多能干细胞(ips))或多能的(multipotent)干细胞的不同细胞谱系如心肌细胞，β-胰腺细胞，肝细胞，神经元等的分化细胞组成的组。

在一个实施方案中，细胞组合物用于同种异基因造血干细胞移植(hsct)，并且因此包含多能造血干细胞，通常来源于骨髓，外周血或脐带血。

hsct可以治疗白血病和淋巴瘤患者。然而，同种异基因hct的一个重要限制是移植物抗宿主病(gvhd)的发展，其在约30-50％接受该疗法的人中以严重形式发生。

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗任何不需要的针对治疗性蛋白质的免疫反应的方法中。

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的经扩增的cd8⁺人treg、特别是本发明的经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗任何不需要的针对治疗性蛋白质的免疫反应的方法中。

本发明还涉及用于预防或治疗任何不需要的针对治疗性蛋白质的免疫反应的方法，包括向有此需要的患者施用药学上有效量的本发明的cd8⁺人treg的群体、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的步骤。

如本文所用，术语“不需要的针对治疗性蛋白质的免疫反应”是指任何不需要的针对在基因治疗过程中表达的蛋白质和/或治疗性蛋白质的免疫反应，所述蛋白质如因子viii(血友病a)和其他凝血因子，酶替代疗法，单克隆抗体(例如那他珠单抗，利妥昔单抗，英夫利昔单抗)，多克隆抗体，酶或细胞因子(例如ifnβ)。

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗变态反应。

在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的经扩增的cd8⁺人treg的分离群体、特别是本发明的经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的分离群体，其用于预防或治疗变态反应。

本发明还涉及用于预防或治疗变态反应的方法，包括向有此需要的患者施用药学上有效量的本发明的cd8⁺人treg、特别是本发明的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的群体的步骤。

如本文所用，术语“变态反应”是指免疫系统的病症(或不适当的反应)。变态反应针对称为变应原的通常无害的环境物质而发生；这些反应是获得的、可预测的和快速的。严格来说，变态反应是超敏反应的四种形式之一，被称为i型(或速发型)超敏反应。其特征在于称为肥大细胞和嗜碱性粒细胞的某些白细胞被称为ige的抗体类型过度激活，导致极度炎症反应。常见的变态反应包括湿疹，荨麻疹，花粉病，哮喘，食物变态反应，以及对诸如黄蜂和蜜蜂等刺痛昆虫的毒液的反应。

在一个实施方案中，受试者是患者。

在一个实施方案中，受试者罹患、优选被诊断为慢性炎性疾病。

在一个实施方案中，受试者罹患、优选被诊断为自身免疫性疾病。

在一个实施方案中，受试者先前进行过移植，或将进行移植。

在一个实施方案中，受试者先前接受过治疗性蛋白质，或将接受治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，受试者罹患、优选被诊断为变态反应。

在一个实施方案中，用免疫抑制药物如例如雷帕霉素，环孢菌素a，霉酚酸酯，甲泼尼龙，他克莫司或其组合治疗受试者。在另一个实施方案中，没有用免疫抑制药物例如雷帕霉素，环孢菌素a，麦考酚酸莫酯，甲泼尼龙，他克莫司或其组合治疗受试者。

本发明的预后方法：

在另一个方面，本发明涉及确定患者是否处于移植物排斥、gvhd、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、针对治疗性蛋白质的不希望的免疫应答或变态反应(如上所定义)的风险中的体外方法，其包括确定在通过本发明的方法从所述患者获得的生物样品中如上所述的本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的存在的步骤，其中如上所述的本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的存在指示移植物排斥、gvhd、慢性炎性疾病、自身免疫性疾病、针对治疗性蛋白质的不希望的免疫应答或变态反应的风险下降。

如本文所用，术语“风险”是指事件将在特定时间段发生的概率，例如移植物排斥的发作，并且可能意味着受试者的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可以参考相关时间队列的测量后的实际观察或者参照根据在相关时间段内之后的统计有效历史队列的指数值来测量。相对风险是指患者的绝对风险与低风险队列的绝对风险或平均人群风险的比率，其可能因临床风险因素的评估方式而异。比值比(给定的测试结果的阳性事件对阴性事件的比例)也是常用的(可能性(odds)是根据公式p/(l-p)，其中p是事件的概率，(1-p)是没有事件的概率)。

本发明上下文中的“风险确定”包括预测事件可能发生的概率、可能性或似然性。风险确定还可以包括预测未来的临床参数，传统的实验室风险因素值，如年龄，性别错配，hla测试等…；无论是绝对的还是相对的，都是参考以前测量的人群。本发明的方法可用于对移植物排斥风险进行分类测量，从而定义被定义为处于移植物排斥风险中的移植患者分类的风险谱。

如本文所用，术语“确定存在”包括参考或不参考对照或预定值进行定性和/或定量检测(即，检测和/或测量存在)。如本文所用，“检测”是指确定如上所述的本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞是否存在于生物样品中，而“测量”是指确定生物样品中如上所述的本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的量。

如本文所用，术语“生物样品”具有其在本领域中的通用含义，并且是指为了体外评估的目的可以从患者获得的任何样品。优选的生物样品是血液样品(例如全血样品、血清样品、或血浆样品)，更特别的是从移植患者或者罹患自身免疫性疾病或变态反应的患者获得的血液样品。

在又一个方面，本发明涉及确定移植患者(接受者)是否耐受的体外方法，其包括确定在通过本发明所述的方法从所述移植患者获得的生物样品中如上所述的本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的存在的步骤，其中如上所述的本发明的cd8⁺人treg、特别是分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg细胞的存在指示耐受。

如本文所用，术语“耐受”或“免疫耐受”是指免疫系统对具有引发免疫应答能力的物质或组织无应答的状态。如本文所用，术语“免疫应答”包括t细胞介导的和/或b细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括t细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性，此外，术语免疫应答包括由t细胞激活(例如抗体产生(体液应答))和细胞因子应答细胞(例如巨噬细胞)激活间接影响的免疫应答。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞，如b细胞和t细胞(cd4⁺、cd8⁺、th1和th2细胞)；抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞，如树突细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞如巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞和粒细胞。

下面的附图和实施例将进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式被解释为限制本发明的范围。

附图说明：

图1.人cd8⁺cd45rc^低treg比人cd4⁺cd25⁺cd127^-treg更有效地抑制抗供体的免疫应答。比较cd8⁺cd45rc^低t细胞与经典的cd4⁺cd25⁺cd127^-treg对用同种异基因t耗尽的pbmc刺激的同基因效应物cd4⁺cd25^-t细胞的增殖的抑制活性，效应物:抑制物比率在16:1至1:4的范围内。双向rm方差分析。增殖被针对不存在treg下的增殖进行归一化。*,p<0.05。

图2.人cd8⁺cd45rc^低treg的抑制活性优先通过与pdc的相互作用而增加。用抗cd3和抗cd28单克隆抗体刺激分选的cd8+treg12h，并分析其对用同种异基因t耗尽的pbmc(apc)、cdc或pdc刺激的同基因效应物cd4⁺cd25^-t细胞的增殖的抑制活性，效应物:抑制物比率在8:1至1:4的范围内。双向rm方差分析。增殖被针对不存在treg下的增殖进行归一化。*p<0.05,**,p<0.01。

图3.人cd8⁺cd45rc^低treg亚群表达gitr。通过流式细胞术在分离的cd8⁺cd45rc^低treg和分离的cd8⁺cd45rc^高treg中分析表面受体gitr的表达。结果表示为表达gitr的细胞的平均百分数(+/-sem)。

图4.以foxp3⁺人cd8⁺treg富集tgfβ-1、il34、ifnγ和gitr的表达。通过ficoll梯度从健康志愿者的血液分离pbmc，并用50ng/mlpma和1μg/ml离子霉素在10μg/ml布雷菲德菌素a存在下刺激pbmc4h。通过在对活细胞门控后染色foxp3、il-34、ifnγ、tgfβ-1和gitr的表达的facs分析分离的cd8⁺细胞群体。一个代表性实验。a.分析了cd8⁺treg中foxp3和cd45rc的表达。b.测定了foxp3⁺cd45rc^低、foxp3^-cd45rc^低和cd45rc^高cd8⁺细胞中il-34、ifnγ、gitr和tgfβ-1的表达。

图5.人cd8⁺cd45rc^低treg特异性亚群在体外表现出高抑制性能力。a.用抗cd3和抗cd28单克隆抗体刺激分选的cd8⁺treg24h，分选ifnγ和/或il-10分泌，并在mlr测定中测试一系列效应物:抑制物比率的抑制活性，其中用同种异基因t耗尽的pbmc刺激同基因cfse-标记的cd4⁺cd25^-t细胞。将分选的cd8⁺treg与全体抗cd3+抗cd28单克隆抗体刺激的cd8⁺treg进行比较。双向方差分析rm。增殖被针对不存在treg下的增殖进行归一化。**,p<0.01。b.用1μg/ml抗cd3和抗cd28单克隆抗体刺激分选的cd8⁺cd45rc^低treg12h并通过facsaria就gitr表达进行新的分选。分析gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg和gitr^-cd8⁺cd45rc^低treg对用同种异基因t耗尽的pbmc刺激的同基因效应物cd4⁺cd25^-t细胞的增殖的抑制活性，效应物:抑制物比率在32:1至1:1的范围内。双向rm方差分析。增殖被针对不存在treg下的增殖进行归一化。**,p<0.01。

图6.ifnγ、il-10和il-34是cd8⁺cd45rc^低treg抑制的关键介质。在使用分选的cd8⁺cd45rc^低t细胞和用同种异基因t耗尽的pbmc刺激的同基因cfse标记的效应物cd4⁺cd25^-t细胞的共培养测定的第0天加入50μg/ml抗il-34(α-il-34)、抗il-10(α-il-10)或抗ifnγ细胞因子(α-ifnγ)或它们的抗受体抗il-10r(α-il-10r)或抗ifnγr(α-ifnγr)纯化阻断抗体。在treg存在下的增殖被针对不存在treg下的增殖进行归一化。在阻断抗体存在下的抑制针对在同型对照抗体存在下的抑制进行归一化。

图7.人cd8⁺cd45rc^低treg的抑制活性是接触依赖性的。如下进行transwell实验：用抗cd3和抗cd28单克隆抗体刺激分选的cd8⁺treg12h，并在il-2的存在下培养5天后分析对用同种异基因t耗尽的pbmc刺激同基因效应物cd4⁺cd25^-t细胞的增殖的抑制活性。同种异基因t耗尽的pbmc加入上面和下面的孔中。treg加入上面的孔中，而cd4⁺cd25^-t细胞加入下面的孔中，效应物:抑制物比率在1:1至1:4的范围内。双向rm方差分析。增殖被针对不存在treg下的增殖进行归一化。*,p<0.05。

图8.14天刺激后新鲜分选和解冻的cd8⁺cd45rc^低treg均显著扩增。a.在第0天用同种异基因apc(apc)任选用抗cd3和抗cd28单克隆抗体(poly)刺激分选的cd8⁺treg，并再次用或者不用(标为x)同样的apc(apc)或apc和抗cd3+抗cd28单克隆抗体(poly)刺激。该图表示在14天培养中获得的细胞的倍数扩增。b.将新鲜分选的(新鲜)或解冻的cd8⁺cd45rc^低细胞以3.3x10⁵个细胞/ml接种于具有同种异基因t耗尽的pbmc的完全培养基，treg:apc比率1:4，且在第0天加入1μg/ml抗cd3和抗cd28抗体。在第7天，用1μg/ml抗cd3和抗cd28再次刺激treg。在第0、7、10和12天，用1000u/ml人il-2和10ng/ml人il-15补充培养基。在第14天，分析treg的扩增率。该图表示在14天培养中获得的细胞的倍数扩增。解冻的细胞显示显著增加的扩增。mannwhitneyt检验***,p<0.001。

图9.在免疫抑制药物的存在下经扩增的cd8+treg得以存活。在第0天用同种异基因t耗尽的pbmc以1:4的treg:apc比率和1μg/ml抗cd3和抗cd28抗体刺激分选的cd8+treg。在第7天，用1μg/ml抗cd3和抗cd28再次刺激treg。在第0、7、10和12天，用人il-2(1000u/ml)和人il-15(10ng/ml)补充培养基。在第14天，在免疫抑制药物(is)：环孢菌素a(csa)、麦考酚酸酯(mpa)、甲泼尼龙(mpr)、雷帕霉素(rapa)或他克莫司(tacro)的存在或不存在(未处理-nt)下和在il-2/il-15的存在或不存在下用同种异基因apc再次刺激treg。6天后分析treg的存活。该图表示在培养的最后6天后获得的细胞存活百分数。存活百分数被针对在第14天在添加免疫抑制药物(is)之前的增殖进行归一化。

图10.cd8⁺treg比在相同培养条件下的cd4⁺treg更有效增殖。在第0天用同种异基因t耗尽的pbmc以1:4的treg:apc比率和1μg/ml抗cd3和抗cd28抗体刺激分选的cd8⁺cd45rc^低(cd8⁺)和cd4⁺cd25^高cd127^低(cd4⁺)treg。在第7和14天，用1μg/ml抗cd3和抗cd28再次刺激treg。在第0、7、10、12、14、17和19天，用1000u/ml人il-2和10ng/ml人il-15补充培养基。每7天分析treg扩增率。双向rm邦弗朗尼事后检验*,p<0.05。

图11.经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg显著更有效地抑制同种异基因cd4⁺cd25^-效应物t细胞应答。测试用apc或抗cd3+抗cd28单克隆抗体+apc扩增7天的treg对用用于扩增的同种异基因apc刺激的同基因cd4⁺cd25^-t细胞(分选自treg供体)的抑制活性。来自同样供体的解冻的、分选的和未经扩增的treg(标为x)定义初始抑制活性。增殖被针对不存在treg下的增殖进行归一化。

图12.以分泌ifnγ、il-10和il-34treg富集的经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg。分析14天的经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg的细胞因子表达(il-10、il-34和ifnγ)(“经扩增的”)并与扩增前cd8⁺cd45rc^低treg的细胞因子表达(“新鲜”)进行比较。**p<0.01,***p<0.001。

图13.能够在cd8⁺cd45rc^低treg的上清中检测到ifnγ分泌增加。用1μg/ml抗cd3和抗cd28抗体过夜刺激cd8⁺cd45rc^低细胞，并任一添加到mlr测定中，其中用同种异基因t耗尽的pbmc以1:1的效应物:抑制物比率刺激同基因效应物cd4+cd25-t细胞，或者以3.3x10⁵个细胞/ml接种于含有同种异基因t耗尽的pbmc的完全培养基中，treg:apc比率1:4，且含1μg/ml抗cd3和抗cd28抗体，进行14天扩增。在第7天，用1μg/ml抗cd3和抗cd28抗体再次刺激treg并改变培养基。在第0、7、10和12天，用1000u/ml人il-2和10ng/ml人il-15补充培养基。通过elisa在第14天测量培养上清中的ifnγ。

图14.经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg有效抑制同种异基因人皮肤排斥。a.人皮肤移植到nsg小鼠上并保留15天以供接受。然后在有或无同基因15天经扩增的treg(etreg)的情况下腹膜内转移与移植物同种异基因的5x10⁶pbmc。b.对移植物排斥进行评估并评分。c.评估小鼠存活的百分数。

图15.经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg有效抑制人源化小鼠中的gvhd。a.对于异种gvhd实验，在12h前辐照的nsg小鼠中、在有或无多克隆扩增的treg(etreg)以1:1和1:2的pbmc:经扩增的treg比率静脉内转移1.5x10⁷同基因pbmc。b.监测血液中人pbmc植入，并通过体重减轻评估gvh发展。c.评估小鼠存活的百分数。*p<0.05,**p<0.01。

实施例：分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的人cd8⁺cd45rc^低treg的新群体有效抑制移植物排斥。

材料与方法

健康志愿者血液收集和pbmc分离：

血液收集自etablissementdusang(nantes,法国)的健康供体。从机构审查委员会获得这项研究的批准。根据机构指南提供书面知情同意书。用pbs将血液稀释2倍，然后在室温下通过ficoll-paque密度梯度离心(eurobio,courtaboeuf,法国)在2000rpm下无制动分离pbmc20。将收集的pbmc在50mlpbs中1800rpm洗涤10分钟，在低渗溶液中孵育5分钟并在1000rpm下离心10分钟后，去除剩余的红细胞和血小板。当指出时，将pbmc在1:9的dmso：svf中冷冻并在10％svf培养基中洗涤两次用于解冻。

细胞分离：

从pbmc通过b细胞(cd19⁺细胞)和剩下的单核细胞(cd14⁺和cd16⁺细胞)的淘洗(dtcplateforme,nantes)和磁耗尽(dynabeads,invitrogen)通过阴性选择获得t细胞，然后分选作为应答物细胞的cd3⁺cd4⁺cd25^-细胞、作为cd8⁺treg的cd3⁺cd4^-cd45rc^低和作为cd4⁺treg细胞的cd3⁺cd4⁺cd25^-cd127^低细胞。用抗cd3和抗cd28单克隆抗体在250u/mlil-2的存在下刺激从解冻的pbmc分选的treg24h，然后铺板。在24h的treg多克隆刺激之后使用来自miltenyi的分泌测定检测试剂盒分选分泌ifnγ和/或il-10的细胞。使用facsariai(bdbiosciences,mountainview,ca)分选细胞。

通过cd3⁺细胞的磁耗尽和35gy辐照获得用作刺激物细胞的apc。通过cd3、cd14和cd16阳性细胞耗尽和nrp1⁺或cd1c⁺细胞分选分别获得pdc和cdc。

多克隆抗体和流式细胞术：

对于白细胞介素、ifnγ和foxp3分析,用pma(50ng/ml)和离子霉素(1μg/ml)刺激pbmc7h，在最后4h存在布雷菲德菌素a(10μg/ml)。

用lsrii或cantoii流式细胞仪(bdbiosciences,mountainview,ca)测量荧光分别用于表型和功能分析，flowjo软件(treestar,inc.美国)用于分析数据。首先通过它们的形态排除死细胞选择活细胞来门控细胞。

混合淋巴细胞反应：

对用同种异基因apc刺激的同基因效应物cd4⁺cd25^-t细胞(获得自供体treg)评估treg抑制活性。测试抑制物:效应物比率范围，以在用dc刺激时达到应答物细胞的显著增殖，其它实验以1:1的apc:应答物比率来实现。在共培养的第0天以50μg/ml加入阻断单克隆抗体或同种型对照单克隆抗体。使用transwell膜来将treg与应答物细胞隔离，二者均与刺激物细胞接触。添加1000u/mlil-2(miltenyi)以评估treg的细胞因子剥夺。经扩增的来自解冻的pbmc的treg的抑制活性是对用来自用于扩增的同样供体的同种异基因apc刺激的同基因效应物细胞进行评估的，并与从同样供体的解冻的pbmc分选的未刺激的treg进行比较。在5％ab血清培养基中共培养4.5天后，cfse标记的应答物细胞的增殖通过流式细胞术进行分析，其在添加时通过对cd3⁺cd4⁺活细胞(dapi阴性)的门控和排除cpd-v450标记的cd4⁺treg进行。

treg的扩增：

以约3x10⁵/ml接种treg于补充有il-2(1000u/ml)和il-15(10ng/ml)的5％ab血清培养基中，并用包被的抗cd3单克隆抗体(1μg/ml)、可溶性抗cd28单克隆抗体(1μg/ml)和/或同种异基因apc以1:4的treg:apc比率对其进行刺激。在第7天，经扩增的细胞以1x10⁵/ml稀释并再次进行刺激或不进行刺激。在第0、7、10和12天新鲜添加il-2和il-15细胞因子。在第14天，用pbs洗涤经扩增的treg，然后使用。

人源化的小鼠模型：

8-12周龄nod/scid/il-2rγ^-/-(nsg)小鼠以spf条件饲养在我们自己的动物设施中。本研究严格按照paysdelaloire的动物实验伦理委员会(许可证编号ceea.2012.155)批准的操作方案进行。

对于异种gvhd实验，在12h前辐照的nsg小鼠中、在有或无多克隆扩增的treg以1:1和1:2的pbmc:经扩增的treg比率静脉内转移1.5x10⁷同基因pbmc。监测血液中人pbmc植入，并通过体重减轻和肺、肝、肠、脾、肾的组织病理学分析评估gvh发展。

对于移植模型，由健康志愿者的chunantes提供人类皮肤，nsg小鼠在15天内接受移植物。在有或无同基因15天经扩增的treg的情况下腹膜内转移与移植物同种异基因的5x10⁶pbmc。评估移植物排斥评分。

结果

人cd8⁺cd45rc^低treg是比人cd4⁺cd25⁺cd127^-treg更有效的抗供体免疫应答的抑制物。

先前的研究已经表明cd8⁺cd45rc^低t调节性细胞参与mhc错配心脏同种异体移植大鼠模型中用cd40ig治疗诱导的移植物接受(guillonneau等人,2007；li等人,2010)。这两项研究都强调了ifnγ在cd40ig诱导的同种异体移植物接受中的关键作用。

在健康个体中cd45rc标志物的表型分析显示cd45rc标志物在健康个体中差异化表现，如通过若干个体的重叠所揭示的。这种差异表达与年龄或性别无关。

首先，在以不同比例加入mlr测定中时，评估总人cd8⁺cd45rc^低t细胞子集的抑制活性，并与众所周知的cd4⁺cd25⁺cd127^-treg的抑制活性进行比较，其中通过同种异基因t耗尽的pbmc刺激cfse标记的cd4⁺cd25^-t细胞。有趣的是，在所有比例下，与cd4⁺cd25⁺cd127^-treg相比，人cd8⁺cd45rc^低treg展现出对抗供体cd4⁺cd25^-效应物t细胞增殖的显著优异的抑制能力。

在大鼠中，鉴定了cd8⁺cd45rc^低treg与pdc的优先相互作用以发挥cd8⁺cd45rc^低treg的最佳抑制活性。因此，测试了相比于作为刺激物的t耗尽的pbmc，在不同比例的cdc(cd3^-cd19^-cd1c⁺nrp-1^-)、pdc(cd3⁺cd19^-cd1c^-nrp-1⁺)的存在下人cd8⁺cd45rc^低的抑制潜能(图2)。有趣的是，相比于pdc和t耗尽的pbmc，在cdc的存在下cd8⁺cd45rc^低treg的抑制活性更少，表明在人中(与在大鼠中的情况类似)，pdc是介导cd8⁺cd45rc^低treg对cd4⁺效应物t细胞的抑制活性所必需的。

总之，人cd8⁺cd45rc^低treg在pdc的存在下比cd4⁺cd25+cd127-treg更有效地抑制抗供体cd4⁺cd25⁺效应物t细胞。

cd8⁺cd45rc^低treg亚群表达ifnγ、il-34和il-10。

为了表征人cd8⁺cd45rc^低treg，使用13色流式细胞术进行深度表型分析。分析若干标志物以评估总cd8⁺cd45rc^低treg子集内亚群的存在：treg上先前所述的标志物例如cd103、ctla-4、gitr或细胞因子例如ifnγ、il-34或il-10以及人cd8⁺treg的已知标志物，即cd28和cd122。

标志物的筛选显示出cd8⁺cd45rc^低treg相比于cd8⁺cd45rc^高t细胞，cd69、cd71、cd103、foxp3、tbet、hla-dr、cd154、ifnγ、il-2和il-34表达的显著上调和cd38表达的降低，所有这一切都表明激活的原致耐受性细胞(pro-tolerogeniccell)的概况。

cd45rc、cd28和cd122的共表达分析显示，每个亚群存在于cd45rc标志物内，但是cd8⁺cd28^-treg和cd8⁺cd122⁺treg没有都包含在cd45rc^低标志物内，这表明这些标志物中的每一个均识别独特的treg亚群。

特别令人感兴趣的是，在cd8⁺cd45rc^低treg中观察到ifnγ和il-34的显著表达(分别约60％和20％)，其中il-34主要由il-10分泌细胞共表达。

在cd8⁺cd45rc^低treg和cd8⁺cd45rc^高treg中评估细胞表面受体gitr的表达(图3)。流式细胞术分析显示gitr在cd8⁺cd45rc^低treg群体中的表达(约15％的细胞表达gitr)显著高于cd8⁺cd45rc^高treg群体中的表达(约5％的细胞表达gitr)。因此(tus)，在cd8⁺cd45rc^低treg中，有gitr⁺cd8⁺cd45rc^低treg亚群。

最后，通过在对活细胞门控后染色foxp3、il-34、ifnγ、tgfβ-1和gitr的表达的facs分析cd3⁺cd8⁺cd45rc^低treg(图4)。从在10μg/ml布雷菲德菌素a存在下用50ng/mlpma和1μg/ml离子霉素刺激4h的pbmc获得cd3⁺cd8⁺cd45rc^低treg。只有foxp3⁺cd8⁺cd45rc^低treg表达gitr、tgfb1和il-34。foxp3⁺cd8⁺cd45rc^低treg还比foxp3^-cd8⁺cd45rc^低treg表达更高水平的ifnγ。

总之，在cd8⁺cd45rc^低treg中il-34、tgfb1和gitr的表达与foxp3的表达密切相关。

分泌il-10⁺il-34⁺ifnγ⁺的cd8⁺cd45rc^低treg亚群表现出高的体外抑制性能力。

评估了表达ifnγ和il-34的人cd8⁺cd45rc^低treg亚群的抑制潜能。首先，使用允许分选活细胞的ifnγ-或il-10-分泌测定检测试剂盒基于ifnγ和il-10的表达分选cd8⁺cd45rc^低treg亚群。从il-34主要由分泌il-10的细胞共表达的观察结果来看，假定il-10⁺细胞也是il-34⁺细胞。因此，分选出cd8⁺cd45rc^低treg的四个亚群：il-10^-(il-34^-)ifnγ^-、il-10^-(il-34^-)ifnγ⁺、il-10⁺(il-34⁺)ifnγ^-和il-10⁺(il-34⁺)ifnγ⁺cd8⁺cd45rc^低treg。然后，将这样分选的细胞添加于如上所述的mlr测定中(图5a)。重要的是，il-10⁺(il-34⁺)ifnγ⁺cd8⁺cd45rc^低treg比il-10^-(il-34^-)ifnγ⁺cd8⁺cd45rc^低treg具有显著更高的抑制性，表明il-10和il-34的关键作用。

总之，分泌il-10⁺il-34⁺ifnγ⁺的cd8⁺cd45rc^低treg亚群表现出高的体外抑制能力。

gitr⁺分选的cd8⁺cd45rc^低treg比gitr^-cd8⁺cd45rc^低treg是更有效的抑制物

通过细胞表面标志物：gitr，cd38，hla-dr，cd45ra，cd127，cd197，cd27，cd28，cd25细分总cd8⁺cd45rc^低treg群体以进行类似的测定。尽管用cd45ra和cd28等其他标志物可观察到抑制活性的小损失，但没有显著差异。除了一个例外之外，抑制活性没有增加，表明这些标志物不能用于进一步区分具有抑制活性的cd8⁺cd45rc^低treg。

然而，最有趣的是，gitr⁺cd3⁺cd8⁺cd45rc^低treg比gitr^-cd3⁺cd8⁺cd45rc^低treg更有效地抑制抗供体免疫应答(图5b)。总之，gitr表达以更高的对同种异基因效应物cd4⁺cd25^-t细胞增殖的抑制能力识别cd8+treg亚群。

cd8⁺cd45rc^低treg介导的抑制活性依赖于il-34、il-10和ifnγ的分泌。

然后检查了可能构成cd8⁺cd45rc^低treg抑制活性的不同作用机制。这样的作用机制包括细胞因子分泌、接触依赖性活性、il-2剥夺或杀死以抑制效应物t细胞增殖。

首先，由于ifnγ、il-34和il-10以最佳调节活性区分cd8⁺cd45rc^低treg亚群，因此在mlr上清中测试细胞因子产生。第5天mlr上清中细胞因子产生的分析证实了相对于没有treg和cd8⁺cd45rc^高t细胞，在cd8⁺cd45rc^低treg的存在下ifnγ的显著产生(图13)。

为了进一步评估ifnγ、il-34和il-10在cd8⁺cd45rc^低treg介导的抑制中的作用，以下阻断抗体在cd8⁺cd45rc^低treg的存在下添加于抑制性mlr测定中：抗il-34、抗il-10、抗il-10r、抗ifnγ和抗ifnγr(图6)。有趣的是，阻断il-34、il-10和il-10r、ifnγ和ifnγr导致cd8⁺cd45rc^低treg对cd4⁺cd25^-t细胞抗供体免疫应答的抑制活性的类似损失。

cd8⁺cd45rc^低treg介导的抑制活性还依赖于接触。

为了确定接触对cd8⁺cd45rc^低treg介导的抑制的重要性，进行了transwell实验(图7)。在下面的室或上面的室中存在或者不存在cd8⁺cd45rc^低treg的情况下评估了在下面的室中用同种异基因t耗尽的pbmc刺激的cfse标记的cd4⁺cd25^-t细胞的增殖。当cd8⁺cd45rc^低treg分开添加到上面的室中时，观察到抑制活性的完全丧失，这证实需要接触。

因为这可能表明通过杀死的抑制机制，接下来测试了孵育15h后对同基因cd4⁺cd25^-效应物t细胞或同种异基因t耗尽的pbmc测试了增加比例的cd8⁺cd45rc^低treg介导的细胞毒作用。对同基因或同种异基因靶没有坏死或晚期凋亡诱导，但是在高的靶:效应物比率时观察到对两种靶的小的早期细胞凋亡诱导(数据未显示)。不存在末期细胞凋亡诱导表明细胞毒机制在由cd8⁺cd45rc^低treg介导的抑制作用中几乎不起作用。

cd8⁺cd45rc^低treg能够有效扩增，甚至在解冻后。

因为使用cd4⁺treg的细胞疗法是防止同种异体移植排斥的有前途的手段(issue)，并且因为cd8⁺cd45rc^低treg比cd4⁺cd25^高cd127^-treg更有效地离体抑制抗供体免疫应答(图1)，设置了扩增cd8⁺cd45rc^低treg的操作方案。

首先，使用不同的apc比例(1:1至1:16的treg:apc比率)、不同的血清来源(ab血清、自身血浆、texmecs或2％白蛋白)和不同的刺激(多克隆抗cd3+抗cd28相对于汇集的同种异基因t耗尽的apc)鉴定了最有效的扩增总cd8⁺cd45rc^低treg的条件。

因此，发现1:4的treg:apc比率是必需的并且足以有效扩增7天treg，并且发现在培养基使用ab血清在这样的比例下有效扩增cd8⁺cd45rc^低treg。接下来，观察到当在高剂量的il-2和il-15的存在下，在从第0天至第7天用或者不用多克隆抗cd3+抗cd28单克隆抗体用同种异基因t耗尽的apc随便刺激，并且或从第7天至第14天再次刺激时，cd8⁺cd45rc^低treg能够在14天中有效扩增直至1000倍，甚至是在解冻之后(图8a)。

比较了14天培养之后新鲜分选的cd8⁺cd45rc^低treg和解冻的cd8⁺cd45rc^低treg的扩增(图8b)。在第0天，用同种异基因t耗尽的pbmc以1:4的treg:apc比率并用多克隆抗cd3+抗cd28抗体刺激细胞。在第7天，用抗cd3+抗cd28抗体再次刺激细胞。在第0、7、10和12天，用il-2和il-15补充培养基。14天后，新鲜分选的cd8⁺cd45rc^低treg扩增135倍，而解冻的cd8⁺cd45rc^低treg扩增612倍。因此，解冻的cd8⁺cd45rc^低treg比新鲜分选的cd8⁺cd45rc^低treg更有效地增殖。

总之，cd8⁺cd45rc^低treg能够有效扩增，甚至在解冻后更是如此。

此外，评估了在免疫抑制药物存在下经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg的存活率(图9)。在第0天，用同种异基因t耗尽的pbmc以1:4的treg:apc比率并用多克隆抗cd3+抗cd28单克隆抗体刺激细胞。在第7天，用抗cd3+抗cd28单克隆抗体再次刺激细胞。在第0、7、10和12天，用il-2和il-15补充培养基。在第14天，在免疫抑制药物(环孢菌素a、麦考酚酸酯、甲泼尼龙、雷帕霉素或他克莫司)的存在或不存在下和在il-2/il-15的存在下或不存在下用同种异基因apc再次刺激treg。在第20天，分析tregs的存活。在免疫抑制药物存在下，cd8⁺cd45rc^低treg的存活没有改变。此外，除了麦考酚酸酯外，cd8⁺cd45rc^低treg在所测试的免疫抑制药物存在下均增殖。在补充有il-2/il-15的情况下增殖更有效，这表明两种细胞因子可以在体内添加补充cd8⁺treg以维持其增殖。

最后，在同样的培养条件下比较了cd8⁺cd45rc^低treg和cd4⁺cd25^高cd127^低treg的增殖(图10)。在第0天，用同种异基因t耗尽的pbmc以1:4的treg:apc比率并用多克隆抗cd3+抗cd28单克隆抗体刺激两种treg亚群，持续21天。在第7天和第14天，用抗cd3+抗cd28单克隆抗体再次刺激treg。在第0、7、10、12、14和19天，用il-2和il-15补充培养基。响应于多克隆刺激，cd8⁺cd45rc^低treg扩增354倍，而cd4⁺cd25^高treg仅扩增11倍。此外，与cd4⁺cd25^高treg在第14天增殖达到平台相比，cd8⁺cd45rc^低treg的高效和指数增殖维持到直至至少第21天。

14天经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg上调ifnγ、il-10和il-34以抑制免疫排斥。

重要的是，同种异基因和多克隆扩增的cd8⁺cd45rc^低treg在抑制同种异基因cd4⁺cd25^-效应物t细胞应答上比解冻的、分选的和未经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg均显著更加有效(图11)。

此外，这样的14天经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg比未经扩增的或者7天经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg展现出可比的细胞毒活性，这证实在扩增后获得的优异的抑制能力不是由于cd8⁺cd45rc^低treg的增加的杀死活性。

最重要的是，这样的扩增操作方案导致分泌ifnγ⁺il-34⁺il-10的cd8⁺cd45rc^低treg的显著富集(图12)。

ifnγ可能在cd8⁺cd45rc^低treg功能中起到关键作用

在不同cd8⁺cd45rc^低treg培养物上清中评估了ifnγ的检测(图13)。用多克隆抗cd3和抗cd28抗体过夜刺激分离的cd8⁺cd45rc^低treg，并任一添加到mlr测定中，其中用同种异基因t耗尽的pbmc以1:1的效应物:抑制物比率刺激同基因效应物cd4⁺cd25^-t细胞，或者在第0天用同种异基因t耗尽的pbmc以1:4的treg:apc比率和多克隆抗cd3和抗cd28抗体刺激，进行14天扩增。在第7天，用抗cd3和抗cd28抗体再次刺激细胞。在第0、7、10和12天，用il-2和il-15补充培养基。通过elisa在第14天测量培养上清中的ifnγ。在效应物cd4⁺cd25^-t细胞和apc(平均2.5ng/ml)的存在下可检测到ifnγ分泌，但在用cd8⁺treg(平均3.9ng/ml)孵育6天或者用抗cd3和抗cd28单克隆抗体扩增cd8+treg(平均8.7ng/ml)14天之后增加。

总之，在cd8⁺cd45rc^低treg培养物上清中可检测到高水平的ifnγ，这表明该细胞因子在cd8⁺cd45rc^低treg功能中的关键作用。

经扩增的分泌ifnγ⁺il-10⁺il-34⁺的cd8⁺cd45rc^低treg在体内显示治疗效果

最后，使用nsg小鼠使用两种不同的移植模型，评估这样的经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg的抑制潜力：注射同种异基因pbmc后人类皮肤同种异体移植排斥模型(图14)和注射人pbmc后异种gvhd模型(图15)。

在这些模型中，同基因的经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg与pbmc同时注射，通过测量存活百分数、皮肤组织学和体重减轻来评估它们在抑制抗供体免疫应答方面的潜力。

有趣的是，在这两种情况下，经扩增的cd8⁺cd45rc^低treg的共转移均显著抑制移植物排斥，表明了cd8⁺cd45rc^低treg作为细胞疗法的潜力。

参考文献：

在整个申请中，各种参考文献描述了本发明所属的现有技术。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开。

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序列表

<110>inserm（institutnationaldelasanteetdelarecherchemedicale）(国家健康科学研究所)

<120>cd8+cd45rc低treg的新亚群及其用途

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