用于检测肝脏纤维化和对疗法的响应性的方法与流程

本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2015年09月29日提交的美国临时申请号62/234,581的利益，前述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。联邦经费的声明本发明在由国家卫生研究院（nih）的国家酒精滥用和酒精中毒研究所（niaaa）授予的经费号1r01aa021276-01的政府支持下做出。在本发明中政府具有一定权利。
背景技术：
：肝、肺、肾、心以及其他重要器官系统的慢性瘢痕形成或“纤维化（fibrosis）”没有有效的治疗，并且据估计在工业化社会中占了高达45%的总死亡数。目前没有fda或emea批准的抗纤维化的疗法。在许多慢性肝纤维化疾病中纤维化是常见的并且使人衰弱的病理，其阻碍有效的治疗并且加剧了对于肝移植的需求。肝脏纤维化是对在肝中的慢性损伤和炎症的常见响应，其导致不溶的胶原及细胞外基质成分的过量生成与沉积。肝纤维化正影响着550万的美国成年人（即2-3%的美国成年人口），其是严重的医学问题，因为它危及了正常的肝脏结构及功能并且是肝硬化、肝癌和末期肝病的先兆。尽管儿童群体也可以被影响（先天性的胆道闭锁），但肝纤维化最常见于患有慢性肝损伤（肝炎和酒精滥用）的患者。随着目前肥胖相关的健康问题（例如脂肪肝）的激增，在有风险患有肝纤维化或已经发展出肝纤维化的患者数量上的大幅增加是预料之中的。存在着许多其他类型的瘢痕形成缺乏有效的治疗。例如，皮肤瘢痕形成和腹腔粘连以高比例出现在美国每年进行的>4200万例手术中，但同样没有fda-批准的药物治疗以预防或减少瘢痕。据估计仅这一市场就有40亿美元。因此，存在着对于检测肝脏纤维化的有效方法的需求。此外，存在着对于肝脏纤维化的非侵入性的检测的需求，并且存在着对于用于确定对象是否对纤维化治疗响应的有效方法的需求。本发明满足了这些需求并且还提供了相关的优点。概述本发明提供了用于纤维化（例如肝脏纤维化）的诊断的方法，以及用于确定肝脏纤维化对疗法的响应性的方法，其中每个都是未被满足的医疗需求。如本文在此更详细地公开的，本发明提供了用于确定对象是否患有纤维化或肝疾病的方法，所述方法包括在从所述对象的体液中分离的外泌体（exosome）的样品中，确定在表1和表2中列出的一种或多种mirna的表达水平，其中与对照相比，一种或多种mirna的至少两倍或更高的差异表达，表明所述对象患有纤维化的疾病或肝疾病。在一个方面，患有疾病（例如肝疾病）的对象的外泌体具有独特的分子图谱，其独特之处在于所述外泌体的microrna（mir或mirna）图谱包含与健康的对照对象的外泌体的mir图谱相比的差异表达（例如至少两倍）。在一些实施方式中，所述肝疾病是肝的硬化。在一些实施方式中，所述对象感染有b型肝炎病毒（乙型肝炎病毒）。在一个方面，本发明公开了一种确定对象是否患有、或更可能患有或较不可能患有纤维化疾病、肝纤维化或肝硬化的方法，所述方法包括在从所述对象的体液中分离的外泌体的样品中，确定在表1中列出的mirna中的一种或多种的表达水平，其中与对照相比，所述一种或多种mirna的差异表达，表明所述对象患有、或更可能患有纤维化疾病、肝纤维化或肝硬化。在一些实施方式中，所述方法包括在所述外泌体的样品中，确定在表1中列出的mirna中的一种或更多、两种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、五十种或更多、五十五种或更多、或全部的水平。本发明进一步公开了确定患有纤维化疾病或肝疾病的对象是否更可能或较不可能对治疗该疾病的疗法响应的方法，所述方法包含在从所述对象的体液中分离的外泌体的样品中，确定在表1和表2中列出的一种或多种mirna的表达水平，其中与对照相比，一种或多种以下mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明所述对象更可能对疗法响应，该mirna选自582-3p、22-3p、let-7a-5p、889-3p、3200-3p、642b-3p、let-7c-5p、let-7f-5p、148s-3p、16-5p、let-7g-5p、26a-5p、122-5p、195-5p、29c-3p、139-5p、509-5p、27b-3p、194-5p、let-7b-5p、191-3p、378a-3p、3939、2114-3p、188-3p、106b-30、942-5p、632、370-3p、566、15b-5p、548d-3p、147a、7-1-3p、936、551b-5p、3679-5p、616-3p、668-3p、7-2-3p、196a-3p、538b-5p、34b-3p、892a和500a-5p[在图1a中的“正常化”]；和/或其中与对照相比，一种或多种以下mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明所述对象较不可能对所述疗法响应，该mirna选自573、512-3p、20a-5p、200b-3p、20b-5p、2115-3p、466、3137、510-5p、4267、515-3p、24-2-5p、3117-3p、668-3p、132-3p、let-7e-5p、3074-3p、4260、4288、936、4254、148b-3p、378b、2909和193a-5p[在图1b中的“持续化”]。在一些实施方式中，与对照相比，至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、或至少15倍的一种或多种以下mirna的差异表达，表明所述对象更可能对所述疗法响应，该mirna选自582-3p、22-3p、let-7a-5p、889-3p、3200-3p、642b-3p、let-7c-5p、let-7f-5p、148s-3p、16-5p、let-7g-5p、26a-5p、122-5p、195-5p、29c-3p、139-5p、509-5p、27b-3p、194-5p、let-7b-5p、191-3p、378a-3p、3939、2114-3p、188-3p、106b-30、942-5p、632、370-3p、566、15b-5p、548d-3p、147a、7-1-3p、936、551b-5p、3679-5p、616-3p、668-3p、7-2-3p、196a-3p、538b-5p、34b-3p、892a和500a-5p。[在图1a中的“正常化”]。在一些实施方式中，与对照相比，至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、或至少15倍的一种或多种以下mirna的差异表达，表明所述对象可能对所述疗法不响应，该mirna选自573、512-3p、20a-5p、200b-3p、20b-5p、2115-3p、466、3137、510-5p、4267、515-3p、24-2-5p、3117-3p、668-3p、132-3p、let-7e-5p、3074-3p、4260、4288、936、425、148b-3p、378b、2909和193a-5p。[图1b中的“持续化”]。在一些实施方式中，所述方法包含确定所述mirna中的一种或更多、两种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一种或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、或二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、或全部的表达水平。在一些实施方式中，本发明公开了确定患有纤维化疾病或肝病的对象是否更可能或较不可能经历逆转的方法，所述方法包括在从所述对象的体液中分离的外泌体的样品中，确定在表1和2中列出的一种或多种mirna的表达水平，其中与对照相比，一种或多种以下mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明了所述对象更可能经历逆转，该mirna选自582-3p、22-3p、let-7a-5p、889-3p、3200-3p、642b-3p、let-7c-5p、let-7f-5p、148s-3p、16-5p、let-7g-5p、26a-5p、122-5p、195-5p、29c-3p、139-5p、509-5p、27b-3p、194-5p、let-7b-5p、191-3p、378a-3p、3939、2114-3p、188-3p、106b-30、942-5p、632、370-3p、566、15b-5p、548d-3p、147a、7-1-3p、936、551b-5p、3679-5p、616-3p、668-3p、7-2-3p、196a-3p、538b-5p、34b-3p、892a和500a-5p[在图1a中的“正常化”]；和/或其中与对照相比，一种或多种以下mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明所述对象较不可能经历逆转，该mirna选自573、512-3p、20a-5p,、200b-3p、20b-5p、2115-3p、466、3137、510-5p、4267、515-3p、24-2-5p、3117-3p、668-3p、132-3p、let-7e-5p、3074-3p、4260、4288、936、4254、148b-3p、378b、2909和193a-5p[图1b中的“持续化”]。在一些实施方式中，所述方法包含在所述外泌体的样品中确定在表1和2中列出的mirna中的一种或更多、两种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一种或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、或二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种或更多、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、五十种或更多、或五十五种或更多的表达水平。在一些实施方式中，用于肝病的疗法选自：停止饮酒、减轻体重、低钠饮食、或使用药物治疗，所述药物选自：抗生素、抗炎剂、抗病毒剂、免疫抑制剂、利尿剂、维生素（a、d、e和k）、用于代谢疾病的药物、和预防氨积累的药物。在一些实施方式中，所述疗法是抗病毒药物，所述抗病毒药物选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素、拉米夫定（lamivudine）、阿德福韦酯（adefovirdipivoxil）、恩替卡韦（entecavir）、替比夫定（telbivudine）和替诺福韦（tenofovir）。关于本发明所公开的方法，在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人类。在一些实施方式中，所述对象感染有b型肝炎病毒。关于本发明所公开的方法，在一些实施方式中，所述体液包含血液、尿液、唾液、母乳、淋巴液、血清和/或血浆中的一种或多种。在一些实施方式中，所述体液包含尿液。在一些实施方式中，所述外泌体的平均直径为从约10至约250nm。在一些实施方式中，所述外泌体是通过超速离心进行分离的。在一些实施方式中，所述外泌体是使用外泌体表面标记物从生物学样品中分离的。在一些实施方式中，所述外泌体被保留捕获表面上，所述捕获表面足以将所述外泌体部分保留在所述捕获表面上或其中。在一些实施方式中，所述捕获表面是带正电的。在一些实施方式中，所述捕获表面是包含再生纤维素或季铵盐的膜。在一些实施方式中，所述外泌体是使用外泌体特异性的抗体进行分离的。在一些实施方式中，所述抗体特异性结合至rab5b、hspa8、cd9、gapdh、actb、cd63、cd81、anxa2、eno1、hsp90aa1、eef1a1、pkm2、ywhae、sdcbp、pdcd61p、alb、ywhaz、eef2、actg1、ldha、hsp90ab1、aldoa、msn、anxa5、pgk1和cfl1。在一些实施方式中，所述外泌体是使用尺寸排阻色谱、过滤或免疫吸附捕获进行分离的。在一些实施方式中，外泌体的样品包含整个外泌体或外泌体裂解物。关于本发明所公开的方法，在一些实施方式中，所述确定步骤包含使用可检测的标记对所述一种或多种mirna进行标记。在一些实施方式中，所述确定步骤包含使用一种或多种多聚核苷酸探针捕获所述一种或多种mirna，所述多聚核苷酸探针选择性地结合所述一种或多种mirna中的每一个。在一些实施方式中，所述确定步骤包含使用实时聚合酶链式反应或核酸阵列。在一些实施方式中，本发明所公开的方法进一步包含施用用于所述疾病（例如纤维化、肝病、肝脏疾病或相关病症）的治疗药物的步骤。在另一个方面，本发明在此进一步公开了试剂盒，其包含一种或多种探针和/或引物，以确定表1和表2中列出的mirna中的一种或更多、两种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一种或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、或二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、五十种或更多、或五十五种或更多的表达图谱。在一些实施方式中，所述试剂盒包含探针和/或引物以确定在表1中列出的mirna中的一种或多种、二种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、五十种或更多、五十五种或更多、或全部的表达图谱。在进一步的方面，所述试剂盒进一步包括用于样品分离、和/或制备和/或测试的说明。在一些实施方式中，本发明所公开的试剂盒包含探针和/或引物，以确定一种或多种以下mirna的表达图谱，该mirna选自582-3p、22-3p、let-7a-5p、889-3p、3200-3p、642b-3p、let-7c-5p、let-7f-5p、148s-3p、16-5p、let-7g-5p、26a-5p、122-5p、195-5p、29c-3p、139-5p、509-5p、27b-3p、194-5p、let-7b-5p、191-3p、378a-3p、3939、2114-3p、188-3p、106b-30、942-5p、632、370-3p、566、15b-5p、548d-3p、147a、7-1-3p、936、551b-5p、3679-5p、616-3p、668-3p、7-2-3p、196a-3p、538b-5p、34b-3p、892a和500a-5p。[在图1a中的“正常化”]。在一些实施方式中，本发明所公开的试剂盒包含探针和/或引物，以确定一种或多种以下mirna的表达图谱，该mirna选自573、512-3p、20a-5p、200b-3p、20b-5p、2115-3p、466、3137、510-5p、4267、515-3p、24-2-5p、3117-3p、668-3p、132-3p、let-7e-5p、3074-3p、4260、4288、936、4254、148b-3p、378b、2909和193a-5p。[在图1b中的“持续化”]关于本发明所公开的试剂盒，在一些实施方式中，所述一种或多种探针和/或引物被可检测地标记。在一些实施方式中，使用酶促、放射性、荧光和/或发光的部分将所述探针和/或引物可检测地标记。在一些实施方式中，本发明所公开的试剂盒进一步包含从无疾病的对象的体液中分离的外泌体的纯化的或分离的群体、或从外泌体的所述群体分离的核酸，作为阴性对照。在一个方面，所述无疾病的对象为被认定不具有相应疾病（例如没有纤维化疾病或肝病）的对象。在一些实施方式中，本发明所公开的试剂盒进一步包含从被诊断有纤维化、肝或肝脏疾病或相关的病症的对象的体液中分离的外泌体的纯化的或分离的群体、或从外泌体的所述群体分离的核酸，作为阳性对照。在一些实施方式中，所述被诊断患有纤维化疾病、肝或肝脏疾病或相关的病症的对象对于用于所述疾病或病症的疗法是有抗性的。在一些实施方式中，所述被诊断患有纤维化疾病、肝或肝脏疾病或相关的病症的对象对于用于所述疾病或病症的疗法是有响应的。在一些实施方式中，所述疗法是停止饮酒、减轻体重、低钠饮食、或使用药物治疗，所述药物选自：抗生素、抗炎剂、抗病毒剂、免疫抑制剂、利尿剂、维生素（a、d、e和k）、用于代谢疾病的药物、和预防氨积累的药物。在一些实施方式中，所述疗法是抗病毒药物，所述抗病毒药物选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定和替诺福韦。附图说明图1a和1b示出了热图，其描绘了与健康的对照相比在肝硬化患者中具有±15倍表达变化（范围：+10,000倍（红色）至-1500倍（绿色））的血清外泌体mir（左排）以及在治疗后的相同患者中相同的血清外泌体mir（右排）。（图1a）在已知在抗病毒治疗后纤维化改善的患者中的外泌体mir。在图1a中的mir将识别患有肝硬化的患者。在此小图中，被标记为“正常化”的mir代表了在抗病毒治疗后纤维化将减少的患者的纤维化标记物；（图1b）在已知在抗病治疗后纤维化不会改善的患者中的外泌体mir。在图1b中的mir将识别肝硬化。在此小图中，被标记为“持续化”（在治疗后的表达相似或恶化）的mir代表了可以在抗病毒治疗前或后被确定为对纤维化的逆转有抗性的患者的标记物。在图1a-1b示出的数值可以在实施例中的表1和2中找到。发明详述在整个本说明书中，通过标识引用将各种出版物、专利和公开的专利说明书进行引用。这些出版物、专利以及公开的专利说明书的公开在此以引用方式并入本说明书，以更充分地描述本发明所属
技术领域：
的技术状态。除非特别说明，否则本发明的实践采用在现有技术的范围内的分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学的技术。在文献中这样的技术被充分地阐明，例如在以下的出版物中。参见，例如sambrookandrusselleds.molecularcloning:alaboratorymanual,第三版(2001)；currentprotocolsinmolecularbiology丛书(f.m.ausubeletal.eds.(2007))；methodsinenzymology丛书(academicpress,inc.,n.y.)；pcr1:apracticalapproach(m.macphersonetal.irlpressatoxforduniversitypress(1991))；pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hamesandg.r.tayloreds.(1995))；antibodies,alaboratorymanual(harlowandlaneeds.(1999))；cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique(r.i.freshney第五版(2005))；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.(1984))；mullisetal.美国专利号4,683,195；nucleicacidhybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.(1984))；nucleicacidhybridization(m.l.m.anderson(1999))；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higginseds.(1984))；immobilizedcellsandenzymes(irlpress(1986))；b.perbal,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.millerandm.p.caloseds.(1987)coldspringharborlaboratory)；genetransferandexpressioninmammaliancells(s.c.makridesed.(2003))immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayerandwalker,eds.,academicpress,london(1987))；weir’shandbookofexperimentalimmunology(l.a.herzenbergetal.eds(1996))。定义如本文所使用的，某些术语可以具有下述的限定的含义。如说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文中明确地规定，否则单数形式“一个”、“一种”、“所述”包含单数和复数形式。例如术语“一种/一个细胞”包括单个细胞以及多个细胞，包括其混合物。如本文所使用的，术语“包含/包括”旨在意为组合物和方法包含所列举的要素但不排除其他。当使用“基本上由……组成”来限定组合物和方法时，应该意为排除对所述组合物或方法有任何重要意义的其他要素。“由……组成”应该意为对于要求保护的组合物和实质性的方法步骤排除高于痕量的元素的其他组分。由每个这些转变术语所限定的实施方式在本发明的范围内。因此，意为方法和组合物可以包括额外的步骤和组分（包含），或包括没有意义的步骤和组合物（基本上由……组成），或指仅包括表明的方法步骤或组合物（由……组成）。所有的数字标示（包括范围），例如ph、温度、时间、浓度和分子质量，都是近似值，其通过0.1的增量变化（+）或(-)。应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但术语“约”位于所有的数字标示之前。除了较少增量的x（例如“x+0.1”或“x-0.1”）之外，术语“约”还包括精确数值“x”。还应当理解的是，尽管并非总是明确地表明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物是本领域已知的。如本文所用的，术语“外泌体”意为具有从约10nm至约2,000nm的平均直径的膜体。所述术语包括微囊泡和外泌体。微囊泡又称为循环的微囊泡或微颗粒，并且是从几乎所有细胞类型中脱落的近似直径范围为从100nm至1000nm的质膜的片段。对于本发明的目的，除非特别地指出，否则术语外泌体还包括较小的细胞内生成的细胞外囊泡，其通过多囊泡体（mvb）的界膜的向内芽殖形成，在与质膜融合时所述mvb导致它们的分泌以及在体液（例如血液、尿液）里沉积。外泌体含有microrna（mir）、mrna以及蛋白质的复杂混合物，其反映了生产细胞的转录和翻译的状态。外泌体的平均直径为从约10至约250nm、或从约10至约200nm、或从约10至175nm、或从约25至175nm、或从约40至约250nm、或从约40至约200nm、或从约50至250nm、或从约50至200nm、或从约50-150nm。外泌体膜囊泡由从mvb的界膜向内芽殖而产生。当mvb与质膜融合时，外泌体从细胞中被释放，穿过细胞间隙，并且可以被相邻的细胞摄取(johnstone,r.m.(2006)bloodcellsmol.dis.36(2):315-321；thery,c.(2011)f1000biol.rep.3:15；thery,c.etal.(2002)nat.rev.immunol.2(8):569-579)。外泌体含有mir、mrna和蛋白质的复杂混合物，并且可以从如本文所述的以及本领域已知的各种体液中分离。如本文所述，术语“纤维化”意指由于炎症、刺激或愈合而形成异常量的不溶的瘢痕组织。它是常见的并且高度衰竭性的病理学以及疾病（例如系统性硬化症，肾源性、肺源性或心源性高血压，心肌梗塞和慢性肝病（例如肝炎、酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝炎））的末期表现。大量的研究表明，在不同器官系统中的纤维化共有相同的机制，包括炎症、延长的伤口愈合反应、促纤维化信号的激活、增加的基质沉积以及降低的基质降解、增加的组织刚度、以及组织弹性的损失。在组织结构中的这些改变都共同地合作以引起正常细胞功能和活力的损失。因此对于在广泛的各种纤维化器官系统中的或在正经历其他类型的瘢痕形成反应中的拮抗纤维生成的通路，抗纤维化的干预将可能具有实用性。如本文所用的，术语“纤维化疾病或病症”意指具有纤维化组织的症状和临床标记物的病理性的病症，例如系统性硬化，肾源性、肺源性或心源性高血压，心肌梗塞和慢性肝病（例如肝炎、酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝炎）。在表3中提供了纤维化病征的非限制的例子，如下。表3如本文所使用，“无疾病对象”意指不被诊断患有纤维化疾病的对象。在一个方面，所述无疾病对象是不具有肝纤维化和/或肝病的临床诊断和/或具有正常肝功能的对象。用于确定对象是否患有纤维化疾病的临床参数是本领域已知的并且在本文中简要地描述。不受限制地，用于评估肝功能的示例性的临床测试包括：血清胆红素测试、血清碱性磷酸酶测试、凝血酶原时间测试、丙氨酸转氨酶测试、天冬氨酸转氨酶测试、γ谷氨酰转肽酶测试、乳酸脱氢酶测试、α-胎蛋白测试、线粒体抗体测试和血清α-1抗胰蛋白酶测试。用于检测及诊断肝纤维化的临床测试包括但不限于：pga指数、fib-4指数、纤维蛋白检测（fibrometer）、fibrosure、act-测试、safe、heapscore、fibroq、aar、apri、cds、api、pohls评分、loks模型、肝活检、超声检查、计算机断层扫描、超声弹性成像和磁共振弹性成像。例如，当纤维化病征是肝纤维化时，上述的测量可以与批准用于肝功能和/或肝纤维化的临床测试相结合。术语“识别”是将患者与可能经历对于治疗的相同或相似的临床反应的一组或一群患者密切关联或联系。当提及基因产物时，术语“蛋白质”“多肽”以及“肽”在本文中被可交换地使用。术语“标记物”是指感兴趣的基因或mirna的临床的或亚临床的表达。应用于基因的“表达”，是指从该基因转录的mir或mrna的或该基因编码的蛋白质产物的差异性的生成。与给定的患者群体的正常或对照细胞、或内部对照基因（管家基因）的表达水平相比，差异表达的基因可以是过表达的（高表达）或表达不足（低表达）。在一个方面，差异表达是指与在对照样品中检测的表达水平相比更高或更低约1.5倍、或约2.0倍、或约2.0倍、或约3.0倍、或约5倍、或约10倍、或约50倍、或进一步超过约100倍。在本发明的一个方面，“预设的阈值水平”或“阈值”被用于将表达分类为高或低。作为本发明的非限制性的例子，外泌体的mir的阈值水平，是在已经被诊断为纤维化或肝病或相关病症的对象中发现的mir表达的水平。另选地或另外地，该预设的阈值水平是在随后的测量之前（例如在治疗之前、或在额外剂量的该治疗之前）的该个体对象的测量的mirna表达水平。在本发明的一个方面，mir的表达可以被提供为超过阈值水平的比率，并且因此可以被分类为高表达或上调的，而低于所述阈值水平的比率被分类为下调的或低表达。在另一方面，通过如下方法确定“表达”水平：测量给出的患者群体的感兴趣的基因的表达水平，确定所述群体的该基因的中等表达水平，以及将单个患者的相同基因的表达水平与所述给定的患者群体的中等表达水平进行比较。例如，如果所述单个患者的感兴趣的基因的表达水平被确定为在所述患者群体的中等表达水平之上，则该患者被确定为具有感兴趣的该基因的高表达（上调的）。或者，如果所述单个患者的感兴趣的基因的表达水平被确定为在所述患者群体的中等表达水平之下（下调的），则该患者被确定为具有感兴趣的该基因的低表达。“内部对照”或“管家（housekeeping）”基因是指其存在使得基因或感兴趣的基因的表达水平的评估成为可能的任意的被组成性或全局性地表达的基因。这样的评估包含确定总的基因转录的组成水平和在抽样误差中的变化的对照。这样的基因的例子包括但不限于rnu6-2、cel-mir-39、snord61、snord68、snord72、snord95、snord96a、gadph和/或β-肌动蛋白。“细胞”、“宿主细胞”或“重组的宿主细胞”是在本文中可交换使用的术语。应当理解的是，这样的术语不仅指特定的目标细胞，而且还指这样的细胞的子代或潜在子代。因为由于突变或环境影响导致某些修饰可能出现在后代中，所以这样的子代实际上可能与亲代细胞不相同，但是其仍被包括在本文所用的术语的范围内。短语“多聚核苷酸的扩增”包括例如pcr、连接扩增（或连接酶链式反应，lcr）方法以及扩增方法。这些方法是本领域已知的并且广泛地实践的。参见例如美国专利号4,683,195和4,683,202以及innisetal.,1990(关于pcr);以及wu,d.y.etal.(1989)genomics4:560-569(关于lcr)。一般来说，pcr的步骤描述了基因扩增的方法，其包括以下步骤：（i）引物与在dna样品（或文库）中的特异性基因的序列特异性杂交，（ii）涉及多轮的使用dna聚合酶的退火、延长和变性的随后的扩增，以及（iii）筛选pcr产物以获得正确尺寸的条带。所使用的引物是足够长度及适当序列的寡核苷酸，以提供聚合的引发，即每个引物被特异性地设计来与每条链的待扩增的基因位点互补。用于实施pcr的试剂和硬件是商业上可获得的。有助于扩增来自特定基因区域的序列的引物，优选地与在靶定区域或在其侧翼区域的序列互补及特异性地杂交。可直接对通过扩增生成的核酸序列进行测序。或在测序分析前克隆该扩增的序列。用于酶促扩增的基因组片段的直接克隆和测序分析的方法是本领域已知的。当被应用至多聚核苷时，术语“编码”是指这样的多聚核苷酸，如果在其天然状态或通过本领域技术人员已知的方法对其进行操纵时，可以从它的基因进行转录和/或从它的mrna进行翻译，以生成所述多肽和/或其片段，则称其“编码”多肽。反义链是这样的核酸的补体，并且可以从中推导出编码序列。“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或在两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较在为了进行比较而对齐的每个序列中的位置，来确定同源性。当在比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是序列共有的匹配的或同源的位置的数量的函数。“不相关的”或“非同源的”序列与本发明的其中一个序列共有低于40%同一性，优选地低于25%同一性。如本文所用的术语“互相作用”意为包括分子之间的可检测的相互作用，例如可以使用如杂交试验进行检测。术语相互作用也意为包括分子之间的“结合的”相互作用。相互作用可以是例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋白质-小分子或小分子-天然核酸。如本文所用的术语“分离的”是指大体上不含其他材料的分子或生物或细胞材料。在一个方面，术语“分离的”是指与在天然来源中存在的其他dna或rna、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分别分离的核酸（例如dna或rna）、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官。术语“分离的”也指当通过重组dna技术生产时，大体上不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或者指当化学合成时，大体上不含化学前体或其他化学物质的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意为包括非天然作为片段而产生并且在天然状态中不会发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指这样的多肽，其与其他细胞蛋白分离并且意为包含纯化和重组的多肽两者。术语“分离的”在本文也用于指与其他细胞或组织分离的细胞或组织，并且意为包含培养的和工程化的细胞或组织两者。“血细胞”是指血液中的含有的任意的细胞。血细胞也称为红血球、或白血球、或血球。血细胞的非限制性的例子包括血白细胞、血红细胞以及血小板。当应用于基因时，“表达”是指从该基因转录的mir或mrna的生产，或该mrna编码的蛋白质产物。可以通过测量在细胞或组织样品中的mir或mrna或蛋白质的数量，确定基因的表达水平。在一个方面，通过与作为内部对照的管家基因相比的相对水平，表示基因的表达水平。在另一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与来自使用内部对照的不同样品的该基因的表达水平直接地进行比较，以移除取样误差。“差异表达”、“过度表达”或“表达不足”，是指与在对照样品中该基因的表达水平相比，在测试样品中基因的增加的或降低的表达或者存在差异的表达。在一个方面，测试样品是病变细胞，而对照样品是正常细胞。在另一个方面，测试样品是被实验操纵的或生物学上被改变的细胞，而对照样品是在所述实验操纵或生物学上改变之前的细胞。在另一个方面，测试样品是来自患者的样品，而对照样品是来自健康个体的相似的样品。在又一个方面，测试样品是来自患者的样品，而对照样品是来自不具有期望的临床结果的患者的相似的样品。在一个方面，差异表达比在对照样品中检测的表达水平高或低约1.5倍、约2.0倍、或约2.0倍、或约3.0倍、或约5倍、或约10倍、或约50倍、或进一步超过约100倍。或者，该基因被称为“过度表达”或“表达不足”。或者，该基因也可被称为“上调的”或“下调的”。本文所用的用于基因的“预设值”是这样选择的，该基因的表达水平高于该预设值的患者，与相同基因的表达水平低于该预设值的患者相比，可能经历更期望或更不期望的临床结果，反之亦然。基因（例如在本发明中公开的那些）的表达水平是与临床结果相关的。本领域的技术人员可以通过以下方法确定基因的预设值：将具有更期望的临床结果的患者中的基因的表达水平，与具有较不期望的临床结果的进行比较。在一个方面，预设值是这样的基因表达值，其将患者最佳地分为具有更期望的临床结果的组以及具有较不期望的临床结果的组。可以使用本领域熟知的方法数学地或统计学地确定这样的基因表达值。或者，高于该预设值的基因表达简单地称为“高表达”，或低于该预设值的基因表达简单地称为“低表达”。简而言之并且仅出于说明的目的，本领域的技术人员可以通过以下方法确定预设值：将具有更期望的临床参数的患者中的基因的表达值，与具有较不期望的临床参数的进行比较。在一个方面，预设值是这样的基因表达值，其将患者最佳地分为具有更期望的临床参数的组以及具有较不期望的临床参数的组。可以使用本领域熟知的方法数学地或统计学地确定这样的基因表达值。如本文所用的，术语“核酸”是指多聚核苷酸，例如脱氧核苷酸（dna）以及适当时的核糖核苷酸（rna）。该术语也应被理解来包括作为等效物的由核苷酸类似物制得的rna或dna的衍生物、变体和类似物，以及适用于所述的实施方式的单链（正义或反义）和双链多聚核苷酸。脱氧核苷酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。为了清楚起见，当本文提及核酸的核苷酸（其可以是dna或rna）时，使用术语“腺苷”、“胞苷”、“鸟苷”以及“胸苷”。应当理解的是，如果核酸是rna，则含有尿嘧啶的核苷酸是尿苷。术语“寡核苷酸”或“多聚核苷酸”或其“部分”或“片段”是指一段多聚核苷酸残基，其足够长来在pcr或各种杂交程序中使用以识别或扩增mir或mrna或dna分子的相同或相关部分。本领域的技术人员将容易理解，本发明的多聚核苷酸组合物包括mir、rna、cdna、基因组dna、合成形式、以及混合的多聚物（正义和反义链两者），并且其可以被化学地或生物学地修饰，或可含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。这样的修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸、核苷酸之间的修饰（例如不带电的连接（例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等）、带电的连接（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）、侧链部分（例如多肽）、嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）、螯合剂，烷化剂）和修饰的连接（例如α异头核酸等）。其还包括模拟多聚核苷酸通过氢键和其他化学相互作用以结合至指定序列的能力的合成的分子。这样的分子是本领域已知的，并且包括例如其中肽键取代分子的骨架中的磷酸键。microrna、mirna或mir是长度为19-25个核苷酸的单链rna分子，其调节基因表达。mirna由基因编码，它们从该基因的dna转录而来，但mirna不被翻译成蛋白（非编码rna）；相反，每个初级转录物（pri-mirna）被加工成短茎-环结构（称为pre-mirna），并且最终加工成功能性mirna。成熟的mirna分子与一种或多种信使rna（mrna）分子是部分互补的，并且它们的主要功能是下调基因表达。当标记物被用作筛选用于本文所述的治疗的患者的基础时，在治疗前和/或其期间测量该标记物，并且获得的值被临床医生使用在评估任意下述情况中：（a）个体开始接受治疗的大概或可能的适宜性；（b）个体开始接受治疗的大概或可能的不适宜性；（c）对于治疗的响应性；（d）个体继续接受治疗的大概或可能的适宜性；（e）个体继续接受治疗的大概或可能的不适宜性；（f）调整剂量；（g）预测临床益处的可能性；（h）毒性。如本领域技术人员将充分理解的，在临床环境中基因标记物或多态性的测量清楚表明，此参数被用作开始、继续、调节、和/或停止本文所述的治疗的施用的基础。如本文所用的术语“治疗”是指包含治愈和改善病征或疾病的至少一个症状。例如，在肝纤维化的情况中，术语“治疗”是指治疗医生或助手的临床评估更有利和/或纤维化标记物（例如αsma、ctgf、胶原蛋白、基质分子）的表达降低和/或在诊断肝功能和/或肝纤维化的测试中读数转向正常。“有效量”旨在表示最可能产生对治疗的期望的响应的施用或递送至对象的组合物、化合物、或试剂（外泌体）的量。该量通过患者的临床参数（包括但不限于疾病的阶段、年龄、性别和组织学）凭经验地确定。术语“血液”是指包括在对象中循环的血液的全部组份，包括但不限于，红血细胞、白血细胞、血浆、凝血因子、小蛋白质、血小板和/或冷沉淀物。这通常是当人类患者献血时捐献的血液的类型。“组合物”旨在意为活性的外泌体或外泌体群体和另一个化合物或组合物的组合，后者是惰性的（例如可检测标记或生理盐水）或活性的（例如治疗化合物或组合物），是单独的或与载体组合，在一个实施方式中所述载体可以是简单的载体，例如生理盐水或如下文所限定的药学上可接受的或固相支持物。“药物组合物”旨在包括活性外泌体或外泌体群体与载体的组合，该载体是惰性的或活性的（例如固相支持物），使得该组合物适用于体外、体内或间接体内的诊断的或治疗的用途。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”包含任意的标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲生理盐水溶液、水以及乳剂（例如油/水或水/油乳剂）以及各种类型的湿润剂。该组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、固定剂和辅助剂的例子，参见martin(1975)remington’spharm.sci.,15thed.(mackpubl.co.,easton)。“对象”、“个体”或“患者”在本文中可互换地使用，并且是指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类。哺乳动物包括但不限制于，小鼠、大鼠、兔、类人猿、牛、羊、猪、犬、猫、农场动物、运动动物、宠物、马和灵长类动物（特别是人类）。“给药/施用”可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行。确定最有效的施用的方式和剂量的方法是本领域的技术人员已知的，并且会随着用于治疗的组合物、治疗的目的、被治疗的靶细胞、被治疗的疾病以及被治疗的对象而变化。可以以治疗医生选择的剂量水平和模式实施单次或多次给药。适当的剂量配方以及施用药剂的方法是本领域已知的。还可以确定给药的途径，并且确定最有效的给药途径的方法是本领域技术人员已知的，并且会随着用于治疗的组合物、治疗的目的、被治疗的对象的健康情况或疾病阶段、以及靶细胞或组织而变化。给药途径的非限制性的例子包括口服给药、鼻腔给药、吸入、注射和局部应用。可以通过任意的适当的给药途径，将本发明的药剂施用于治疗。应当理解的是，优选的途径将随着接受者的病症和年龄以及所治疗的疾病而变化。诊断方法本发明提供了诊断方法。在一个方面，通过在治疗之前、期间和/或之后从对象中分离的外泌体的样品中，确定在表1和表2中列出的一种或多种mir的表达水平，以监控疗法和对象的健康。该方法可以进一步包含以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：从对象中分离的外泌体的样品中，确定在表1或表2中列出的mirna中的一种或更多、两种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一种或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、五十种或更多、五十五种或更多、或全部的表达水平。所述方法在对象（例如哺乳动物、动物或进一步人类患者）的诊断中是有用的。仅出于说明的目的，哺乳动物包括但不限于人类、类人猿、小鼠、大鼠、牛、犬、猫、马、猪或羊。在一些实施方式中，本发明公开了用于确定对象是否患有纤维化疾病或肝病的方法，其包含在从该对象的体液分离的外泌体的样品中，确定在表1和2中列出的一种或多种mirna的表达水平，其中与对照相比，一种或多种mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明该对象患有纤维化疾病或肝病。在一些实施方式中，该肝病是肝脏的硬化。在一些实施方式中，所述对象感染了b型肝炎病毒。在一个方面，本发明公开了一种确定对象是否患有、或更可能患有或较不可能患有纤维化疾病（例如肝硬化）的方法，其包含在从该对象的体液分离的外泌体的样品中，确定在表1中列出的一种或多种mirna的表达水平，其中与对照相比一种或多种mir的差异表达，表明该对象患有、或更可能患有该疾病。本发明进一步公开了确定患有纤维化或肝病的对象是否更可能或较不可能对治疗该疾病的疗法响应的方法，其包含在从该对象的体液分离的外泌体的样品中，确定在表1和2中列出的一种或多种mirna的表达水平，其中与对照相比一种或多种以下mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明该对象更可能对疗法响应，该mirna选自582-3p、22-3p、let-7a-5p、889-3p、3200-3p、642b-3p、let-7c-5p、let-7f-5p、148s-3p、16-5p、let-7g-5p、26a-5p、122-5p、195-5p、29c-3p、139-5p、509-5p、27b-3p、194-5p、let-7b-5p、191-3p、378a-3p、3939、2114-3p、188-3p、106b-30、942-5p、632、370-3p、566、15b-5p、548d-3p、147a、7-1-3p、936、551b-5p、3679-5p、616-3p、668-3p、7-2-3p、196a-3p、538b-5p、34b-3p、892a和500a-5p[在图1a中的“正常化”]；和/或其中与对照相比一种或多种mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明该对象较不可能对该疗法响应，该mirna选自573、512-3p、20a-5p、200b-3p、20b-5p、2115-3p、466、3137、510-5p、4267、515-3p、24-2-5p、3117-3p、668-3p、132-3p、let-7e-5p、3074-3p、4260、4288、936、4254、148b-3p、378b、2909和193a-5p[在图1b中的“持续化”]。在一些实施方式中，与对照相比，至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、或至少15倍的一种或多种本发明公开的mirna的差异表达，表明该对象更可能对该疗法响应。在一些实施方式中，与对照相比，至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍，至少12倍、至少13倍、至少14倍、或至少15倍的一种或多种本发明公开的mirna的差异表达，表明该对象可能对该疗法不响应。在一些实施方式中，本发明公开了确定患有纤维化疾病或肝病的对象是否更可能或较不可能经历逆转（例如纤维化或肝脏疾病的逆转）的方法，其包括在从所述对象的体液分离的外泌体的样品中，确定在表1和2中列出的一种或多种mirna的表达水平，其中与对照相比，一种或多种以下mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明所述对象更可能经历逆转，该mirna选自582-3p、22-3p、let-7a-5p、889-3p、3200-3p、642b-3p、let-7c-5p、let-7f-5p、148s-3p、16-5p、let-7g-5p、26a-5p、122-5p、195-5p、29c-3p、139-5p、509-5p、27b-3p、194-5p、let-7b-5p、191-3p、378a-3p、3939、2114-3p、188-3p、106b-30、942-5p、632、370-3p、566、15b-5p、548d-3p、147a、7-1-3p、936、551b-5p、3679-5p、616-3p、668-3p、7-2-3p、196a-3p、538b-5p,、34b-3p、892a和500a-5p[在图1a中的“正常化”]；和/或其中与对照相比，一种或多种以下mirna的至少两倍或更多的差异表达，表明所述对象较不可能经历逆转，该mirna选自573、512-3p、20a-5p、200b-3p、20b-5p、2115-3p、466、3137、510-5p、4267、515-3p、24-2-5p、3117-3p、668-3p、132-3p、let-7e-5p、3074-3p、4260、4288、936、4254、148b-3p、378b、2909and193a-5p[图1b中的“持续化”]。在一些实施方式中，与对照相比，至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍，至少12倍、至少13倍、至少14倍、或至少15倍的一种或多种本发明公开的mirna的差异表达，表明该对象更可能经历纤维化或肝病的逆转。在一些实施方式中，与对照相比，至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍，至少12倍、至少13倍、至少14倍、或至少15倍的一种或多种本发明公开的mirna的差异表达，表明该对象可能经历纤维化或肝病的逆转。关于本发明公开的方法，在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人类。在一些实施方式中，所述对象感染了b型肝炎病毒。在一些实施方式中，用于纤维化疾病或肝病的疗法选自但不限于：停止饮酒、减轻体重、低钠饮食、或使用药物治疗，所述药物选自：抗生素、抗炎剂、抗病毒剂、免疫抑制剂、利尿剂、维生素（a、d、e和k）、用于代谢疾病的药物、和预防氨积累的药物。在一些实施方式中，所述疗法是抗病毒药物，所述抗病毒药物选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定和替诺福韦。对于外泌体mir分析，体液样品（例如尿液、血液、唾液、母乳、淋巴液、血清或血浆）的收集，可以用本领域已知的方法完成。在一些实施方式中，外泌体是在mir图谱确定之前从样品中分离的。可以使用本发明公开的在本领域公认的方法中的方法，从液体中纯化外泌体，例如通过如theryetal.(2006)“isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids”curr.protoc.cellbiol.,chapter3所述、或如hongetal.(2014)plosone9(8):e103310,doe:10,1371andjayachandranetal.(2012)j.immun.methods,375:207-214所公开的超速离心。也可用商业化试剂盒，例如pureexo(101bio,paloaltoca,用于血清和血浆)、exomirplus(biooscientific,austintx,usa)、exoquick(sbi,mountainview,ca,usa,用于组织培养)和exo-spinkit(cellguidancesystems,carlsbadca,usa)。如本领域技术人员显而易见的是，分离方法将取决于待分离的外泌体的大小和组成。作为例子，可以使用超速离心，但对于较大的微囊泡，速度应该不超过70,000g或者约60,000g。或者，超速离心用于较小的外泌体（但是小得多），则需要90,000或100,000g或更高的速度。在一些实施方式中，外泌体是通过超速离心进行分离的。在一些实施方式中，外泌体是使用外泌体表面标记物从生物学样品中分离的。在一些实施方式中，外泌体被保留在捕获表面上，所述捕获表面足以将所述外泌体部分保留在所述捕获表面上或其中。在一些实施方式中，捕获表面是带正电的。在一些实施方式中，所述捕获表面是包含再生纤维素或季铵盐的膜。在一些实施方式中，所述外泌体是使用外泌体特异性的抗体分离的。在一些实施方式中，所述抗体特异性结合至rab5b、hspa8、cd9、gapdh、actb、cd63、cd81、anxa2、eno1、hsp90aa1、eef1a1、pkm2、ywhae、sdcbp、pdcd61p、alb、ywhaz、eef2、actg1、ldha、hsp90ab1、aldoa、msn、anxa5、pgk1和cfl1。在一些实施方式中，所述外泌体是使用尺寸排阻色谱、过滤或免疫吸附捕获进行分离的。在一个方面，外泌体的平均直径为从约10至约250nm，或从约10至约200nm，或从约10至175nm，或从约25至175nm，或从约40至约250nm，或从约40至约200nm，或从约50至250nm，或从约50至200nm，或从约50-150nm。在另一个方面，术语外泌体还包括近似直径范围从100nm至1000nm的微囊泡。在一些实施方式中，被分析的外泌体的样品包含整个外泌体或外泌体裂解物。可以通过本领域已知的以及在本文简述的方法（例如pcr），完成表达水平或活性水平的测量。可以将该测量与适当的对照进行比较，该对照例如是对于该对象的在先的测量或适当的内部对照。关于本发明公开的方法，在一些实施方式中，所述确定步骤包含使用可检测的标签对一种或多种mirna进行标记。在一些实施方式中，所述确定步骤包含使用一种或多种多聚核苷酸探针捕获所述一种或多种mirna，所述探针选择性地结合所述一种或多种mirna的每一个。在一些实施方式中，所述确定步骤包含使用实时聚合酶链式反应或核酸列阵。在一些实施方式中，本发明公开的方法进一步包含施用用于纤维化、肝病或相关疾病的治疗药物的步骤。在一些实施方式中，所述治疗药物选自：抗生素、抗炎剂、抗病毒剂、免疫抑制剂、利尿剂、维生素（a、d、e和k）、用于代谢疾病的药物、和预防氨积累的药物。在一些实施方式中，所述治疗药物是抗病毒药物，选自干扰素α、聚乙二醇化干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定和替诺福韦。在一些实施方式中，所述治疗药物是从无疾病对象的体液中分离的外泌体的纯化的或分离的群体。上述的mirna标记物的测量可以与临床参数结合。不受限制地，用于评估肝功能的示例性的临床测试包括：血清胆红素测试、血清碱性磷酸酶测试、凝血酶原时间测试、丙氨酸转氨酶测试、天冬氨酸转氨酶测试、γ谷氨酰转肽酶测试、乳酸脱氢酶测试、α-胎蛋白测试、线粒体抗体测试和血清α-1抗胰蛋白酶测试。用于检测及诊断肝纤维化的临床测试包括但不限于：pga指数、fib-4指数、纤维蛋白检测（fibrometer）、fibrosure、act-test、safe、heapscore、fibroq、aar、apri、cds、api、pohls评分、loks模型、肝活检、超声检查、计算机断层扫描、超声弹性成像和磁共振弹性成像。例如，当纤维化病症是肝纤维化时，上述测量可以与用于肝功能和/或肝纤维化的已批准的临床测试结合。在另一个方面，本发明进一步公开了包含一种或多种探针和/或引物的试剂盒，以确定在表1和2中列出的mirna中的一种或更多、两种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、五十种或更多、五十五种或更多的表达图谱。在一些实施方式中，该试剂盒包含探针和/或引物，以确定在表1中列出的mirna中的一种或更多、两种或更多、三种或更多、或四种或更多、或五种或更多、或六种或更多、或七种或更多、或八种或更多、或九种或更多、或十种或更多、或十一或更多、或十二种或更多、或十三种或更多、或十四种或更多、或十五种或更多、或十六种或更多、或十七种或更多、或十八种或更多、或十九种或更多、或二十种或更多、二十一种或更多、或二十二种或更多、或二十三种或更多、或二十四种或更多、或二十五种或更多、或二十六种、或二十七种或更多、或二十八种或更多、或二十九种或更多、或三十种或更多、三十五种或更多、四十种或更多、四十五种或更多、五十种或更多、五十五种或更多、或全部的表达图谱。在一些实施方式中，本发明公开的试剂盒包含探针和/或引物，以确定一种或多种以下mirna的表达图谱，该mirna选自582-3p、22-3p、let-7a-5p、889-3p、3200-3p、642b-3p、let-7c-5p、let-7f-5p、148s-3p、16-5p、let-7g-5p、26a-5p、122-5p、195-5p、29c-3p、139-5p、509-5p、27b-3p、194-5p、let-7b-5p、191-3p、378a-3p、3939、2114-3p、188-3p、106b-30、942-5p、632、370-3p、566、15b-5p、548d-3p、147a、7-1-3p、936、551b-5p、3679-5p、616-3p、668-3p、7-2-3p、196a-3p、538b-5p、34b-3p、892a和500a-5p。[在图1a中的“正常化”]。在一些实施方式中，本发明公开的试剂盒包含探针和/或引物，以确定一种或多种以下mirna的表达图谱，该mirna选自573、512-3p、20a-5p、200b-3p、20b-5p、2115-3p、466、3137、510-5p、4267、515-3p、24-2-5p、3117-3p、668-3p、132-3p、let-7e-5p、3074-3p、4260、4288、936、4254、148b-3p、378b、2909和193a-5p。[图1b中“持续化”]。关于本发明公开的试剂盒，在一些实施方式中，一种或多种探针和/或引物被可检测地标记。在进一步方面，该试剂盒进一步包含可检测的标记，该可检测的标记在一方面被连接至该探针和/引物，其中在一个方面，该可检测的标记不是多聚核苷酸。在一些实施方式中，该探针和/或引物被可检测地标记有酶促、放射性、荧光和/或发光的部分。在一个方面，可检测的标记不是天然荧光或可检测的多聚核苷酸。在一些实施方式中，本发明公开的试剂盒进一步包含从无疾病的对象中分离的外泌体的纯化的或分离的群体，或从所述外泌体群体中分离的核酸，作为阴性对照。在一些实施方式中，本发明公开的试剂盒进一步包括从被诊断患有纤维化、肝或肝脏疾病或相关病症的对象的体液中分离的外泌体的纯化的或分离的群体，或从所述外泌体群体中分离的核酸，作为阳性对照。在一些实施方式中，所述被诊断患有纤维化、肝或肝脏疾病或相关病症的对象对用于所述疾病或病症的疗法是有抗性的。在一些实施方式中，所述被诊断患有纤维化、肝或肝脏疾病或相关病症的对象对于用于所述疾病或病症的疗法是响应的。下述的例子旨在进行说明，而非限制本文所公开的。例如，尽管注意到这些例子是用于治疗纤维化或肝脏疾病或相关病症的外泌体组合物的分离、纯化和使用，但是可以修改所述方法和组合物用于治疗本文所述的其他纤维化疾病。实施例实施例1.hbv诱导的肝纤维化的治疗和恢复我们的分析涉及在nct01938781（hbv-诱导的肝纤维化的优化的治疗和恢复）中登记的患者的研究。在此介入性、随机性、开放性的研究中，慢性b型肝炎（chb）患者（年龄18-65岁，男性或女性，治疗-初治）提供了书面同意，并且随机地被分配来接受（a）恩替卡韦（etv；用于b型肝炎病毒（hbv）的抗病毒药物）单独使用2年或（b）etv使用首先的1/2年，etv+聚乙二醇干扰素（pegsys）使用1年，etv使用最后的1/2年。在治疗之前以及每六个月，评估患者的血球计数、肝功能试验（lft）、hbvdna、α-胎蛋白、凝血酶原时间、甲状腺功能、肝脏超声检查和瞬时弹性成像（fibroscan®）。首要的目标是建立hbv-诱导的肝纤维化的消退率，其由在治疗之前以及在最初治疗后的1½年进行的肝脏活检评估。次要的目标包括在1和2年的治疗之后的hbvdna不可检测率、hbe和hb抗原血清转换、以及fibroscan分数。入选标准是：年龄≥18岁、诊断有chb（hbsag阳性超过6个月）以及可检测的hbvdna（>1000个拷贝/ml）。排除标准是与hcv或hiv合并感染、除了由于hbv造成的之外的肝病、代偿失调的肝脏疾病、器官移植、自身免疫性疾病、每天饮酒量>20g/天、以及静脉注射毒品的既往史。在第一次分析中，在用恩替卡韦（口服5mg/天）治疗6个月之后，基于他们已知的纤维化消退（降低的fibroscan值>5kpa），选择了12名患有代偿性肝硬化的hbv患者。12名匹配的健康血液捐献物被用作参比对照组。来自hbv患者的血清（0.5ml）（在治疗前或后）或者来自对照的血清被单独地处理以纯化外泌体，然后从其中分离出小rna。用mirscriptrtii验证rna质量并逆转录rna。使用人类mirnomepcr阵列汇集以及分析在每一个组中的样品，以使用sybrgreen实时pcr将1066个表达最丰富的人类mir序列进行图谱化。计算对于在该阵列上的每个特征的倍数变化值。具有≥±2倍变化的基因被认为是差异表达（表1）。此客观的分析表明，与对照对象相比，在肝硬化患者中1066种mir中的59种被上调或下调至少15倍，表明这59种mir是hbv肝硬化的标记物。进一步，在治疗后59种mir中的46种显示了更正（至更接近健康对照的样品的水平）（图1a）。在被识别为与肝硬化相关的该59种mir中，是mir-7、-15b、-16、-22、-26a、-27b、-29、-92b、-101、-183、-191、-196a、-200a、-370、-378a及-936和let-7a、b、c、d、e、f、g，其中的19种在治疗后显示了更正的表达。表1.在患有对治疗响应的hbv肝硬化的患者中的小rna的差异表达（图1a示出了值，数值是与健康对照个体相比在表达上的倍数变化）肝硬化治疗“正常化”hsa-mir-582-3p4620-2.5xhsa-mir-22-3p1571-1.5xhsa-let-7a-5p1501-3.7xhsa-mir-889-3p1009-1.8xhsa-mir-3200-3p3582.8xhsa-mir-642b-3p2414.6xhsa-let-7c-5p2384.9xhsa-let-7f-5p188-1.5xhsa-mir-148a-3p153-1.5xhsa-mir-16-5p1414.6xhsa-let-7g-5p117-1.5xhsa-mir-26a-5p1143.6xhsa-mir-122-5p1117.6xhsa-mir-195-5p104-1.5xhsa-mir-29c-3p102-1.5xhsa-mir-139-5p67-1.5xhsa-mir-509-5p62.115.6xhsa-mir-27b-3p59.27.3xhsa-mir-194-5p56.3-1.5xhsa-let-7b-5p51.32.3xhsa-mir-191-3p49.6-1.8xhsa-mir-183-3p47.825.5hsa-mir-378a-3p45.61.7xhsa-mir-92b-3p43.329.2hsa-mir-393941.1-2.5xhsa-mir-432641.17.5hsa-mir-2114-3p36.11.8xhsa-mir-188-3p34.1-1.5xhsa-mir-200a-5p31.18.8hsa-mir-106b-3p29.12.4xhsa-mir-942-5p28.91.7xhsa-mir-186-3p28.26.4hsa-mir-63226.73.8xhsa-let-7d-5p26.6-13.3hsa-mir-429425.56.2hsa-mir-370-3p25.31.8xhsa-mir-101-3p24.58.9hsa-mir-56623.91.2xhsa-mir-15b-5p23.8-1.5xhsa-let-7e-5p20.9-8.3hsa-mir-548d-3p20.2-1.5xhsa-mir-147a20.1-1.5xhsa-mir-7-1-3p-14.8-6.2xhsa-mir-936-15.9-4.4xhsa-mir-551b-5p-17.3-4.0xhsa-mir-3679-5p-18.7-12.7xhsa-mir-616-3p-20.0-13.7xhsa-mir-3916-21.2-25.9hsa-mir-668-3p-22.1-9.6xhsa-mir-3655-26.0-31.7hsa-mir-7-2-3p-27.8-4.5xhsa-mir-196a-3p-28.0-21.5xhsa-mir-3147-32.3-31.2hsa-mir-548b-5p-32.79.8xhsa-mir-3161-34.9-83.8hsa-mir-34b-3p-36.7-10.4xhsa-mir-892a-37.2-6.1xhsa-mir-500a-5p-43.9-10.6xhsa-mir-2276-3p-45.5-108.9在第二次分析中，在用恩替卡韦（口服0.5mg/天）治疗6个月之后，基于他们已知的纤维化消退的缺失，选择了12名患有代偿性肝硬化的hbv患者，并且如上所述地执行了相同的分析。如图1b中所示，这些患者展现了改变（相对于对照+/-15倍）的mir的不同的集，其界定出在一群非响应性的患者中的肝硬化。这些是整体上不同于在图1a中所示的。在抗病毒治疗后，59种这些mir中的32种是更加正常化的，但是因为这些患者的肝硬化对于治疗是不响应的，这32种mir不是纤维化的标记物。在另一方面，25种mir在治疗后持续在相同或加大的水平，因此是纤维化的持续化相关联的并且是其标记物。表2.患有对治疗不响应的hbv肝硬化的患者中的小rna的差异表达（图1b中示出了值，数值是与健康对照个体相比在表达上的倍数变化）肝硬化治疗“持续化”hsa-mir-409-5p466628699-2.4hsa-mir-497-5p164955644-5.7hsa-mir-302b-5p5470109-2.1hsa-mir-376a-5p1972186-2.1hsa-mir-340-3p193762-2.1hsa-mir-57381446.3xhsa-mir-340-5p1185.9hsa-mir-505-3p78.830.7hsa-mir-296-5p32.06.9hsa-mir-548o-5p28.68.7hsa-mir-103b27.99.9hsa-mir-758-3p24.72.5hsa-mir-512-3p21.514.9xhsa-mir-20a-5p20.712.8xhsa-mir-585-3p-12.2-1.2hsa-mir-125b-2-3p-18.1-4.2hsa-mir-200b-3p-20.2-16.2xhsa-mir-20b-5p-20.7-22.2xhsa-mir-920-21.8-2.2hsa-mir-2115-3p-22.4-17.9xhsa-mir-466-22.5-18.0xhsa-mir-3137-22.6-18.1xhsa-mir-3153-22.6-9.1hsa-mir-3692-3p-22.7-3.9hsa-mir-510-5p-23.9-15.6xhsa-mir-100-5p-24.1-1.1hsa-mir-4267-24.1-13.5xhsa-mir-1299-24.5-3.9hsa-mir-320d-25.1-8.3hsa-mir-3678-5p-25.3-3.2hsa-mir-515-3p-25.6-27.4xhsa-mir-24-2-5p-26.2-17.1xhsa-mir-3117-3p-26.2-16.2xhsa-mir-193b-5p-27.0-1.4hsa-mir-3622a-5p-27.1-6.6hsa-mir-493-3p-27.3-1.6hsa-mir-668-3p-27.5-76.5xhsa-mir-1303-28.0-3.2hsa-mir-675-5p-28.6-6.2hsa-mir-132-3p-28.8-30.8xhsa-let-7e-5p-28.8-30.8xhsa-mir-4290-28.8-2.5hsa-mir-3074-3p-28.9-34.4xhsa-mir-639-30.2-8.1hsa-mir-4260-30.9-468xhsa-mir-3622b-3p-32.4-3.1hsa-mir-4288-32.5-26.1xhsa-mir-936-33.5-21.9xhsa-mir-3147-33.5-8.3hsa-mir-4254-33.9-27.2xhsa-mir-148b-3p-34.0-36.4xhsa-mir-378b-34.0-61.7xhsa-mir-3138-34.7-4.5hsa-mir-4325-34.9-6.7hsa-mir-2909-35.6-28.6xhsa-mir-600-36.84.9hsa-mir-193a-5p-38.9-28.5xhsa-mir-3149-39.7-14.3hsa-mir-891a-5p-40.8-2.6因此，此数据揭露了下述内容：1.在图1a的左栏中所示的mir，其界定出肝硬化，并且是将对治疗响应的患者的特征（“正常化”）。2.在图1b的左栏中所示的mir的一部分或全部，其界定出肝硬化，并且是将不对疗法响应的患者的特征（“持续化”）。3.在图1a的右栏中的mir的一部分或全部，其是纤维化的逆转（“标准化”）的诊断特征。4.在图1b的右栏中的“持续化”mir的一部分或全部，其是在其中纤维化将不会在治疗后逆转（“持续化”）的患者的诊断特征。5.患者作为响应者或非响应者的分配，是通过如下方法进行的：确定它们的mir图谱的一部分或全部，是否与图1b的左栏相比，更类似于在图1a的左栏中示出的。应当理解的是，尽管已经结合上述实施方式描述了本发明，但是前文的描述和例子旨在进行说明而不限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面、优点和修饰对于本发明所述领域的技术人员是显而易见的。本文说明性地描述的本发明可以在缺乏在此没有具体公开的任意要素、限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应当被广义地理解并且没有限制。额外地，本文采用的术语和表达已经被用作描述的术语，而非限制的术语，并且并非是指这样的术语和表达方式的使用排除了所显示和描述的特征或其部分的任何等效物，但应当意识到，在本发明要求保护的范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解的是，尽管已经通过优选的实施方式和任选的特征具体地公开了本发明，但是本领域技术人员可想象到对所具体描述的发明做出修改、改进和变化，并且这样的修饰、改进和变化被认为是在本发明的范围内。本文所提供的材料、方法以及例子是优选的实施方式的代表，是示例性的，并且不是旨在限制本发明的范围。在本文已经宽泛地和概括性地描述了本发明。落入所公开的上位概念之内的较窄的种类和下位群体的每一个也构成本发明的一部分。这包括具有附带条件或否定限制的本发明的一般性描述，以从类属中移除任何主题内容，而不论被排除的内容是否在本文中被具体地描述。此外，在根据马库什组描述本发明公开的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还因此根据该马库什组的任何个体成员或成员的子群组来描述了本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献其全文都明确地通过引用方式并入本文，其程度如同每个都通过引用方式分别并入本文。如有冲突，以本说明书（包括定义）为准。当前第1页12