用于二羧酸生产的宿主细胞的制作方法

本发明涉及能够生产二羧酸的宿主细胞。本发明还涉及用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法以及使用本发明的宿主细胞生产二羧酸的方法。本发明还涉及宿主细胞基因组中的修饰用于增加宿主细胞中二羧酸产生的用途。
背景技术：
：4-碳二羧酸苹果酸、延胡索酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转变为1,4-丁二醇(bdo)、四氢呋喃和γ-丁内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和bdo制造的聚酯聚合物。用于工业用途的琥珀酸主要是通过马来酸或马来酸酐的催化氢化由丁烷通过石油化学生产的。这些方法被认为是对环境有害且昂贵的。琥珀酸的发酵生产被视为生产琥珀酸的一种吸引人的替代方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。已经对(重组)酵母中c4-二羧酸的发酵生产进行了若干研究。例如，ep2495304公开了适合琥珀酸生产的重组酵母，其中编码丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和琥珀酸转运体的基因被遗传修饰。尽管在宿主细胞(例如酵母)中发酵生产二羧酸已经取得了改进，但仍需要进一步改进的用于发酵生产二羧酸的宿主细胞。发明概述本发明基于以下发现：编码直接或间接导致一种或多种辅因子(例如nadh)的氧化的酶的一种或多种基因的缺失能够增加宿主细胞(该细胞能够生产二羧酸)中的二羧酸生产，例如琥珀酸生产。因此，本发明涉及一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。本发明还涉及：-用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法，所述方法包括：-提供能够生产二羧酸的宿主细胞；和-在所述宿主细胞的基因组中进行修饰以导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，从而改善宿主细胞中的二羧酸产生；-生产二羧酸的方法，所述方法包括：在合适的发酵培养基中发酵本发明的宿主细胞，和生产所述二羧酸；以及-宿主细胞基因组中的修饰的用途，所述用途导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，从而增加宿主细胞中的二羧酸产生。附图简介图1示出了psuc223的质粒图谱。图2示出了用frd1表达盒置换pdc6的原理示意图。图3示出了psuc228的质粒图谱。图4示出了gut2缺失的原理示意图。图5示出了psuc227的质粒图谱。图6示出了psuc225的质粒图谱。图7示出了nde1缺失的原理示意图。图8示出了nde2缺失的原理示意图。图9示出了gpd1缺失的原理示意图。图10示出了gpd2缺失的原理示意图。序列表说明seqidno：1示出了escherichiacoli延胡索酸酶fumb的氨基酸序列。seqidno：2示出了质粒psuc223的完整核酸序列。seqidno：3示出了缺少前19个氨基酸的frd1(由yel047c编码)的氨基酸序列。seqidno：4示出了合成的tdh3p-frd1-tdh3t基因的核酸序列。seqidno：5示出了引物1(具有pdc65'悬突(overhang)的tdh3pfw)的核酸序列。seqidno：6示出了引物2(具有与psuc228cre-1的悬突的tdh3trev)的核酸序列。seqidno：7示出了引物3(具有悬突tdh3t的psuc228cre-1fw)的核酸序列。seqidno：8示出了引物4(dbc-03373，psuc228cre-1rev)的核酸序列。seqidno：9示出了质粒psuc228的完整核酸序列。seqidno：10示出了引物5(dbc-03374，psuc225cre-2fw)的核酸序列。seqidno：11示出了引物6(具有pdc63'悬突的psuc225cre-2rev)的核酸序列。seqidno：12示出了缺少3个氨基酸的c末端靶向信号的糖酵解酶体(glycosomal)trypanosomabrucei延胡索酸还原酶(frdg)的氨基酸序列。seqidno：13示出了缺少前23个n-末端氨基酸的rhizopusoryzae延胡索酸酶的氨基酸序列。seqidno：14示出了在第120-122位具有egy到daf修饰的actinobacillussuccinogenes磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列。seqidno：15示出了缺少c-末端过氧化物酶体靶向序列(氨基酸skl)的saccharomycescerevisiae过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(mdh3)的氨基酸序列。seqidno：16示出了saccharomycescerevisiae丙酮酸羧化酶的氨基酸序列。seqidno：17示出了kluyveromyceslactis异柠檬酸裂合酶的氨基酸序列。seqidno：18示出了缺少3c-末端过氧化物酶体靶向序列的saccharomycescerevisiae过氧化物酶体苹果酸合酶(mls1)的氨基酸序列。seqidno：19示出了来自aspergillusniger的二羧酸转运体的氨基酸序列。seqidno：20示出了引物7(fw，在gut2上游)的核酸序列。seqidno：21示出了引物8(rev，gut250bplox66上游)的核酸序列。seqidno：22示出了引物9(cre_1rev)的核酸序列。seqidno：23示出了引物10(cre_2fw)的核酸序列。seqidno：24示出了引物11(fwgut2-ko-cre_1)的核酸序列。seqidno：25示出了引物12(revgut2-ko-cre_2)的核酸序列。seqidno：26示出了引物13(fw，gut250bplox71下游)的核酸序列。seqidno：27示出了引物14(rev，在gut2下游)的核酸序列。seqidno：28示出了引物15(fw，在nde2上游)的核酸序列。seqidno：29列出引物16(rev，nde250bplox66上游)的核酸序列。seqidno：30示出了引物17(fw，nde250bplox71下游)的核酸序列。seqidno：31示出了引物18(rev，在nde2下游)的核酸序列。seqidno：32示出了引物19(fwnde2-ko-cre_1)的核酸序列。seqidno：33示出了引物20(revnde2-ko-cre_2)的核酸序列。seqidno：34示出了引物21(fw，在nde1上游)的核酸序列。seqidno：35示出了引物22(rev，nde150bplox66上游)的核酸序列。seqidno：36示出了引物23(fw，nde150bplox71下游)的核酸序列。seqidno：37示出了引物24(rev，在nde1下游)的核酸序列。seqidno：38示出了引物25(fwnde1-ko-cre_1)的核酸序列。seqidno：39示出了引物26(revnde1-ko-cre_2)的核酸序列。seqidno：40示出了saccharomycescerevisiaende1的氨基酸序列。seqidno：41示出了saccharomycescerevisiaende2的氨基酸序列。seqidno：42示出了saccharomycescerevisiaegut2的氨基酸序列。seqidno：43示出了psuc227的核酸序列。seqidno：44示出了psuc225的核酸序列。seqidno：45示出了引物27(fw，在gpd1上游)的核酸序列。seqidno：46示出了引物28(rev，在gpd1上游)的核酸序列。seqidno：47示出了引物29(fwgpd1-ko-cre_1)的核酸序列。seqidno：48示出了引物30(revgpd1-ko-cre_2)的核酸序列。seqidno：49示出了引物31(fw，在gpd1下游)的核酸序列。seqidno：50示出了引物32(rev，在gpd1下游)的核酸序列。seqidno：51示出了引物33(fw，在gpd2上游)的核酸序列。seqidno：52示出了引物34(rev，在gpd2上游)的核酸序列。seqidno：53示出了引物35(fwgpd2-ko-cre_1)的核酸序列。seqidno：54示出了引物36(revgpdkocre-2)的核酸序列。seqidno：55示出了引物37(fw，在gpd2下游)的核酸序列。seqidno：56示出了引物38(rev，在gpd2下游)的核酸序列。seqidno：57示出了saccharomycescerevisiaegpd1(甘油3-磷酸脱氢酶1)的氨基酸序列。seqidno：58示出了saccharomycescerevisiaegpd2(甘油3-磷酸脱氢酶2)的氨基酸序列。seqidno：59示出了saccharomycescerevisiaeadh1(醇脱氢酶1)的氨基酸序列。seqidno：60示出了saccharomycescerevisiaeadh2(醇脱氢酶2)的氨基酸序列。seqidno：61示出了saccharomycescerevisiaeadh3(醇脱氢酶3)的氨基酸序列。seqidno：62示出了saccharomycescerevisiaeadh4(醇脱氢酶4)的氨基酸序列。seqidno：63示出了saccharomycescerevisiaeadh5(醇脱氢酶5)的氨基酸序列。seqidno：64示出了saccharomycescerevisiaeadh6(醇脱氢酶6)的氨基酸序列。seqidno：65示出了saccharomycescerevisiaeald2(醛脱氢酶2)的氨基酸序列。seqidno：66示出了saccharomycescerevisiaeald3(醛脱氢酶3)的氨基酸序列。seqidno：67示出了saccharomycescerevisiaeald4(醛脱氢酶4)的氨基酸序列。seqidno：68示出了saccharomycescerevisiaeald5(醛脱氢酶5)的氨基酸序列。seqidno：69示出了saccharomycescerevisiaeald6(醛脱氢酶6)的氨基酸序列。seqidno：70示出了arabidopsisthaliana延胡索酸酶的氨基酸序列。发明详述在本说明书和所附的权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“具有”及其变形应被理解为“包含在内”。也就是说，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是：可以包括其它没有明确列举的要素或整体。本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)对象。例如，“要素”可意味着一个/种要素或多于一个/种要素。本发明基于以下发现：编码直接或间接参与一种或多种辅因子(例如nadh)的氧化的酶的一种或多种基因的缺失能够增加宿主细胞(该细胞能够生产二羧酸)中的二羧酸生产，例如琥珀酸生产。因此，本发明提供一种宿主细胞，其能够生产二羧酸并且在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。本文提及的催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷被定义为这样的表型特征，其中当在基本相同的条件下分析时，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比，本发明的宿主细胞由于基因组中的修饰而在所述酶促步骤中生成更少的部分或完全氧化状态的辅因子。也就是说，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞中催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷导致所述步骤中部分或完全还原形式的辅因子的氧化减少。因此，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞(当在基本相同的条件下分析时)相比，在本发明的宿主细胞中，一种或多种处于更还原状态(部分或完全还原)的辅因子的可得性(availability)提高。本发明的宿主细胞中催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷通常是基因组中的修饰的结果，其中当在基本相同的条件下分析时，与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比，本发明的宿主细胞：a)产生更少多肽，和/或b)由编码多肽的基因转录的mrna的表达水平降低，和/或c)产生具有降低的蛋白活性或降低的蛋白比活性的多肽，和/或d)产生更少由多肽产生的产物，以及这些可能性中的一种或多种的组合。所述多肽可以是直接或间接导致一种或多种辅因子的氧化的多肽。在该语境中，基因就此被定义为包含开放阅读框(orf)和其转录控制元件(启动子和终止子)的多核苷酸，所述orf是基因上的将被转录并且翻译成蛋白序列的区域。因此，酶促步骤的缺陷可以如下测量：通过确定如果与其基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，由上文所限定的本发明宿主细胞产生的直接或间接导致一种或多种辅因子的氧化的多肽的量和/或(比)活性，和/或由编码多肽的基因转录的mrna的量，和/或上文所限定的本发明宿主细胞中的多肽产生的产物的量，和/或通过基因或基因组测序。可使用对技术人员而言可得到的任何检验，例如转录谱、northern印迹法、rt-pcr、q-pcr、蛋白质组和western印迹法来测量多肽的产生缺陷。宿主细胞的基因组修饰在本文中被定义为导致细胞基因组中的多核苷酸序列改变的任何事件。修饰被理解为一种/个或多种/个修饰。可通过经典的菌株改进，随机诱变随后选择来引入修饰。可通过引入(插入)、替换或去除(缺失)核苷酸序列中的一个或多个核苷酸来完成修饰。该修饰可例如在编码序列或对多核苷酸的转录或翻译而言必需的调节元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以导致引入终止密码子、去除起始密码子或使编码序列的开放阅读框改变或移码。编码序列或其调节元件的修饰可根据本领域中已知的方法通过定点或随机诱变、dna改组方法、dna再组装方法、基因合成(参见例如young和dong,(2004),nucleicacidsresearch32,(7)electronicaccesshttp://nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59或者gupta等人(1968),proc.natl.acad.sciusa,60:1338-1344；scarpulla等人(1982),anal.biochem.121:356-365；stemmer等人(1995),gene164:49-53)或pcr产生的诱变完成。随机诱变程序的例子是本领域中熟知的，例如化学(例如ntg)诱变或物理(例如uv)诱变。定向诱变程序的例子是quickchangetm定点诱变试剂盒(stratagenecloningsystems,lajolla,ca)、‘thealteredii体外诱变系统’(promegacorporation)或在gene(1989)77(1):51-9(hosn,hunthd,hortonrm,pullenjk,peaselr“site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction”)中描述的使用pcr或如在molecularbiology:currentinnovationsandfuturetrends.(a.m.griffin和h.g.griffin.编，isbn1-898486-01-8；1995horizonscientificpress,pobox1,wymondham,norfolk,英国)中描述的使用pcr通过重叠延伸来进行。可通过将经修饰宿主细胞的dna序列与亲本宿主细胞的序列进行比较来确定基因组中的修饰。可使用对本领域技术人员而言已知的标准方法，例如使用sanger测序技术和/或下一代测序技术比如在elainer.mardis(2008),next-generationdnasequencingmethods,annualreviewofgenomicsandhumangenetics,9:387-402.(doi:10.1146/annurev.genom.9.081307.164359)中综述的illuminaga2,roche454等等，进行dna测序和基因组测序。一些优选的修饰方法基于基因置换、基因缺失或基因破坏技术。例如，在多核苷酸、核酸构建体或表达盒置换的情况下，可在将被置换的靶基因座处引入适当的dna序列。所述适当的dna序列优选地存在于克隆载体上。优选的整合型克隆载体包含下述dna片段，所述dna片段与将被置换的基因座侧翼的多核苷酸同源和/或与所述多核苷酸具有同源性，以用于将克隆载体的整合靶向该预定的基因座。为了促进靶向整合，优选地在转化细胞之前对克隆载体线性化。优选地，进行线性化以使得克隆载体的至少一端，但优选地任意一端的侧翼为与将被置换的dna序列(或侧翼序列)同源的序列。该方法被称为同源重组并且还可使用该技术以实现(部分)基因缺失或基因破坏。例如，对于基因破坏，可通过缺陷型多核苷酸置换对应于内源多核苷酸的多核苷酸，所述缺陷型多核苷酸是不能产生(完全功能性的)蛋白的多核苷酸。通过同源重组，缺陷型多核苷酸置换内源多核苷酸。可期望的是，缺陷型多核苷酸还编码标记，所述标记可用于选择其中核酸序列已被修饰的转化体。或者，可使用与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列通过已建立的反义技术来进行修饰，其中所述宿主细胞产生更少的本文所述多肽中的一种或所述宿主细胞在本文所述多肽中的一种的产生方面缺陷。更特别地，可通过引入与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列(其可在细胞中转录，并且能与细胞中产生的mrna杂交)来降低或消除本发明宿主细胞的多核苷酸的表达。在允许互补反义核苷酸序列与mrna杂交的条件下，翻译的蛋白的量因此减少或消除。表达反义rna的例子展示于appl.environ.microbiol.(2000年)2月；66(2):775-82(characterizationofafoldase,proteindisulfideisomerasea,intheproteinsecretorypathwayofaspergillusniger.ngiamc,jeenesdj,puntpj,vandenhondelca,archerdb)或者(zrennerr,willmitzerl,sonnewaldu.analysisoftheexpressionofpotatouridinediphosphate-glucosepyrophosphorylaseanditsinhibitionbyantisenserna.planta.(1993)；190(2):247-52)中。此外，可通过rna干扰(rnai)技术(femsmicrob.lett.237(2004):317-324)来获得多核苷酸的修饰、下调或失活。在该方法中，核苷酸序列(其表达待被影响)的相同的正义和反义部分被克隆为处于前后位置，中间是核苷酸间隔，并且插入到表达载体中。此种分子转录后，小核苷酸片段的形成将导致待被影响的mrna的靶向降解。对特定mrna的去除可进行至不同的程度。w02008/053019、w02005/05672a1、w02005/026356a1、oliveira等人,“efficientcloningsystemforconstructionofgenesilencingvectorsinaspergillusniger”(2008)appl.microbiol.andbiotechnol.80(5):917-924和/或barnes等人,“sirnaasamoleculartoolforuseinaspergillusniger”(2008)biotechnologyletters30(5):885-890中描述的rna干扰技术可用于对多核苷酸的下调、修饰或失活。在本文中，辅因子通常是指蛋白质(例如酶)的生物活性所需的非蛋白质化合物。也就是说，辅因子可以被认为是辅助生物化学转化的“助手分子”。在本发明的上下文中，术语“辅因子”和“辅酶”在本文中具有相同的含义并可互换使用。通常，本发明宿主细胞基因组中的修饰会导致有机辅因子氧化的缺陷。这种辅因子通常是小的有机分子(通常分子量小于1000da)，其可以松散地或紧密地结合到酶上并可以直接参与反应。在一些酶中，辅因子可以紧密地结合；而在其他酶中，辅因子松散地结合。在本发明的宿主细胞中，基因组中的修饰通常导致部分或完全还原形式的辅因子的氧化缺陷。在本发明中，辅因子可以是nadh、nadph或fadh2。本发明中宿主细胞基因组中的修饰可以直接或间接导致辅因子氧化缺陷。在本发明的宿主细胞中，基因组中的修饰通常导致胞质溶胶中催化辅因子氧化的至少一个酶促步骤的缺陷。在本发明的宿主细胞中，宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部nadh脱氢酶；或-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶；或-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶；或-至少一种醇脱氢酶；或-至少一种醛脱氢酶；或它们的组合。在本发明的宿主细胞中，线粒体外部nadh脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40或seqidno：41所示序列或包含与seqidno：40或seqidno：41具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。在本发明的宿主细胞中，线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：42所示序列或包含与seqidno：42具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。在本发明的宿主细胞中，胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：57或seqidno：58所示序列或包含与seqidno：57或seqidno：58具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。在本发明的宿主细胞中，醇脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63或seqidno：64所示序列或包含与seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63或seqidno：64具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。在本发明的宿主细胞中，醛脱氢酶具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68或seqidno：69所示序列或包含与seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68或seqidno：69具有至少35％同一性、更优选至少40％同一性、更优选至少45％同一性、更优选至少50％同一性、甚至更优选至少55％同一性、甚至更优选至少60％同一性、甚至更优选至少65％同一性、甚至更优选至少70％同一性、甚至更优选至少75％同一性、甚至更优选至少80％同一性、甚至更优选至少85％同一性、甚至更优选至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性的序列。在一种实施方式中，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部nadh脱氢酶。特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40或seqidno：41所示序列或包含与seqidno：40或seqidno：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40所示序列或包含与seqidno：40具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：41所示序列或包含与seqidno：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。在另一种实施方式中，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部nadh脱氢酶；和-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶。特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40或seqidno：41所示序列或包含与seqidno：40或seqidno：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：42所示序列或包含与seqidno：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40所示序列或包含与seqidno：40具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：41所示序列或包含与seqidno：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：42所示序列或包含与seqidno：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少70％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少70％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少70％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少80％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少80％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少80％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少90％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少90％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少90％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少95％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少95％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少95％同一性的序列。最特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40所示序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：41所示序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：42所示序列。在另一种实施方式中，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部nadh脱氢酶；和-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶；和-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶。特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40或seqidno：41所示序列或包含与seqidno：40或seqidno：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-至少一种线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：42所示序列或包含与seqidno：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：57或seqidno：58所示序列或包含与seqidno：57或seqidno：58具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40所示序列或包含与seqidno：40具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：41所示序列或包含与seqidno：41具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：42所示序列或包含与seqidno：42具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：57所示序列或包含与seqidno：57具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：58所示序列或包含与seqidno：58具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少70％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少70％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少70％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少70％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少70％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少80％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少80％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少80％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少80％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少80％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少90％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少90％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少90％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少90％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少90％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：40具有至少95％同一性的序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：41具有至少95％同一性的序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：42具有至少95％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少95％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少95％同一性的序列。最特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：40所示序列；和-线粒体外部nadh脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：41所示序列；和-线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：42所示序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：57所示序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：58所示序列。在另一种实施方式中，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶。特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-至少一种胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：57或seqidno：58所示序列或包含与seqidno：57或seqidno：58具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：57所示序列或包含与seqidno：57具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：58所示序列或包含与seqidno：58具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少70％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少70％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少80％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少80％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少90％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少90％同一性的序列。甚至更特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：57具有至少95％同一性的序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与seqidno：58具有至少95％同一性的序列。最特别地，本发明的宿主细胞在其基因组中包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致以下酶的缺陷：-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：57所示序列；和-胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含seqidno：58所示序列。在另一种实施方式中，如上文所述的本发明的宿主细胞在其基因组中进一步包含至少一种遗传修饰，所述遗传修饰导致至少一种醇脱氢酶和/或至少一种醛脱氢酶的缺陷。醇脱氢酶和醛脱氢酶的优选实施方式如上所述。优选地，在本发明的宿主细胞中，本文确定的一种或多种多肽的产生缺陷是产生减少至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。优选地，在本发明的宿主细胞中，从编码本文确定的一种或多种多肽的一种或多种基因转录的mrna的表达水平缺陷是表达减少至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。优选地，在本发明的宿主细胞中，本文确定的一种或多种多肽的蛋白活性或蛋白比活性的缺陷是活性或比活性降低至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。优选地，在本发明的宿主细胞中，由一种或多种多肽产生的产物的缺陷是产生减少至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、特别地至少70％、更特别地至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％(当在基本相同的条件下分析时，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比)。本发明的宿主细胞能够生产二羧酸，例如苹果酸、延胡索酸和/或琥珀酸。术语“二羧酸”和“二羧酸盐/酯”(例如“琥珀酸”和“琥珀酸盐/酯”)在本文中具有相同的含义并可互换使用，前者是后者的氢化形式。如上文所述，本发明的宿主细胞是经遗传修饰的宿主细胞，其在基因组中包含至少一种遗传修饰(例如内源或同源核苷酸序列的缺失或破坏)，从而导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷。本发明的宿主细胞来源于或产生自“亲本宿主细胞”(其基因组未被根据本发明修饰)。亲本宿主细胞可以是野生型菌株或经遗传修饰的宿主细胞。例如，亲本宿主细胞可以是产生二羧酸的任何野生型菌株。或者，亲本宿主细胞可以是已经经历了用于二羧酸生产的重组核酸转化或经典诱变处理的任何感兴趣的野生型菌株。例如，亲本宿主细胞可含有编码参与二羧酸生产的多肽的同源或异源表达构建体。本领域技术人员会知道修饰细胞如微生物细胞的方法，使得其能够产生参与二羧酸生产的多肽。为此目的，重组基因技术的方法在本领域非常完善，并且描述于sambrook和russel(2001)"molecularcloning:alaboratorymanual(第三版),coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress或f.ausubel等人编.,"currentprotocolsinmolecularbiology",greenpublishingandwileyinterscience,newyork(1987)中。在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸(rna)聚合物，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸基本特性从而以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交的已知类似物(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或子序列(subsequence)。除非另有说明，该术语包括所示出的序列及其互补序列。在本文中使用时，“基因”可以指经分离的核酸分子。因此，在本申请的上下文中，术语“基因”不仅仅指天然存在的序列。在本文中使用时，术语“异源的”是指并非天然存在于宿主细胞中的核酸或氨基酸序列。换句话说，核酸或氨基酸序列与宿主细胞中天然发现的核酸或氨基酸序列不同。在本文中使用时，术语“内源的”或“同源的”是指宿主细胞中天然存在的核酸或氨基酸序列。合适的本发明宿主细胞可以是原核细胞。优选地，所述原核细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性微生物和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可以选自例如escherichia、anabaena、caulobactert、gluconobacter、rhodobacter、pseudomonas、paracoccus、bacillus、brevibacterium、corynebacterium、rhizobium(sinorhizobium)、flavobacterium、klebsiella、enterobacter、lactobacillus、lactococcus、methylobacterium、staphylococcus或actinomycetes例如streptomyces和actinoplanes种。优选地，细菌细胞选自bacillussubtilis、b.amyloliquefaciens、b.licheniformis、b.puntis、b.megaterium、b.halodurans、b.pumilus、gluconobacteroxydans、caulobactercrescentuscb15、methylobacteriumextorquens、rhodobactersphaeroides、pseudomonaszeaxanthinifaciens、pseudomonasputida、pseudomonasfluorescens、paracoccusdenitrificans、escherichiacoli、corynebacteriumglutamicum、staphylococcuscarnosus、streptomyceslividans、streptomycesclavuligerus、sinorhizobiummelioti和rhizobiumradiobacter。根据本发明的宿主细胞可以是真核宿主细胞。优选地，所述真核宿主细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。更优选地，真核宿主细胞是真菌细胞。合适的真菌宿主细胞可以例如属于saccharomyces、schizosaccharomyces、aspergillus、penicillium、pichia、kluyveromyces、yarrowia、candida、hansenula、humicola、issatchenkia、kloeckera、schwanniomyces、torulaspora、trichosporon、brettanomyces、rhizopus、zygosaccharomyces、pachysolen或yamadazyma属。真菌细胞可以例如属于saccharomycescerevisiae、s.uvarum、s.bayanuss.pastorianus、s.carlsbergensis、aspergillusniger、penicilliumchrysogenum、pichiastipidis、p.pastoris、kluyveromycesmarxianus、k.lactis、k.thermotolerans、yarrowialipolytica、candidasonorensis、c.revkaufi、c.pulcherrima、c.tropicalis、c.utilis、c.kruisei、c.glabrata、hansenulapolymorpha、issatchenkiaorientalis、torulasporadelbrueckii、brettanomycesbruxellensis、rhizopusoryzae或zygosaccharomycesbailii种。在一种实施方式中，本发明的真菌宿主细胞是酵母，例如属于saccharomycessp.，例如saccharomycescerevisiae。具体酵母宿主细胞的实例包括c.sonorensis、k.marxianus、k.thermotolerans、c.methanesorbosa、saccharomycesbulderi(s.bulderi)、i.orientalis、c.lambica、c.sorboxylosa、c.zemplinina、c.geochares、p.membranifaciens、z.kombuchaensis、c.sorbosivorans、c.vanderwaltii、c.sorbophila、z.bisporus、z.lentus、saccharomycesbayanus(s.bayanus)、d.castellii、c、boidinii、c.etchellsii、k.lactis、p.jadinii、p.anomala、saccharomycescerevisiae(s.cerevisiae)、pichiagaleiformis、pichiasp.yb-4149(nrrl命名)、candidaethanolica、p.deserticola、p.membranifaciens、p.fermentans和saccharomycopsiscrataegensis(s.crataegensis)。k.marxianus和c.sonorensis的合适菌株包括wo00/71738al、wo02/42471a2、wo03/049525a2、wo03/102152a2和wo03/102201a2中描述的那些。i.orientalis的合适菌株是atcc菌株32196和atcc菌株pta-6648。在本发明中，宿主细胞可以是克拉布特里(crabtree)阴性的野生型菌株。克拉布特里效应被定义为：当以高比生长速率(长期效应)或在存在高浓度葡萄糖的情况下(短期效应)培养时，由于微生物氧消耗的抑制在有氧条件下发生的发酵性代谢。克拉布特里阴性表型不展示出这种效应，因此即使在存在高浓度葡萄糖的情况下或在高生长速率下也能够消耗氧。真核细胞可以是丝状真菌宿主细胞。丝状真菌包括真菌(eumycota)和卵菌(oomycota)亚门的所有丝状形式(如hawksworth等人在ainsworthandbisby'sdictionaryofthefungi,第8版,1995,cabinternational,universitypress,cambridge,uk中定义)。丝状真菌的特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行且碳分解代谢专性好氧。丝状真菌菌株包括但不限于acremonium、aspergillus、agaricus、aureobasidium、cryptococcus、corynascus、chrysosporium、filibasidium、fusarium、humicola、magnaporthe、monascus、mucor、myceliophthora、mortierella、neocallimastix、neurospora、paecilomyces、penicillium、piromyces、phanerochaetepodospora、pycnoporus、rhizopus、schizophyllum、sordaria、talaromyces、rasamsonia、thermoascus、thielavia、tolypocladium、trametes和trichoderma的菌株。可作为宿主细胞的优选丝状真菌菌株属于aspergillusniger、aspergillusoryzae、aspergillusfumigatus、penicilliumchrysogenum、penicilliumcitrinum、acremoniumchrysogenum、trichodermareesei、rasamsoniaemersonii(以前被称为talaromycesemersonii)、aspergillussojae、chrysosporiumlucknowense、myceliophtorathermophyla种。用于比较经转化细胞和未转化细胞的发酵特征的参照宿主细胞包括例如aspergillusnigercbs120.49、cbs513.88、aspergillusoryzaeatcc16868、atcc20423、ifo4177、atcc1011、atcc9576、atcc14488-14491、atcc11601、atcc12892、aspergillusfumigatusaf293(cbs101355)、p.chrysogenumcbs455.95、penicilliumcitrinumatcc38065、penicilliumchrysogenump2、thielaviaterrestrisnrrl8126、talaromycesemersoniicbs124.902、rasamsoniaemersoniicbs393.64、acremoniumchrysogenumatcc36225、atcc48272、trichodermareeseiatcc26921、atcc56765、atcc26921、aspergillussojaeatcc11906、chrysosporiumlucknowenseatcc44006以及所有这些菌株的衍生株。一种更优选的宿主细胞属于aspergillus属，更优选地，宿主细胞属于aspergillusniger种。当根据本发明的宿主细胞是aspergillusniger宿主细胞时，宿主细胞优选是cbs513.88、cbs124.903或其衍生株。在一种优选的实施方式中，根据本发明的宿主细胞是选自candida、hansenula、issatchenkia、kluyveromyces、pichia、saccharomyces、schizosaccharomyces或yarrowia菌株的酵母宿主细胞，或者选自属于acremonium、aspergillus、chrysosporium、myceliophthora、penicillium、talaromyces、rasamsonia、thielavia、fusarium或trichoderma种的丝状真菌细胞的丝状真菌宿主细胞。本发明的宿主细胞可以包含活性的还原性三羧酸(tca)通路。还原性tca通路是微生物可产生二羧酸的主要通路之一。近年来，在宿主细胞中引入还原性tca通路已被证明是(微生物)生产二羧酸例如琥珀酸的最佳经济选择。在一种实施方式中，对本发明的宿主细胞进行遗传修饰以包含还原性tca通路。也就是说，本发明的宿主细胞可以包含用于二羧酸生产的重组还原性tca通路。在另一种实施方式中，对本发明的宿主细胞进行遗传修饰以包含在胞质溶胶中有活性的还原性tca通路。也就是说，本发明的宿主细胞可以包含在胞质溶胶中有活性的重组还原性tca通路。在该语境中，术语“重组”是指tca通路是通过本领域已完善建立的重组基因技术产生的事实。参与所述还原性tca通路的酶可以是同源酶或异源酶。在一种优选的实施方式中，所述还原性tca通路包括磷酸烯醇式丙酮酸盐/酯或丙酮酸盐/酯朝向琥珀酸盐/酯的转变。因此，本发明的宿主细胞可以包含选自催化以下反应的酶的组的同源酶或异源酶：-丙酮酸盐/酯朝向草酰乙酸盐/酯和/或磷酸烯醇式丙酮酸盐/酯朝向草酰乙酸盐/酯；-草酰乙酸盐/酯朝向苹果酸盐/酯；-苹果酸盐/酯朝向延胡索酸盐/酯；和-延胡索酸盐/酯朝向琥珀酸盐/酯。本发明的宿主细胞可以进一步包含二羧酸转运体，所述二羧酸转运体将二羧酸(例如琥珀酸)从细胞内输出到细胞外环境。因此，本发明的宿主细胞可包含一个或多个拷贝的以下核酸，所述核酸编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和/或二羧酸转运体中的一种或多种。因此，本发明的宿主细胞可以过表达一个或多个拷贝的以下核酸，所述核酸编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和/或二羧酸转运体中的一种或多种。优选地，当一种或多种所述酶被过表达时，它们在胞质溶胶中有活性。优选地，本发明的宿主细胞是真菌宿主细胞，例如酵母宿主细胞。更优选地，本发明的真菌宿主细胞包含根据下文所述的优选实施方式的遗传修饰。本发明的真菌宿主细胞可包含丙酮酸羧化酶(pyc)的遗传修饰，丙酮酸羧化酶催化从丙酮酸盐/酯到草酰乙酸盐/酯的反应(ec6.4.1.1)。丙酮酸羧化酶例如可在基因表达后在胞质溶胶中有活性。例如，真菌宿主细胞过表达丙酮酸羧化酶，例如内源性或同源丙酮酸羧化酶被过表达。可以用与seqidno：16的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的丙酮酸羧化酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。优选地，本发明的真菌宿主细胞表达编码胞质溶胶中的磷酸烯醇式丙酮酸(pep)羧激酶的核苷酸序列。优选地，编码pep羧激酶的核苷酸序列被过表达。pep羧激酶(ec4.1.1.49)优选地是异源酶，优选地来自细菌，更优选地，具有pep羧激酶活性的酶来自escherichiacoli、mannheimiasp.、actinobacillussp.或anaerobiospirillumsp.，更优选地mannheimiasucciniciproducens。编码pep羧激酶的基因可被过表达，并且在真菌细胞的胞质溶胶中有活性。优选地，用与seqidno：14的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的pep羧激酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。优选地，本发明的真菌宿主细胞表达编码胞质溶胶中的磷酸烯醇式丙酮酸(pep)羧化酶的核苷酸序列。优选地，编码pep羧化酶的核苷酸序列被过表达。pep羧化酶(ec4.1.1.31)优选地是异源酶，优选地来自细菌。在一种实施方式中，用编码在基因表达之后在胞质溶胶中有活性的苹果酸脱氢酶(mdh)的基因进一步遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。胞质溶胶表达可以通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。苹果酸脱氢酶可被过表达。胞质溶胶mdh可以是催化从草酰乙酸盐/酯到苹果酸盐/酯的反应的任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶(ec1.1.1.37)，例如来自s.cerevisiae。优选地，mdh是s.cerevisiaemdh3，更优选具有c-末端skl缺失从而使得其在胞质溶胶中有活性的s.cerevisiaemdh3。优选地，本发明的真菌宿主细胞包含编码与seqidno:15的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的苹果酸脱氢酶的核苷酸序列。在另一种实施方式中，用编码催化从苹果酸到延胡索酸的反应的延胡索酸酶(ec4.2.1.2)的基因进一步遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。编码延胡索酸酶的基因可来自于任何合适的来源，优选地来自微生物来源，例如酵母(例如saccharomyces)或丝状真菌(例如rhizopusoryzae)或细菌(例如escherichiacoli)。本发明的真菌宿主细胞可过表达编码延胡索酸酶的核苷酸序列。在核苷酸序列表达后，延胡索酸酶可在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。已发现：延胡索酸酶的胞质溶胶活性导致真菌细胞对二羧酸的高生产力。优选地，本发明的真菌宿主细胞过表达编码与seqidno：1、seqidno：13或seqidno：70的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的延胡索酸酶的核苷酸序列。在另一种实施方式中，用编码催化从延胡索酸盐/酯到琥珀酸盐/酯的反应的nad(h)依赖型延胡索酸还原酶(ec1.3.1.6)的任何合适的同源或异源基因遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。nadh依赖型延胡索酸还原酶可以是异源酶，其可来自任何合适的来源，例如细菌、真菌、原生动物或植物。本公开的真菌细胞包含异源nad(h)依赖型延胡索酸还原酶，优选地来自trypanosomasp，例如trypanosomabrucei。在一种实施方式中，nad(h)依赖型延胡索酸还原酶被表达并在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。真菌细胞可过表达编码nad(h)依赖型延胡索酸还原酶的基因。优选地，用与seqidno:12的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的nad(h)依赖型延胡索酸还原酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。在另一种实施方式中，用wo2015/086839中所公开的具有延胡索酸还原酶活性的变体多肽遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。在另一种实施方式中，本发明的真菌宿主细胞表达编码二羧酸转运蛋白的核苷酸序列。优选地，二羧酸转运蛋白被过表达。二羧酸转运蛋白可以是任何合适的同源或异源蛋白。优选地，二羧酸转运蛋白是异源蛋白。二羧酸转运蛋白可以来自任何合适的生物体，优选来自酵母或真菌，例如schizosaccharomycespombe或aspergillusniger。优选地，二羧酸转运蛋白是这样的二羧酸转运蛋白/苹果酸转运蛋白，例如来自aspergillusniger，其与seqidno:19的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。本发明的真菌宿主细胞可以进一步包含编码异柠檬酸裂合酶(ec4.1.3.1)的基因的遗传修饰，所述异柠檬酸裂合酶可以是任何合适的同源或异源酶。异柠檬酸裂合酶可例如获自kluyveromyceslactis或escherichiacoli。用与seqidno：17的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的异柠檬酸裂合酶遗传修饰根据本发明的真菌宿主细胞。本发明的真菌宿主细胞可以进一步包含苹果酸合酶(ec2.3.3.9)的遗传修饰。苹果酸合酶可被过表达和/或在胞质溶胶中有活性，例如通过缺失过氧化物酶体靶向信号来实现。如果苹果酸合酶是s.cerevisiae苹果酸合酶，例如通过缺失skl羧基端序列来改变天然苹果酸合酶。用与seqidno：18的核酸序列所编码的氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的苹果酸合酶遗传修饰本发明的真菌宿主细胞。在另一种实施方式中，本文所公开的本发明的真菌宿主细胞包含编码丙酮酸脱羧酶(ec4.1.1.1)的基因的破坏，所述丙酮酸脱羧酶催化从丙酮酸盐/酯到乙醛的反应。优选地，本发明的真菌宿主细胞可以过表达包含编码pep羧激酶、pep羧化酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶、延胡索酸还原酶和/或二羧酸转运体中的一种或多种的序列的同源或异源核苷酸序列。更优选地，当一种或多种所述酶被过表达时，它们在胞质溶胶中有活性。酶的优选实施方式如上文所述。优选地，本发明的真菌宿主细胞是酵母宿主细胞。酵母宿主细胞的优选实施方式如上文关于真菌宿主细胞所述。上述酶的胞质溶胶表达可通过缺失过氧化物酶体或线粒体靶向信号来实现。过氧化物酶体或线粒体靶向信号的存在可例如通过schlüter等人,nucleidacidresearch2007,35,d815-d822所公开的方法来确定。标准的遗传学技术例如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术是本领域已知的方法，例如sambrook和russel(2001)“molecularcloning:alaboratorymanual(第三版),coldspringharborlaboratory,coldspringharborlaboratorypress或f.ausubel等编，"currentprotocolsinmolecularbiology",greenpublishingandwileyinterscience,newyork(1987)中所述。转化(例如用于真菌宿主细胞的遗传修饰)的方法从例如ep-a-0635574、wo98/46772、wo99/60102和wo00/37671、wo90/14423、ep-a-0481008、ep-a-0635574和us6,265,186中已知。两个序列之间的序列比较和序列同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。本领域的技术人员将意识到以下事实：若干不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定两个序列之间的同一性(kruskal,j.b.(1983)anoverviewofsequencecomparison，d.sankoff和j.b.kruskal,(编),timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequencecomparison,第1-44页addisonwesley)。两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可使用用于比对两个序列的needleman和wunsch算法来确定(needleman,s.b.和wunsch,c.d.(1970)j.mol.biol.48,443-453)。氨基酸序列和核苷酸序列两者均可通过算法进行比对。needleman-wunsch算法已在计算机程序needle中实现。出于本发明的目的，使用了来自emboss包的needle程序(2.8.0版或更高版本，emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite(2000)rice,p.longden,i.和bleasby,a.trendsingenetics16,(6)第276—277页,http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列而言，eblosum62用于替换矩阵。对于核苷酸序列而言，使用ednafull。所使用的任选参数是空位开放罚分为10，以及空位延伸罚分为0.5。技术人员将理解的是，所有这些不同的参数将产生稍微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两个序列的总体同一性百分比没有显著改变。在通过如上所述的程序needle进行比对后，查询序列与本发明的序列之间的序列同一性的百分比计算如下：在两个序列中显示相同氨基酸或相同核苷酸的比对中的相应位置的数目除以在减去比对中的总空位数后比对的总长度。如本文定义的同一性可通过使用nobrief选项从needle获得，并且在程序的输出中标记为“最长同一性”。本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以进行针对公共数据库的搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。此类搜索可使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403—10的blastn和blastx程序(2.2.31版或更高版本)进行。blast核苷酸搜索可用blastn程序(得分＝100、字长＝11)来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可用blastx程序(得分＝50、字长＝3)来进行，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可利用如在altschul等人,(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402中描述的空位blast。当利用blast和空位blast程序时，可使用相应程序(例如blastx和blastn)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的国家生物技术信息中心的主页。本发明提供了用于改善宿主细胞中的二羧酸产生的方法，所述方法包括：-提供能够生产二羧酸的宿主细胞；和-在所述宿主细胞的基因组中进行修饰以导致一种或多种辅因子的氧化的缺陷，从而改善宿主细胞中的二羧酸产生。能够生产二羧酸的宿主细胞和导致一种或多种辅因子的氧化的缺陷的遗传修饰的优选实施方式如上文所述。本发明还提供了生产二羧酸的方法，所述方法包括：在适于生产二羧酸的条件下发酵如上文所述的本发明的宿主细胞，和任选地从发酵培养基中回收二羧酸。在所述方法中，在包含合适发酵培养基的容器中发酵本发明的宿主细胞。本文所使用的术语发酵指的是化合物的细胞(例如微生物)生产，在此处是由碳水化合物生产二羧酸。优选地，发酵产物是二羧酸，优选地苹果酸、延胡索酸和/或琥珀酸，优选地琥珀酸。分批发酵在本文中被定义为这样的发酵，其中所有营养物在发酵开始时加入。补料分批发酵是这样的分批发酵，其中营养物在发酵期间加入。分批和补料分批发酵中的产物可在合适的时机收获，例如在一种或更多种营养物耗尽时收获。连续发酵是这样的发酵，其中营养物被连续加入到发酵中且其中产物被连续地移出发酵。在一种实施方式中，在本发明的方法中发酵本发明的宿主细胞是在碳水化合物限制条件下进行的。当在本文中使用时，碳水化合物限制条件被定义为维持碳水化合物浓度低于10g/l，例如约5g/l。根据本发明的生产二羧酸的方法可以以任何合适的体积和规模进行，优选地以工业规模进行。工业规模在本文中被定义为至少10升或100升，优选地至少1m3，优选地至少10m3或100m3，优选地至少1000m3，通常低于10,000m3的体积。在本发明的方法中发酵本发明的宿主细胞可在任何合适的发酵培养基中进行，所述发酵培养基包含合适的氮源、碳水化合物和本发明所述方法中生长和二羧酸生产所需的其它营养物。根据本发明的发酵方法中合适的碳水化合物可以是葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖或麦芽糖。在一种实施方式中，所述发酵方法在co2分压为5％-60％、优选地约50％下进行。在所述生产二羧酸的方法中，ph通常在二羧酸生产期间降低。优选地，在所述生产二羧酸的方法中，ph在1和5之间、优选地1.5和4.5之间、更优选地2和4之间的范围。在另一优选实施方式中，根据本发明的方法包括以下步骤：在碳水化合物的存在下在需氧条件下预培养本发明的宿主细胞。优选地，在预培养期间宿主细胞的发酵在4-6之间的ph下进行。优选地，预培养期间的碳水化合物是非抑制性碳水化合物、优选半乳糖。已发现在非抑制性碳水化合物上预培养宿主细胞是有利的，因为这防止了葡萄糖抑制的发生，而葡萄糖抑制可负面影响所产生生物质的量。此外，还发现：在需氧条件下预培养宿主细胞的步骤导致更高的生物质产率和更快的生长。优选地，所述预培养以分批模式进行。通常进行用于生产增加的生物质的增殖步骤，优选地在碳水化合物限制条件下进行。生产二羧酸的方法可在任何合适的温度下进行。合适的温度可例如在约10℃和约40℃之间，例如在约15℃和约30℃之间。在一种实施方式中，以至少部分本发明的宿主细胞被重复利用(即，再循环)的方式进行本发明的方法。宿主细胞可被再循环回原始容器或者再循环入第二容器。优选地，用维生素和/或微量元素补充引入再循环宿主细胞的培养基。在一种优选的实施方式中，发酵培养基包含1-150g/l、优选5-100g/l、更优选10-80g/l或15-60g/l的量的二羧酸例如琥珀酸。在任何情况下，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞通常能够在发酵培养基中积累更多二羧酸。与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞通常会展示出二羧酸(例如琥珀酸)的滴度增加至少1％、更优选至少2％、甚至更优选至少4％、特别地至少5％、更特别地至少6％、例如至少8％、例如至少10％。在该语境中，通过将产生的二羧酸的量除以培养上清液的总体积来计算二羧酸的滴度(二羧酸的g数/上清液的l数)。在进一步优选的实施方式中，与基因组未被根据本发明修饰的亲本宿主细胞相比(当在基本相同的条件下分析时)，本发明的宿主细胞通常会展示出二羧酸(例如琥珀酸)的发酵产率提高至少1％、更优选至少2％、甚至更优选至少4％、特别地至少5％、更特别地至少6％、例如至少8％、例如至少10％。在该语境中，通过将产生的二羧酸的量除以消耗的糖的总量(包括在生物质繁殖阶段期间)来计算二羧酸的发酵产率(二羧酸的g数/葡萄糖的g数)。生产二羧酸的方法可以进一步包括回收二羧酸。可通过本领域已知的任何合适方法来回收二羧酸，例如通过结晶、铵沉淀、离子交换技术、离心或过滤或这些方法的任意合适组合。在一种优选的实施方式中，回收二羧酸包括：使二羧酸结晶和形成二羧酸晶体。优选地，使二羧酸结晶包括除去部分发酵培养基，优选地通过蒸发，以获得浓缩的培养基。根据本发明，可以通过从ph为1-5且包含二羧酸的水性溶液结晶所述二羧酸(例如琥珀酸)来回收二羧酸(例如琥珀酸)，包括蒸发部分水性溶液以获得浓缩溶液，将浓缩的溶液的温度降低至5-35℃之间的值，其中二羧酸晶体形成。优选地，结晶包括：使浓缩的培养基的温度达到10-30℃，优选地15-25℃的温度。优选地，包含二羧酸的水性溶液的ph为1.5-4.5，优选地2-4。已发现，相较于在低于10度的低温下结晶的二羧酸(例如琥珀酸)的晶体，使二羧酸(例如琥珀酸)在较高温度(例如，10-30℃)下结晶产生杂质(例如，有机酸、蛋白质、颜色和/或气味)量更低的二羧酸(例如琥珀酸)的晶体。相较于在低于10℃或5℃的温度下进行的二羧酸结晶，在更高温度下结晶二羧酸(例如琥珀酸)的另一个优点是：冷却水性溶液需要更少量的能量，从而导致更加经济和可持续的方法。优选地，结晶二羧酸(例如琥珀酸)包括洗涤二羧酸晶体的步骤。可由ph为1-5的发酵培养基直接将二羧酸(例如琥珀酸)结晶至纯度为至少90重量/重量％，优选地至少95重量/重量％、96重量/重量％、97重量/重量％、或至少98重量/重量％、或99-100重量/重量％。在一种优选的实施方式中，生产二羧酸的方法还包括：在工业方法中使用二羧酸。优选地，在根据本发明的方法中制备的二羧酸(例如琥珀酸)被进一步转变为期望的产品。期望的产品可以是例如聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(pbs)，除冰剂(deicingagent)，食品添加剂，化妆品添加剂或表面活性剂。也就是说，本发明提供了生产产品(例如聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(pbs)，除冰剂，食品添加剂，化妆品添加剂或表面活性剂)的方法，所述方法包括：如本文所述生产二羧酸；以及在所述产品的生产中使用所述二羧酸。本发明还提供了宿主细胞基因组中的修饰的用途，所述用途导致至少一个催化辅因子氧化的酶促步骤的缺陷，从而增加宿主细胞中的二羧酸产生。遗传修饰和宿主细胞的优选实施方式如上文所述。本文中作为现有技术所给出的专利文件或其它材料的引用并不应被认为是承认所述文件或材料在任何一项权利要求的优先权日时是已知的或者其所包含的信息是公知常识的一部分。本文中陈述的每个引用的公开内容通过引用以整体并入本文中。通过以下实施例进一步阐释本发明：实施例通用的材料和方法dna程序除非另有说明，否则如别处(sambrook等人,1989,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)所述进行标准dna程序。使用校正酶phusion聚合酶(finnzymes)扩增dna。限制酶来自invitrogen或newenglandbiolabs。琥珀酸生产菌株的mtp发酵为了确定琥珀酸生产，使菌株一式三份地在湿度振荡器(infors)中的微量滴定板(mtp)中在30度、550rpm和80％湿度下生长3天。培养基基于verduyn培养基(verduync,postmae,schefferswa,vandijkenjp.yeast,1992jul；8(7):501-517)，但如下文所述对碳源和氮源进行更改。表1.mtp预培养基组成原材料浓度(g/l)半乳糖c6h12o6.h2o40.00尿素(nh2)2co2.30磷酸二氢钾kh2po43.00硫酸镁mgso4.7h2o0.50微量元素溶液a1.00维生素溶液b1.00a微量元素溶液b维生素溶液组分式浓度(g/kg)生物素(d-)c10h16n2o3s0.05cad(+)泛酸c18h32can2o101.00烟酸c6h5no21.00肌醇c6h12o625.00盐酸氯化硫胺c12h18cl2n4os.xh2o1.00盐酸吡哆醇c8h12clno31.00对氨基苯甲酸c7h7no20.20使用共80μl预培养物接种24孔板中含有1.5％半乳糖作为碳源的2.5ml培养基。使培养物在30℃、550rpm、80％湿度的湿度振荡器(infors)中生长72小时。生成生物质后，通过将细胞重悬于2.5ml含有葡萄糖作为碳源的矿质培养基中来开始生产实验。在30℃、550rpm、80％湿度的湿度振荡器(infors)中孵育主要培养物，并在培养48小时后取样。通过nmr的mtp样品的代谢物分析对于mtp样品的代谢物分析，将90μl发酵样品上清液与10μlnmr标准品(20g/l马来酸)和100μl10％d2o溶液混合。将样品冻干，随后溶在1mld2o中。使用不具有水抑制的脉冲程序(zg)，在300k的温度下，使用90度激发脉冲、2.0s的采集时间和40s的放松延迟，在配备有he冷却低温探头、以500mhz的质子频率运行的bestbrukeravanceiii光谱仪上记录1d1hnmr谱。扫描次数设置为8，不使用虚拟扫描。基于以下信号(δ相对于4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)计算琥珀酸浓度[以g/l计]：琥珀酸：2.67ppm处的琥珀酸信号(s，4h)；用于标准品的信号：约6.3ppm处的马来酸峰(s，2h)。实施例1：构建酵母菌株suc-947如wo2013/004670中所述构建saccharomycescerevisiae菌株suc-632。使用菌株suc-632作为构建菌株suc-947的起点。菌株suc-708是通过经典菌株改良获得的菌株suc-632的突变株。如下所述将e.coli的延胡索酸酶基因(fumb)转化到菌株suc-708中。seqidno：1描述了来自escherichiacoli的延胡索酸酶(fumb)蛋白序列(e.c.4.2.1.2，uniprot检索号为p14407)。如专利申请wo2008/000632中所公开，针对在s.cerevisiae中表达对基因序列进行密码子对优化。终止密码子taa被修饰为taag。fum_01基因的表达由tdh1启动子(紧接在tdh1基因的起始密码子之前的600bp)和tdh1终止子(紧接在tdh1基因的终止密码子之后的300bp)控制。控制fum_01表达的tdh1启动子和tdh1终止子序列是来自saccharomycescerevisiaes288c的天然序列。包括合适的限制位点的合成的启动子-基因序列由genart(regensburg，德国)合成。该合成片段是质粒psuc223的一部分(图1)。seqidno：2中描述了psuc223的完整序列。质粒psuc223含有kanmx标记，允许选择g418存在下的生长。如gueldender等人(nucleicacidsres.1996年7月1日；24(13):2519-24)所述，可以通过cre重组酶的作用除去侧翼为lox66和lox71位点(albert等人,plantjournal,7(4),649-659)的kanmx标记。tdh1p-fumb-tdh1t和lox66-kanmx-lox71序列的侧翼是允许通过双交换而在yprctau3基因座整合的序列，所述yprctau3基因座位于染色体xvi上。使用限制酶apali和xhoi限制切割质粒psuc223。从琼脂糖凝胶中切出5.408bp的片段，该片段含有5’yprctau3侧翼、合成的fumb构建体、侧翼为lox66和lox71位点的kanmx选择标记以及3’yprctau3侧翼，并使用zymocleantm凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch,irvine,ca,usa)根据制造商的说明进行纯化。将该片段转化到菌株suc-708中。在用于选择含有kanmx标记的转化体的补充有200μgg418/毫升的酵母提取物细菌蛋白胨(yep)2％半乳糖板上选择转化体，产生了多个转化体。通过pcr证实了引入的fumb基因的存在，所述pcr使用可以与seqidno：2所编码的orf的编码序列退火的引物序列。正确的转化体之一suc-708fum_01#3被命名为suc-813。使用signalp3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)(bendtsen等人,2004,mol.biol.,340:783-795)和targetp1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/)(emanuelsson等人,2007,natureprotocols2,953-971)分析由yel047c编码的s.cerevisiae的延胡索酸还原酶frd1(ec1.3.1.6，uniprot检索号为p32614)是否存在信号序列。s.cerevisiaefrd1蛋白具有多种可能的定位。它含有预测的19个氨基酸的信号肽。去除推定的sp之后，预测的胞质溶胶定位倾向大幅提高。省略19个氨基酸的信号肽的变体描述于seqidno：3中，其经受了如wo2008/000632中公开的密码子对方法以在s.cerevisiae中表达。终止密码子taa被修饰为taag。frd1基因的表达由tdh3启动子(紧接在tdh3基因的起始密码子之前的600bp)和tdh3终止子(紧接在tdh3基因的终止密码子之后的300bp)控制。控制frd1表达的tdh3启动子和tdh3终止子序列是来自saccharomycescerevisiaes288c的天然序列。包括合适的限制位点的合成的启动子-基因序列由dna2.0(menlopark,ca,usa)合成，并描述于seqidno：4中。如图2所示，将经修饰的frd1基因转化到菌株suc-813中。使用如pct/ep2013/055047中所述的“分裂cre重组酶整合”或“直接cre重组酶整合”(dci)方法，用经修饰的frd1基因置换菌株suc-813中的pdc6基因。使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs，usa)根据制造商的说明生成pcr片段。通过使用seqidno：5和seqidno：6中描述的引物序列，使用包含seqidno：4的dna2.0的克隆质粒作为模板，来生成pcr片段1。seqidno：5与pdc6基因的5'区域(其直接位于pdc6基因的起始密码子之前)具有66bp重叠。通过使用seqidno：7和seqidno：8中描述的引物序列，使用质粒psuc228(图3，seqidno：9)作为模板，来生成pcr片段2。质粒psuc228是pct/ep2013/055047中所述的psuc227的经修饰版本。质粒psuc227含有kanmx标记，该标记被诺尔丝菌素(natmx4)标记(goldstein和mccusker,yeast.1999年10月；15(14):1541-53)置换，从而产生了psuc228。通过使用seqidno：10和seqidno：11中描述的引物序列，使用(pct/ep2013/055047中所述的)psuc225作为模板，来生成pcr片段3。seqidno：11与pdc6基因的3'区域(其直接位于pdc6基因的终止密码子之后)具有64bp重叠。利用标准琼脂糖电泳技术检查pcr片段的大小。使用zymocleantm凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch,irvine,ca,usa)根据制造商的说明纯化pcr扩增的dna片段。通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的pcr片段1、2和3转化s.cerevisiae菌株suc-813。pcr片段1在其3'端与pcr片段2具有重叠。pcr片段3在其5'端与pcr片段2具有重叠。pcr片段2在其5'端与pcr片段1具有重叠，并在其3'端与pcr片段3具有重叠，从而使得允许所有三个pcr片段的同源重组(图2)。pcr片段1的5'端和pcr片段3的3'端与pdc6基因座同源，使得所有三个pcr片段能够整合在pdc6基因座。这产生了一个由整合在pdc6基因座的pcr片段1至3组成的线性片段(图2)。专利申请wo2013/076280中描述了这种整合方法。将转化混合物涂布在含有100μg诺尔丝菌素(jenabioscience，德国)/ml的ypd-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有100μg诺尔丝菌素/ml的新鲜ypd-琼脂板上。随后，通过pct/ep2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和cre重组酶，从而导致pdc6基因被seqidno：4置换，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。由于cre重组酶的活性，被引入基因组dna中以产生菌株suc-813的侧翼为lox66和lox71位点的kanmx标记也被有效地移除。所产生的无标记菌株被命名为suc-947。菌株suc-947能够在ypd-琼脂板上生长，但不能在补充有200μgg418/ml或100μg/ml诺尔丝菌素或两者的ypd-琼脂板上生长，从而证实了kanmx和natmx4标记均被移除。实施例2：构建酵母菌株sup-003并通过sup-003生产琥珀酸生成pcr片段使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs，usa)根据制造商的说明生成pcr片段。通过使用seqidno：20和seqidno：21中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段4。seqidno：21与gut2基因的5'区域(其直接位于gut2基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用seqidno：22和seqidno：24中描述的引物序列，使用质粒psuc227(图5，seqidno：43)作为模板，来生成pcr片段5。通过使用seqidno：23和seqidno：25中描述的引物序列，使用质粒psuc225(图6，seqidno：44)作为模板，来生成pcr片段6。通过使用seqidno：26和seqidno：27中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段7。seqidno：26与gut2基因的3'区域(其直接位于gut2基因的终止密码子之后)具有29bp重叠。利用标准琼脂糖电泳技术检查pcr片段的大小。使用zymocleantm凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch,irvine,ca,usa)根据制造商的说明纯化pcr扩增的dna片段。转化到菌株suc-947中以构建菌株sup-003如实施例1所述构建saccharomycescerevisiae菌株suc-947。使用菌株suc-947作为构建菌株sup-003的起点。通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的pcr片段4、5、6和7转化s.cerevisiae菌株suc-947。pcr片段4在其3'端与pcr片段5具有重叠。pcr片段7在其5'端与pcr片段6具有重叠。pcr片段5在其5'端与pcr片段4具有重叠，并在其3'端与pcr片段6具有重叠，并且pcr片段6在其5'端与pcr片段5具有重叠，并在其3'端与pcr片段7具有重叠，从而使得允许所有4个pcr片段的同源重组(图4)。pcr片段4的5'端和pcr片段7的3'端与gut2基因座同源，使得所有4个pcr片段能够整合在gut2基因座。这产生了一个由整合在gut2基因座的pcr片段4至7组成的线性片段(图4)。实施例1中描述了这种整合方法。将转化混合物涂布在含有200μgg418/ml的ypd-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有200μgg418/ml的新鲜ypd-琼脂板上。随后，通过pct/ep2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和cre重组酶，从而导致gut2基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为sup-003。菌株sup-003能够在ypd-琼脂板上生长，但不能在补充有200μgg418/ml的ypd-琼脂板上生长，从而证实了kanmx标记被移除。通过sup-003生产琥珀酸如通用的材料和方法中所述进行琥珀酸生产实验并测量琥珀酸滴度。如在微量滴定板发酵中所测定的，在sup-003的上清液中检测到的琥珀酸比在suc-947的上清液中检测到的琥珀酸多2.5％。实施例3：构建酵母菌株sup-001并通过sup-001生产琥珀酸生成pcr片段使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs，usa)根据制造商的说明生成pcr片段。通过使用seqidno：34和seqidno：35中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段8。seqidno：35与nde1基因的5'区域(其直接位于nde1基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用seqidno：22和seqidno：38中描述的引物序列，使用质粒psuc227(图5，seqidno：43)作为模板，来生成pcr片段9。通过使用seqidno：23和seqidno：39中描述的引物序列，使用质粒psuc225(图6，seqidno：44)作为模板，来生成pcr片段10。通过使用seqidno：36和seqidno：37中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段11。seqidno：36与nde1基因的3'区域(其直接位于nde1基因的终止密码子之后)具有18bp重叠。利用标准琼脂糖电泳技术检查pcr片段的大小。使用zymocleantm凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch,irvine,ca,usa)根据制造商的说明纯化pcr扩增的dna片段。转化到菌株suc-947中以构建菌株sup-001如实施例1所述构建saccharomycescerevisiae菌株suc-947。使用菌株suc-947作为构建菌株sup-001的起点。通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的pcr片段8、9、10和11转化s.cerevisiae菌株suc-947。pcr片段8在其3'端与pcr片段9具有重叠。pcr片段11在其5'端与pcr片段10具有重叠。pcr片段9在其5'端与pcr片段8具有重叠，并在其3'端与pcr片段10具有重叠，并且pcr片段10在其5'端与pcr片段9具有重叠，并在其3'端与pcr片段11具有重叠，从而使得允许所有4个pcr片段的同源重组(图7)。pcr片段8的5'端和pcr片段11的3'端与nde1基因座同源，使得所有4个pcr片段能够整合在nde1基因座。这产生了一个由整合在nde1基因座的pcr片段8至11组成的线性片段(图7)。实施例1中描述了这种整合方法。将转化混合物涂布在含有200μgg418/ml的ypd-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有200μgg418/ml的新鲜ypd-琼脂板上。随后，通过pct/ep2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和cre重组酶，从而导致nde1基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为sup-001。菌株sup-001能够在ypd-琼脂板上生长，但不能在补充有200μgg418/ml的ypd-琼脂板上生长，从而证实了kanmx标记被移除。通过sup-001生产琥珀酸如通用的材料和方法中所述进行琥珀酸生产实验并测量琥珀酸滴度。如在微量滴定板发酵中所测定的，在sup-001的上清液中检测到的琥珀酸比在suc-947的上清液中检测到的琥珀酸多5％。实施例4：构建酵母菌株sup-002并通过sup-002生产琥珀酸生成pcr片段使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs，usa)根据制造商的说明生成pcr片段。通过使用seqidno：28和seqidno：29中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段12。seqidno：29与nde2基因的5'区域(其直接位于nde2基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用seqidno：22和seqidno：32中描述的引物序列，使用质粒psuc227(图5，seqidno：43)作为模板，来生成pcr片段13。通过使用seqidno：23和seqidno：33中描述的引物序列，使用质粒psuc225(图6，seqidno：44)作为模板，来生成pcr片段14。通过使用seqidno：30和seqidno：31中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段15。seqidno：30与nde2基因的3'区域(其直接位于nde2基因的终止密码子之后)具有26bp重叠。利用标准琼脂糖电泳技术检查pcr片段的大小。使用zymocleantm凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch,irvine,ca,usa)根据制造商的说明纯化pcr扩增的dna片段。转化到菌株suc-947中以构建菌株sup-002如实施例1所述构建saccharomycescerevisiae菌株suc-947。使用菌株suc-947作为构建菌株sup-002的起点。通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的pcr片段12、13、14和15转化s.cerevisiae菌株suc-947。pcr片段12在其3'端与pcr片段13具有重叠。pcr片段15在其5'端与pcr片段14具有重叠。pcr片段13在其5'端与pcr片段12具有重叠，并在其3'端与pcr片段14具有重叠，并且pcr片段14在其5'端与pcr片段13具有重叠，并在其3'端与pcr片段15具有重叠，从而使得允许所有4个pcr片段的同源重组(图8)。pcr片段12的5'端和pcr片段15的3'端与nde2基因座同源，使得所有4个pcr片段能够整合在nde2基因座。这产生了一个由整合在nde2基因座的pcr片段12至15组成的线性片段(图8)。实施例1中描述了这种整合方法。将转化混合物涂布在含有200μgg418/ml的ypd-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有200μgg418/ml的新鲜ypd-琼脂板上。随后，通过pct/ep2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和cre重组酶，从而导致nde2基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为sup-002。菌株sup-002能够在ypd-琼脂板上生长，但不能在补充有200μgg418/ml的ypd-琼脂板上生长，从而证实了kanmx标记被移除。通过sup-002生产琥珀酸如通用的材料和方法中所述进行琥珀酸生产实验并测量琥珀酸滴度。如在微量滴定板发酵中所测定的，在sup-002的上清液中检测到的琥珀酸比在suc-947的上清液中检测到的琥珀酸多2.3％。实施例5：构建酵母菌株sup-004转化菌株sup-001以构建菌株sup-004如实施例3所述构建saccharomycescerevisiae菌株sup-001。使用菌株sup-001作为构建菌株sup-004的起点。sup-001包含nde1缺失。为了产生nde1、nde2双重缺失，根据实施例4中所述的方法在sup-001中缺失nde2。实施例6：构建酵母菌株sup-005转化菌株sup-004以构建菌株sup-005如实施例5所述构建saccharomycescerevisiae菌株sup-004。使用菌株sup-004作为构建菌株sup-005的起点。sup-004包含nde1和nde2双重缺失。为了产生nde1、nde2、gut2三重缺失，根据实施例2中所述的方法在sup-004中缺失gut2，从而生成了sup-005。实施例7：构建酵母菌株sup-006生成pcr片段使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs，usa)根据制造商的说明生成pcr片段。通过使用seqidno：45和seqidno：46中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段16。seqidno：46与gpd1基因的5'区域(其直接位于gpd1基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用seqidno：47和seqidno：22中描述的引物序列，使用质粒psuc227(图5，seqidno：43)作为模板，来生成pcr片段17。通过使用seqidno：23和seqidno：48中描述的引物序列，使用质粒psuc225(图6，seqidno：44)作为模板，来生成pcr片段18。通过使用seqidno：49和seqidno：50中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段19。seqidno：49与gpd1基因的3'区域(其直接位于gpd1基因的终止密码子之后)具有26bp重叠。利用标准琼脂糖电泳技术检查pcr片段的大小。使用zymocleantm凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch,irvine,ca,usa)根据制造商的说明纯化pcr扩增的dna片段。转化菌株sup-005以构建菌株sup-006如实施例6所述构建saccharomycescerevisiae菌株sup-005。使用菌株sup-005作为构建菌株sup-006的起点。通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的pcr片段16、17、18和19转化s.cerevisiae菌株sup-005。pcr片段16在其3'端与pcr片段17具有重叠。pcr片段19在其5'端与pcr片段18具有重叠。pcr片段17在其5'端与pcr片段16具有重叠，并在其3'端与pcr片段18具有重叠，并且pcr片段18在其5'端与pcr片段17具有重叠，并在其3'端与pcr片段19具有重叠，从而使得允许所有4个pcr片段的同源重组(图9)。pcr片段16的5'端和pcr片段19的3'端与gpd1基因座同源，使得所有4个pcr片段能够整合在gpd1基因座。这产生了一个由整合在gpd1基因座的pcr片段16至19组成的线性片段(图9)。实施例1中描述了这种整合方法。将转化混合物涂布在含有200μgg418/ml的ypd-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有200μgg418/ml的新鲜ypd-琼脂板上。随后，通过pct/ep2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和cre重组酶，从而导致gpd1基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为sup-006。菌株sup-006能够在ypd-琼脂板上生长，但不能在补充有200μgg418/ml的ypd-琼脂板上生长，从而证实了kanmx标记被移除。实施例8：构建酵母菌株sup-007生成pcr片段使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs，usa)根据制造商的说明生成pcr片段。通过使用seqidno：51和seqidno：52中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段20。seqidno：52与gpd2基因的5'区域(其直接位于gpd2基因的起始密码子之前)具有27bp重叠。通过使用seqidno：53和seqidno：22中描述的引物序列，使用质粒psuc227(图5，seqidno：43)作为模板，来生成pcr片段21。通过使用seqidno：23和seqidno：54中描述的引物序列，使用质粒psuc225(图6，seqidno：44)作为模板，来生成pcr片段22。通过使用seqidno：55和seqidno：56中描述的引物序列，使用基因组dna作为模板，来生成pcr片段23。seqidno：55与gpd2基因的3'区域(其直接位于gpd2基因的终止密码子之后)具有26bp重叠。利用标准琼脂糖电泳技术检查pcr片段的大小。使用zymocleantm凝胶dna回收试剂盒(zymoresearch,irvine,ca,usa)根据制造商的说明纯化pcr扩增的dna片段。转化菌株sup-006以构建菌株sup-007如实施例7所述构建saccharomycescerevisiae菌株sup-006。使用菌株sup-006作为构建菌株sup-007的起点。通过本领域技术人员已知的方法进行酵母转化。用纯化的pcr片段20、21、22和23转化s.cerevisiae菌株sup-006。pcr片段20在其3'端与pcr片段21具有重叠。pcr片段23在其5'端与pcr片段22具有重叠。pcr片段21在其5'端与pcr片段20具有重叠，并在其3'端与pcr片段22具有重叠，并且pcr片段22在其5'端与pcr片段21具有重叠，并在其3'端与pcr片段23具有重叠，从而使得允许所有4个pcr片段的同源重组(图10)。pcr片段20的5'端和pcr片段23的3'端与gpd2基因座同源，使得所有4个pcr片段能够整合在gpd2基因座。这产生了一个由整合在gpd2基因座的pcr片段20至23组成的线性片段(图10)。实施例1中描述了这种整合方法。将转化混合物涂布在含有200μgg418/ml的ypd-琼脂(每升：10g酵母提取物，20g/l蛋白胨，20g/l右旋糖，20g琼脂)上。在30℃下生长3-5天后，将各个转化体重新划线在含有200μgg418/ml的新鲜ypd-琼脂板上。随后，通过pct/ep2013/055047中所述的方法经由重组有效地移除标记盒和cre重组酶，从而导致gpd2基因被缺失，并留下lox72位点，这是lox66和lox71位点之间重组的结果。所产生的无标记菌株被命名为sup-007。菌株sup-007能够在ypd-琼脂板上生长，但不能在补充有200μgg418/ml的ypd-琼脂板上生长，从而证实了kanmx标记被移除。实施例9：在sup-005和sup-007中生产琥珀酸在摇瓶(50ml)中在30℃和280rpm下培养suc-947、sup-005和sup-007酵母菌株3天。培养基基于verduyn等人(verduync,postmae,schefferswa,vandijkenjp.yeast,1992jul；8(7):501-517)，碳源和氮源有更改，如下文所述。表2.预培养基组成原材料浓度(g/kg)半乳糖c6h12o6.h2o20.00尿素(nh2)2co2.30磷酸二氢钾kh2po43.00硫酸镁mgso4.7h2o0.50微量元素溶液a1.00维生素溶液b1.00白垩caco31.00a微量元素溶液b维生素溶液组分式浓度(g/kg)生物素(d-)c10h16n2o3s0.05cad(+)泛酸c18h32can2o101.00烟酸c6h5no21.00肌醇c6h12o625.00盐酸氯化硫胺c12h18cl2n4os.xh2o1.00盐酸吡哆醇c8h12clno31.00对氨基苯甲酸c7h7no20.20随后，将约3ml摇瓶的内容物转移到含有表3中所示培养基的种子发酵罐(起始体积为0.3kg，1％接种强度)中。表3.种子发酵罐的培养基组成原材料浓度(g/kg)硫酸铵(nh4)2so41.00磷酸二氢钾kh2po410.00硫酸镁mgso4.7h2o5.00微量元素溶液-8.00维生素溶液-8.00通过添加氨水(10重量％)将ph控制在5.0。温度控制在30℃。通过调节搅拌器速度将po2控制在25％(相对于空气饱和度)。应用的总气流为18nl/h。保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制(应用指数(exponent)0.15)。发酵68小时后，将80g种子发酵罐中的培养液转移至生产发酵罐(起始体积为0.4kg)，其含有表4中所示培养基。表4.生产发酵罐的培养基组成不应用ph控制，因为最初加入的caco3使培养基的ph缓冲在5-5.5。作为自然酸化的结果，在发酵结束时，ph降至3。将温度控制在30℃。应用的总气流为12nl/h，50％空气和50％co2。保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料(进料中的葡萄糖浓度为423g/kg)所限制(0-9h：5.6ml/hg/l/h；>9h：进料以ml/h计＝(0.0003*(t)^2-0.1028*(t)+7.8991)*4/5)。需要时，相应地调节这些速率。在发酵48小时后利用nmr分析葡萄糖和琥珀酸。将发酵样品的上清液在milliq水中稀释两次(1:1)。准确称量约500mg样品到合适的小瓶中，并称量约500mg内标溶液(包含在d2o中的10g/l马来酸)到该小瓶中。随后将小瓶置于预热的水浴(100度)中并使样品沸腾10分钟。将材料冻干并溶解在1ml含有痕量dss(4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)的d2o中。使用不具有水抑制的脉冲程序(zg)，在300k的温度下，使用90度激发脉冲、2.0s的采集时间和40s的放松延迟，在配备有he冷却低温探头、以500mhz的质子频率运行的bestbrukeravanceiii光谱仪上记录1d1hnmr谱。扫描次数设置为8，不使用虚拟扫描。基于以下信号(δ相对于4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)计算苹果酸浓度[以g/l计]：苹果酸：2.92ppm处的苹果酸信号的第一dd，n＝1h(苹果酸α-ch2信号为ddd,2.89ppm,2hj＝4hz,j＝17hz,j＝44hz)。基于以下信号(δ相对于4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)计算琥珀酸浓度[以g/l计]：琥珀酸：2.67ppm处的琥珀酸信号(s，4h)；用于标准品的信号：约6.3ppm处的马来酸峰(s，2h)。bharti等人,2012,tractrendsinanalyticalchemistry35:5-26描述了通过nmr定量。通过将产生的琥珀酸的量除以消耗的糖的总量(包括在生物质繁殖阶段期间)来计算发酵产率(琥珀酸的g数/葡萄糖的g数)。如在受控补料分批发酵中所测定的，与suc-947相比，含有nde1、nde2、gut2三重缺失的菌株sup-005显示出琥珀酸的发酵产率提高2％。编码线粒体外部nadh脱氢酶(例如nde1和/或nde2)和线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶(例如gut2)的基因的缺失的组合显示出对宿主细胞中琥珀酸的发酵产率具有有益的影响。如在受控补料分批发酵中所测定的，与suc-947相比，含有nde1、nde2、gut2、gpd1和gpd2五重缺失的菌株sup-007显示出琥珀酸的发酵产率进一步提高；即提高6％。如在受控补料分批发酵中所测定的，与suc-947相比，琥珀酸滴度显示出增加6％。编码胞质溶胶甘油-3-磷酸脱氢酶的基因的缺失(例如gpd1和/或gpd2缺失)显示出对宿主细胞中琥珀酸的滴度和发酵产率具有进一步有益的影响。序列表<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司<120>用于二羧酸生产的宿主细胞<160>70<170>bissap1.2<210>1<211>548<212>prt<213>escherichiacoli<400>1metserasnlyspropheiletyrglnalapropheprometglylys151015aspasnthrglutyrtyrleuleuthrserasptyrvalservalala202530asppheaspglygluthrileleulysvalgluproglualaleuthr354045leuleualaglnglnalaphehisaspalaserphemetleuargpro505560alahisglnlysglnvalalaalaileleuhisaspproglualaser65707580gluasnasplystyrvalalaleuglnpheleuargasnsergluile859095alaalalysglyvalleuprothrcysglnaspthrglythralaile100105110ilevalglylyslysglyglnargvaltrpthrglyglyglyaspglu115120125gluthrleuserlysglyvaltyrasnthrtyrilegluaspasnleu130135140argtyrserglnasnalaalaleuaspmettyrlysgluvalasnthr145150155160glythrasnleuproalaglnileaspleutyralavalaspglyasp165170175glutyrlyspheleucysvalalalysglyglyglyseralaasnlys180185190thrtyrleutyrglngluthrlysalaleuleuthrproglylysleu195200205lysasnpheleuvalglulysmetargthrleuglythralaalacys210215220proprotyrhisilealaphevalileglyglythrseralagluthr225230235240asnleulysthrvallysleualaseralahistyrtyraspgluleu245250255prothrgluglyasngluhisglyglnalapheargaspvalglnleu260265270gluglngluleuleugluglualaglnlysleuglyleuglyalagln275280285pheglyglylystyrphealahisaspileargvalileargleupro290295300arghisglyalasercysprovalglymetglyvalsercysserala305310315320aspargasnilelysalalysileasnarggluglyiletrpileglu325330335lysleugluhisasnproglyglntyrileproglngluleuarggln340345350alaglygluglyglualavallysvalaspleuasnargprometlys355360365gluileleualaglnleuserglntyrprovalserthrargleuser370375380leuthrglythrileilevalglyargaspilealahisalalysleu385390395400lysgluleuileaspalaglylysgluleuproglntyrilelysasp405410415hisproiletyrtyralaglyproalalysthrproalaglytyrpro420425430serglyserleuglyprothrthralaglyargmetaspsertyrval435440445aspleuleuglnserhisglyglysermetilemetleualalysgly450455460asnargserglnglnvalthraspalacyshislyshisglyglyphe465470475480tyrleuglyserileglyglyproalaalavalleualaglnglnser485490495ilelyshisleuglucysvalalatyrprogluleuglymetgluala500505510iletrplysilegluvalgluasppheproalapheileleuvalasp515520525asplysglyasnaspphepheglnglnilevalasnlysglncysala530535540asncysthrlys545<210>2<211>8074<212>dna<213>artificialsequence<220><221>source<222>1..8074<223>/organism="artificialsequence"/note="sequenceofplasmidpsuc223"/mol_type="unassigneddna"<400>2gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggca60cgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagct120cactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaat180tgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttaa240ttaaaggaggtgcacgcattatggagaccactacgatacgatagctgcgttgttgttgaa300ggggtttcttaaggttgttttcgttgaaggtaaatattggtcgtttttgtgcagcatatt360gtcctctagatgcaaactctgcaggtccatttgcagtaaagtgagttgcctctcgaagaa420tcattaatttcgtataaccgtcactattaaagtcagaaaataaattctgtcgtagacaat480gttaccataatgttcttgtccattttgcatacactttaaatattcatttgatttctcagg540gttcatgatcataataaattgcgcattcgcaaggcggtagtattataatggggtccatca600ttctgtagcaagaagttacagtacgctgttcaagcgttaaacaagataagtaatctcgaa660tgaaacattcatatttcgcatgagccaacatacagttgctgagtaatcttcattgcgctt720atttatcggcattgagattgtaaaggaagtaaaacgcatttttgcagatctgttctctta780tgtatttttaatcgtccttgtatggaagtatcaaaggggacgttcttcacctccttggaa840ggatcccagcgccagtagggttgttgagcttagtaaaaatgtgcgcaccacaagcctaca900tgactccacgtcacatgaaaccacaccgtggggccttgttgcgctaggaataggatatgc960gacgaagacgcttctgcttagtaaccacaccacattttcagggggtcgatctgcttgctt1020cctttactgtcacgagcggcccataatcgcgctttttttttaaaaggcgcgagacagcaa1080acaggaagctcgggtttcaaccttcggagtggtcgcagatctggagactggatctttaca1140atacagtaaggcaagccaccatctgcttcttaggtgcatgcgacggtatccacgtgcaga1200acaacatagtctgaagaagggggggaggagcatgttcattctctgtagcagtaagagctt1260ggtgataatgaccaaaactggagtctcgaaatcatataaatagacaatatattttcacac1320aatgagatttgtagtacagttctattctctctcttgcataaataagaaattcatcaagaa1380cttggtttgatatttcaccaacacacacaaaaaacagtacttcactaaatttacacacaa1440aacaaaatgtccaacaagcctttcatctaccaagctccattcccaatgggtaaggacaac1500actgaatactacttgttgacttctgactacgtttccgttgctgatttcgatggtgaaacc1560atcttgaaggttgaaccagaagccttgactttgttggctcaacaagccttccacgatgct1620tctttcatgttgcgtccagctcaccaaaagcaagttgctgccattttgcacgacccagaa1680gcctccgaaaacgacaaatacgttgctttgcaattcttgagaaactctgaaattgctgcc1740aagggtgtcttaccaacttgtcaagacactggtactgccatcattgtcggtaagaagggt1800caaagagtctggaccggtggtggtgacgaagaaactctatccaagggtgtttacaacact1860tacattgaagataatttacgttactctcaaaatgctgctttggacatgtacaaggaagtc1920aacactggtaccaacttgccagctcaaatcgacttatacgctgttgacggtgacgaatac1980aagttcttgtgtgttgccaagggtggtggttctgctaacaagacctacttgtaccaagaa2040accaaggctttgttgactccaggtaaattgaagaacttcttggtcgaaaagatgagaact2100ttgggtactgctgcttgtccaccataccacattgctttcgttatcggtggtacttccgct2160gaaaccaacttgaaaaccgtcaaattggcttccgctcactactacgatgaattgccaact2220gaaggtaacgaacacggtcaagccttcagagatgtccaattggaacaagaattgttggaa2280gaagctcaaaaattaggtttgggtgctcaatttggtggtaaatactttgctcacgatatc2340agagttatcagattaccaagacatggtgcttcttgtccagttggtatgggtgtttcctgt2400tctgctgacagaaacatcaaggccaagatcaacagagaaggtatctggattgaaaaattg2460gaacacaacccaggtcaatacatcccacaagaattgagacaagctggtgaaggtgaagct2520gtcaaggttgacttgaacagaccaatgaaggaaatcttggctcaattatctcaataccca2580gtttccaccagattatctttgaccggtaccatcattgtcggtcgtgacattgctcatgcc2640aagttgaaggaattgattgatgctggtaaggaattgcctcaatacatcaaggaccatcca2700atctactacgctggtccagccaagaccccagctggttacccatctggttctttgggtcca2760accaccgctggtagaatggactcttacgttgacttgctacaatctcacggtggttccatg2820atcatgttggctaagggtaacagatctcaacaagtcaccgatgcttgtcacaagcacggt2880ggtttctatttgggttccattggtggtccagctgctgtcttggctcaacaatctatcaag2940cacttggaatgtgttgcttacccagaattgggtatggaagccatctggaagattgaagtc3000gaagatttcccagctttcatcttagtcgatgacaagggtaacgacttcttccaacaaatt3060gtcaacaagcaatgtgccaactgtaccaagtaagcgtacgataaagcaatcttgatgagg3120ataatgatttttttttgaatatacataaatactaccgtttttctgctagattttgtgaag3180acgtaaataagtacatattactttttaagccaagacaagattaagcattaactttaccct3240tttctcttctaagtttcaatactagttatcactgtttaaaagttatggcgagaacgtcgg3300cggttaaaatatattaccctgaacgtggtgaattgaagttctaggatggtttaaagattt3360ttcctttttgggaaataagtaaacaatatattgctgccttggcgcgccccttccgggccc3420acgcgtggccggccgcggccgccagctgaagcttcgtacgctgcaggtcgacgaattcta3480ccgttcgtataatgtatgctatacgaagttatagatctgtttagcttgcctcgtccccgc3540cgggtcacccggccagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgc3600gcagctcaggggcatgatgtgactgtcgcccgtacatttagcccatacatccccatgtat3660aatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaaaattacggctcct3720cgctgcagacctgcgagcagggaaacgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacg3780ccgcgcccctgtagagaaatataaaaggttaggatttgccactgaggttcttctttcata3840tacttccttttaaaatcttgctaggatacagttctcacatcacatccgaacataaacaac3900catgggtaaggaaaagactcacgtttcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctga3960tttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcg4020attgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgc4080caatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttcc4140gaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccc4200cggcaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttga4260tgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaa4320cagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttga4380tgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaat4440gcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttga4500taaccttatttttgacga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