铰链修饰的抗体片段和其制备方法与流程

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序列表

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发明领域

本公开内容涉及对预先存在的抗铰链抗体(aha)具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段(例如fab和f(ab’)2)和包含此类抗体片段的组合物，以及制备和使用这样的抗体片段和组合物的方法。

背景

抗体包含两个通过柔性铰链区连接至fc的fab区域。虽然fab介导抗原的识别和结合，但fc的两个重要功能是通过与fcγ受体结合来介导效应子功能(1)，以及通过与补救受体fcrn结合而赋予长的血清半寿期(2)。具体而言，igg的缓慢药代动力学有助于抗体作为治疗剂的成功，因为其相比于其他生物治疗剂能够允许较少的频率给药。因此，大多数批准的治疗性抗体具有全长igg形式。与igg不同，分离的fab片段的血清半寿期短(3)，如三种fda批准的fab分子一样，当需要较短的血浆半寿期时，这种性质对于适应症是必需的(4)。一种针对血小板表面受体gpiib/iiia的治疗性fab分子(阿昔单抗，)通过用木瓜蛋白酶进行蛋白水解切割而商业生产(5)，所述木瓜蛋白酶是fab生产的最初方法(6)。随着分子克隆的进展，抗体片段的重组表达已成为产生fab分子的有吸引力的途径，如第二个被批准的fab治疗剂：抗vegf(雷珠单抗，)(7)和最近批准的针对达比加群(dabigatran)的fab(idarucizumab，)(33)所例证的。例如，当期望在给药后不持续存在的暂时全身性活性或当施用和活性局限于诸如眼睛的外围区室时，fab分子是有利的。

许多针对抗体铰链区的蛋白酶都与病原体和肿瘤细胞试图逃避宿主免疫反应的机制有关(13)。然而，产生的c端新表位最终被免疫系统识别并产生抗铰链抗体(aha)。几项研究(17-21)显示了fab的上铰链区和f(ab’)2的下铰链区的这类自身抗体。这些预先存在的aha滴度因供体不同而不同(20)，并且可能代表过去和目前暴露于这类新表位。在某些情况下，aha可以作为替代性fc发挥作用并恢复蛋白水解灭活抗体的效应子功能(22)。作为使用fab或f(ab’)2分子作为治疗形式的一个基本原理是消除效应子功能，不期望通过由预先存在的aha恢复效应子功能并且冒任何潜在的安全隐患。因此，本领域需要新的fab和f(ab’)2分子，其对人血清中预先存在的aha具有降低的反应性或不具有反应性，尤其是通过减少药物治疗后的免疫反应而潜在地在治疗设置中提供优良的安全性。

发明概述

本公开涉及对预先存在的抗铰链抗体(aha)具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段(例如fab和f(ab’)2)和包含此类抗体片段的组合物，以及制备和使用这样的抗体片段和组合物的方法。

在某些实施方案中，本公开涉及分离的抗体片段和包含其的组合物，其中所述抗体片段对预先存在的抗铰链抗体具有降低的或没有反应性。在某些实施方案中，本公开的分离的抗体片段表现出对fcγriiia和/或c1q的降低结合和/或不结合。在某些实施方案中，抗体片段是fab、fab'或f(ab’)2。

在某些实施方案中，本公开涉及抗体片段和包含其的组合物，其中抗体片段是fab。在某些实施方案中，本公开涉及其中fab以残基d221终止的fab分子。在某些实施方案中，fab终止于包含选自下组的氨基酸序列的氨基酸：cdktht(seqidno：14)，cdkthl(seqidno：15)，cdkth(seqidno：16)，cdkt(seqidno：17)，cdk和cd。在某些实施方案中，fab终止于包含选自下组的氨基酸序列的氨基酸：kygpp(seqidno：18)，kygp(seqidno：19)，kyg，ky和k。在某些实施方案中，fab包含重链恒定区，所述重链恒定区包含选自seqidno：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13和其保守修饰的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本公开涉及抗体片段和包含其的组合物，其中所述抗体片段是f(ab’)2。在某些实施方案中，本公开涉及f(ab’)2分子，其中f(ab’)2包含1，2，3，4或5个氨基酸的c端缺失。在本公开的某些实施方案中，f(ab’)2包含在位置eu231处缺失。在本公开的某些实施方案中，f(ab’)2包含在位置eu231-232处缺失。在本公开的某些实施方案中，f(ab’)2包含在位置eu231-233处缺失。在本公开的某些实施方案中，f(ab’)2包含在位置eu231-234处缺失。在某些实施方案中，f(ab’)2包含在位置eu230-234处缺失。

在某些实施方案中，本公开涉及分离的核酸和包含其的组合物，其中所述核酸编码对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段。在某些实施方案中，本公开涉及包含所述核酸的宿主细胞。在某些实施方案中，本公开涉及产生抗体片段的方法，包括培养所述宿主细胞以便产生抗体片段。在某些实施方案中，本公开涉及药物制剂，其包含对aha具有降低的或没有反应性的抗体片段和可药用载体。

在某些实施方案中，本公开涉及对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段用作药物。在某些实施方案中，本公开涉及对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段用于治疗疾病。在某些实施方案中，本公开涉及对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段用于抑制或激活分子途径和/或机制。在某些实施方案中，本公开涉及对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段在制备用于治疗疾病的药物中的用途。在某些实施方案中，本公开涉及对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段在制备用于抑制或激活分子途径和/或机制的药物中的用途。

在某些实施方案中，本公开涉及治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括向个体施用有效量的对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段。在某些实施方案中，本公开涉及抑制或激活个体中分子途径和/或机制的方法，其包括向个体施用有效量的对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段以抑制或激活分子途径和/或机制。

附图简述

图1a-1d示出了预先存在的人抗体与人igg1，igg2和igg4的fab的结合。(1a)包含上铰链的fab区域(pdb：1hzh)的x射线晶体结构；轻链(101)，重链(102)，链间二硫键(103)和上铰链(104)。在分离的fab分子中，上铰链是没有结构和功能作用的突出的非结构化区域。上铰链的残基以品红色显示以指示扰乱与预先存在的aha结合的t225l突变(105)。残基的编号根据eu编号命名。图1a按照出现顺序分别公开了seqidnos14-15。(1b)将汇合的人血清与具有不同上铰链长度和末端的人igg1fab温育。通过抗fcelisa检测结合预先存在的抗体。将fabc端截短至d221(d)和c端变体t225l(dkthl(seqidno：20))大大降低了预先存在的抗体对几乎所有背景的结合。对t223作为c端残基(dkt)观察到强反应，与人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的切割位点相一致。各个数据点的平均值以水平线表示。图1b按照出现顺序分别公开了seqidnos20-21和27。(1c)将三种不同的fab与汇合的人血清温育，并通过elisa检测预先存在的抗体的结合。观察到具有dktht(seqidno：21)c端的不同fab的显著信号。在不同fab中检测到预先存在的抗体与d221和t225lc端的降低的结合。fab-1包括用于(b)和贯穿实施例1的所有其他aha结合实验中的抗体可变结构域。图1c按出现顺序分别公开了seqidnos21，20，21，20，21和20。(1d)将汇合的人血清与具有不同上铰链长度的人igg2fab和igg4fab温育并通过elisa检测结合抗体。对人igg2和igg4的上铰链，不能检测到预先存在的抗体。图1d公开了seqidno：18。

图2a-2c示出了ides对igg1-2嵌合体的切割。(2a)用moe建模的抗体cac10的f(ab’)2区域的模型；轻链(201)，重链(202)，链间二硫键(203)和下铰链(204)。ides的p1位置是g236。残基的编号根据eu编号命名。图2a公开了seqidno：30。(2b)igg1和igg1-2嵌合体的下铰链的比对。青色残基是引入到igg2下铰链的igg2同种型残基。图2b按照出现顺序分别公开了seqidnos31和59。(2c)人igg1和igg1-2嵌合体的切割效率。如所示，将1mg/ml的igg1和igg1-2在37℃与不同的ides量温育24小时。通过毛细管电泳分析切割。尽管igg1在1：500的ides：igg比率被有效切割成f(ab’)2，但igg1-2需要高50倍的ides浓度来完全切割。

图3a-3e示出了用ides对具有在p1和p2位置的变体的人igg1的切割。(3a)具有在p1和p2位置的变体的抗体在37℃用1:10比率的ides：igg(1mg/ml)消化24小时的毛细管电泳。p1和p2残基用1个字母的代码表示。亮氨酸和甘氨酸(l235g236)是这些位置的天然氨基酸。所有抗体变体可被完全切割成f(ab’)2片段。(3b)通过在不同的ides：igg比率下产生的f(ab’)2的量来评估变体的切割效率。尽管与野生型序列(lg)相比变体vg被切割，但其他变体需要增加量的ides以完全消化。(3c)通过在1:10的ides：igg比率下产生的f(ab’)2的量来评估变体的切割效率。(3d)人igg1变体的表达、纯化和筛选策略的示意图。图3d按照出现顺序分别公开了seqidnos31-34。(3e)利用ides对76个人igg1变体的切割效率。图3e公开了seqidno：31。

图4a-4b示出了p1和p2变体对预先存在的aha的反应性。(4a)ides在纯化过程中被有效去除，并且不能通过sds-page随后进行考马斯染色(上图)或用抗ides抗体免疫印迹分析(下图)在纯化的f(ab’)2变体中检测到。(4b)将汇合的人血清与具有t225c端的人igg1fab和与ides切割具有p1和p2位置变体的抗体产生的f(ab’)2温育。通过elisa检测对预先存在的抗体的结合。f(ab’)2显示出比fab高约1.7倍的信号。铰链变体将反应性降低至与fab相当的水平，但不完全消除反应性。

图5a-5f示出了截短的变体对预先存在的aha应答的反应性。(5a)ides切割具有在idesp3，p4和p5位点缺失的抗体。尽管下铰链中idesp3残基(l234)的缺失严重影响了切割效率，但与野生型(wt)相比，p4(e233)或p5(p232)位置的缺失不影响用ides的切割。(5b)p4和p5位置缺失不足以避免预先存在的aha的结合。(5c)ides切割具有idesp4至p6(δp456)和p4至p7(δp4567)位点缺失的抗体。尽管与野生型下铰链序列(wt)相比，δp4567变体的切割效率略微降低，但δp456显示在1：200的ides：igg比率时与野生型相当的切割效率。(5d)将汇合的人血清与通过ides消化产生的f(ab’)2温育并通过elisa检测抗体的结合。下铰链缺失δp456和δp4567未被预先存在的aha识别。(5e)ides以高特异性切割δp456铰链变体。野生型(wt)和δp456铰链igg消化后，通过质谱分析还原的f(ab’)2。仅观察到对应于预期分子量的单一重链物质。(5f)描绘在下铰链区产生的缺失的示意图。图5f按照出现的顺序分别公开了seqidnos35，31，36-40，31和41-42。

图6a-6b示出了人、食蟹猴和恒河猴中igg1，igg2，igg3和igg4同种型的上、核心和下铰链区内的氨基酸残基的比对(6a)和eu编号的氨基酸残基的比对(6b)。图6a按照出现顺序分别公开了seqidnos43-54。图6b按照出现顺序分别公开了seqidno43，46，55和52。

图7示出了在大肠杆菌中具有上铰链截短或突变的fab的表达水平。图按出现顺序分别公开了seqidnos14-15。

图8示出了在ides：igg比率为1：500或1:10下产生的δp456和δp4567变体的切割效率。图以出现顺序分别公开了seqidnos56-58。

图9a-9d示出了具有修饰的p1和p2残基的缺失变体与预先存在的aha的反应性。(9a)通过在1:10的ides：igg比率下产生的f(ab’)2的量来评估变体的切割效率。图9a公开了seqidno：31。(9b)通过在1：100的ides：igg比率下产生的f(ab’)2的量来评估变体的切割效率。图9b公开了seqidno：31。(9c)通过在1：500的ides：igg比率下产生的f(ab’)2的量评估变体的切割效率。图9c公开了seqidno：31。(9d)通过抗fcelisa检测结合的预先存在的aha与变体的结合。图9d公开了seqidno：56。

图10a-10b示出了具有修饰的p1和p2残基的δp456和δp4567变体与预先存在的aha的反应性。(10a)通过在1:10和1:200的ides：igg比率下产生的f(ab’)2的量来评估变体的切割效率。按照出现的顺序，图10a分别公开了seqidnos56-57。(10b)通过抗fcelisa检测与变体结合的预先存在的aha。图10b公开了seqidno：56。

图11示出了ahaelisa中f(ab’)2和fab分子的滴定曲线。对应于f(ab’)2滴定曲线中间的od450nm(1.15)的稀释度对于f(ab’)2和fab分别为70和14。因此，f(ab’)2具有比igg1fab高5倍的aha反应性。将f(ab’)2，f(ab’)2δp456，fabt225，fabt225l和fabd221包被在孔上。将汇合的人血清的系列稀释液加入孔中，对照孔未包被。在其他4个实验中获得了类似的结果。这里和在图1b和图5d所示的数据是从同一实验中收集的。图以出现顺序分别公开了seqidno21和20。

详细说明

i.定义

本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于fv、fab、fab’、fab’-sh、f(ab’)2；双抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在某些实施方案中，抗体片段是fab分子。在某些实施方案中，抗体片段是f(ab’)2分子。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全部抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似或具有包含如在此定义的fc区的重链的抗体。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从n至c端，每条重链具有可变区(vh)，又称作可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(ch1、ch2、和ch3)。类似地，从n至c端，每条轻链具有可变区(vl)，又称作可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻链(cl)结构域。根据其恒定结构域氨基酸序列，抗体轻链可归入称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两种类型中的一种。

本文的术语“fc区”用来定义免疫球蛋白重链的c端区域，其包含至少部分恒定区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。除非本文另外指明，否则fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据按照kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，1991中所述的eu编号系统，也称为eu索引。

“fc受体”或“fcr”描述与抗体的fc区结合的受体。fcγrii受体包括具有主要在其胞质结构域不同的相似氨基酸序列的fcγriia(“活化受体”)和fcγriib(“抑制受体”)。活化受体fcγriia在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。抑制受体fcγriib在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)。(参见例如annu.rev.immunol.15：203-234(1997))。例如，在ravetch和kinet，annu.rev.immunol9：457-92(1991)；capel等人，immunomethods4：25-34(1994)；和dehaas等人，j.lab.clin.med.126：330-41(1995)中综述了fcr。其他fcr，包括将来鉴定的fcr，由本文的术语“fcr”涵盖。

术语“fc受体”或“fcr”还包括负责将母体igg转移至胎儿(guyer等人，j.immunol.117：587(1976)和kim等人j.immunol.24：249(1994))和调节免疫球蛋白稳态的新生儿受体fcrn。测量与fcrn结合的方法是已知的(参见例如ghetie和ward，immunol.today18(12)：592-598(1997)；ghetie等人，naturebiotechnology，15(7)：637-640(1997)；hinton等人，j.biol.chem.279(8)：6213-6216(2004)；wo2004/92219(hinton等人)。

可以在例如表达人fcrn的转基因小鼠或转染的人细胞系中或在施用了具有变体fc区的多肽的灵长类动物中测定与人fcrn的体内结合以及高亲和力结合多肽的人fcrn的血清半寿期。wo2000/042072(presta)描述了具有改善的或减弱的与fcr的结合的抗体变体。另见例如shields等人j.biol.chem.9(2)：6591-6604(2001)。

“效应子功能”是指归因于抗体fc区的那些生物学活性，其随着抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬；细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调；和b细胞活化。

“铰链区”通常定义为延伸自人igg1的216-238(eu编号)或226-251(kabat编号)。铰链可以进一步分成三个不同的区域，上、中间(例如，核心)和下铰链。参见例如brezski和georgiou，curr.opin.immunol.40，62-69(2016)，其全部内容通过引用并入本文作为参考。在某些实施方案中，人igg1抗体的铰链区通常定义如下：

上铰链包含具有序列epkscdktht(seqidno：22)的氨基酸。在某些实施方案中，上铰链包含位置216-225(eu编号)或226-238(kabat编号)的氨基酸。

中间(例如核心)铰链包含具有序列cppc(seqidno：23)的氨基酸。在某些实施方案中，核心铰链包含位置226-229(eu编号)或239-242(kabat编号)的氨基酸。

下铰链包含具有序列papellggp(seqidno：24)的氨基酸。在某些实施方案中，下铰链包含位置230-238(eu编号)或243-251(kabat编号)的氨基酸。

抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类别的抗体：iga，igd，ige，igg和igm，其中几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。

“分离的”抗体或抗体片段是与其天然环境的组分分离的抗体或抗体片段。通过例如电泳(例如sds-page，等电聚焦(ief)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相hplc等)测定，抗体或抗体片段可纯化至大于95％或99％的纯度)。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如flatman等人，j.chromatogr.b848：79-87(2007)。

关于参照多肽序列的“百分(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序align-2产生的。align-2序列比较计算机程序由genentech，inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(uscopyrightoffice，washingtond.c.，20559)，其中其以美国版权注册号txu510087注册。公众自genentech，inc.，southsanfrancisco，california可获得align-2程序，或者可以从源代码编译。align2程序应当编译成在unix操作系统，包括数码unixv4.0d上使用。所有序列比较参数由align-2程序设定且不变。

在采用align-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列a相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列b的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下计算:

100乘分数x/y

其中x是由序列比对程序align-2在该程序的a和b比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中y是b中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列a的长度与氨基酸序列b的长度不相等，则a相对于b的％氨基酸序列同一性将不等于b相对于a的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用align-2计算机程序获得的。

“分离的”核酸是指已从其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有该核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及整合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中被称为“表达载体”。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞完全相同，或可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

如本文所用，“治疗”(及其语法变体，诸如“治疗(动词)”或“治疗(动名词)”)是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以进行用于预防或在临床病理学病程期间。治疗的理想效果包括但不限于：预防疾病的发生或复发，症状的减轻，疾病的任何直接或间接病理学后果的减少，预防转移，降低疾病进展速度，改善或缓解疾病状态，缓解或改善预后。在某些实施方案中，本公开的抗体片段用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

药剂(例如本文公开的抗体片段)或包含药剂的药物制剂的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。

术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于涉及此类治疗产品使用的适应症，用法，剂量，给药，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。

术语“药物制剂”是指这样一种制剂，其形式允许其中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的额外的组分的制剂。

“可药用载体”是指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。

如本文所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于:放射性同位素(例如at²¹¹、i¹³¹、i¹²⁵、y⁹⁰、re¹⁸⁶、re¹⁸⁸、sm¹⁵³、bi²¹²、p³²、pb²¹²和lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)c、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

如本文所使用的，术语“约”或“近似”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或3个以上的标准偏差内。备选地，“约”可以表示给定值的至多20％，优选至多10％，更优选至多5％，还更优选至多1％的范围。备选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以指数值的一个数量级以内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。

ii.组合物和方法

在某些实施方案中，本公开部分基于工程化抗体片段的方法，以避免预先存在的抗铰链抗体(aha)。在某些实施方案中，提供了对aha具有降低的或没有反应性的抗体片段(例如fab和f(ab’)2)以及制备这些抗体片段的方法。在某些实施方案中，本公开内容的抗体片段可通过使药物治疗后的免疫反应最小化而在治疗设定中提供优越的安全性。

a.示例性抗体片段

在某些实施方案中，本公开提供对aha具有降低的反应性或不具有反应性的抗体片段(例如fab，fab'和f(ab’)2)以及包含其的组合物。例如，但不作为限制，本文公开的抗体片段表现出相对于参考抗体片段，例如具有天然铰链区的抗体片段，aha反应性降低了至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％。在某些实施方案中，参考抗体片段是具有天然铰链区的igg1抗体片段。

在某些实施方案中，本公开的分离的抗体片段和包含其的组合物表现出对fcγriiia和/或c1q降低的结合和/或不结合。例如但不作为限制，本公开的抗体片段表现出相对于参考抗体片段，例如具有天然铰链区的抗体片段，与fcγriiia和/或c1q的结合减少至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％。在某些实施方案中，参考抗体片段是具有天然铰链区的igg1抗体片段。

在某些实施方案中，在本文所述方法的背景下使用的抗体片段包含天然铰链区或修饰的铰链区。例如但不作为限制，本公开的抗体片段可以是包含天然铰链区或修饰的铰链区的fab片段。在某些实施方案中，本公开的抗体片段是包含天然铰链区或修饰的铰链区的f(ab’)2。

天然铰链区是通常与抗体分子的ch1结构域缔合的铰链区。在某些实施方案中，目前公开的抗体片段的天然铰链区可以属于igg1，igg2，igg3或igg4同种型。例如但不作为限制，fab片段可以是igg1，igg2，igg3或igg4同种型。在某些实施方案中，抗体片段(例如fab片段)是包含天然铰链区的igg2同种型。在某些实施方案中，抗体片段(例如fab片段)是包含天然铰链区的igg4同种型。

修饰的铰链区是长度和/或组成与天然铰链区不同的任何铰链。这类铰链可以包括来自其他物种的铰链区，例如人，小鼠，大鼠，兔，猪，仓鼠，骆驼，美洲驼或山羊铰链区。其他修饰的铰链区可以包含衍生自与ch1结构域不同类别或亚类的抗体的完整铰链区。因此，例如，γ1类的ch1结构域可以连接到γ4类的铰链区。备选地，修饰的铰链区可以包含部分天然铰链或重复单元，其中重复中的每个单元衍生自天然铰链区。

在某些实施方案中，通过取代，删除和/或添加一个或多个氨基酸残基以产生修饰的铰链区来改变天然铰链区。在某些实施方案中，fab片段是包含修饰的铰链区的igg1同种型。在某些实施方案中，fab片段是包含修饰的铰链区的igg2同种型。在某些实施方案中，fab片段是包含修饰的铰链区的igg4同种型。

在某些实施方案中，修饰的铰链区包含上铰链区内的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。例如但不作为限制，所公开的主题的修饰的铰链区可以具有在氨基酸位置eu216-225处的一个或多个取代、缺失和/或添加。备选地或额外地，修饰的铰链区包含下铰链区内的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。在某些实施方案中，所公开的主题的修饰的铰链区可以具有在氨基酸位置eu230-238处的一个或多个取代、缺失和/或添加。备选地或额外地，修饰的铰链区可以包含在氨基酸位置eu238的c端的一个或多个氨基酸添加。在某些实施方案中，修饰的铰链区包含在中间(例如核心)铰链区内的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。例如但不作为限制，所公开的主题的修饰的铰链区可以具有在氨基酸位置eu226-229处的一个或多个取代、缺失和/或添加。

在某些实施方案中，修饰或改变是一个或多个，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个或者六个或更多个氨基酸残基的取代。在某些实施方案中，可以在上铰链区、中间铰链区和/或下铰链区内产生取代。在某些实施方案中，在位置225处的氨基酸残基可以被取代。例如但不作为限制，在位置225处的氨基酸残基可以被改变为除苏氨酸(t)以外的任何氨基酸。在某些实施方案中，根据eu编号，在位置225处的氨基酸例如苏氨酸可以变成亮氨酸(l)，例如t225l。在某些实施方案中，本公开的抗体片段是包含取代t225l的fab片段。

在某些实施方案中，igg1抗体片段的上铰链区可以被存在于igg2和/或igg4抗体的上铰链区内的一个或多个氨基酸残基取代，因为例如igg2和igg4抗体的上铰链区对aha表现出降低的或没有反应性(参见例如图1)。例如但不作为限制，igg1抗体片段的上铰链区可以被存在于igg2和/或igg4抗体天然铰链区内的一个或多个氨基酸残基取代(见图6)。在某些实施方案中，igg1抗体片段的修饰的铰链区保留在氨基酸位置eu220处的半胱氨酸(例如，与igg1抗体的天然铰链区相比)。在某些实施方案中，igg1抗体片段的修饰的铰链区不保留例如在igg抗体片段的氨基酸位置eu220处的半胱氨酸，在那里igg1抗体片段的上铰链区被igg4的上铰链区(例如，整个上铰链区)替换。在某些实施方案中，igg1抗体片段的上铰链区可以被存在于igg2，igg3和/或igg4抗体的上铰链区内的一个或多个氨基酸残基取代，其中在igg1抗体的位置131处的氨基酸残基从丝氨酸(s)改变为半胱氨酸(c)，即s131c。

在某些实施方案中，本公开的抗体片段(例如fab，f(ab’)2或fab')可以包含在氨基酸位置eu235-236处的取代。例如但不限于，在位置236处的氨基酸，例如甘氨酸(g)，可以改变为丙氨酸(a)，例如g236a。在某些实施方案中，根据eu编号，抗体片段例如f(ab’)2可以包含在位置235处的取代。在某些实施方案中，在位置235处的氨基酸例如亮氨酸(l)可以改变为缬氨酸(v)，例如l235v，改变为异亮氨酸(i)，例如l235i或改变为甲硫氨酸(m)例如l235m。

在某些实施方案中，修饰或改变是一个或多个，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个或者六个或更多个氨基酸残基的缺失。在某些实施方案中，可以在上铰链区、中间铰链区和/或下铰链区内产生一个或多个缺失。在某些实施方案中，本公开的抗体片段(例如fab，f(ab’)2或fab')包含经修饰的铰链区，其具有在位置eu230-238处的一个或多个氨基酸的一个或多个缺失。在某些实施方案中，抗体片段包含在位置eu231处的缺失。在某些实施方案中，抗体片段包含在位置eu231和eu232处的缺失。在某些实施方案中，抗体片段包含在位置eu231，eu232和eu233处的缺失。在某些实施方案中，抗体片段包含在位置eu231，eu232，eu233和eu234处的缺失。在某些实施方案中，抗体片段包含在位置eu230，eu231，eu232，eu233和eu234处的缺失。

在某些实施方案中，本公开的抗体片段包含一个或多个，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个或者六个或更多个氨基酸的c端缺失。在某些实施方案中，本发明的抗体片段包含在上铰链区中的一个或多个氨基酸的缺失，例如以产生c端截短。在某些实施方案中，可以缺失在位置eu222-225的一个或多个氨基酸以获得c端截短。在某些实施方案中，本文公开的抗体片段(例如fab片段)包含c端截短。例如但不作为限制，本文公开的抗体片段(例如fab片段)的c端在氨基酸残基d221(根据eu编号)处终止。在某些实施方案中，本文公开的抗体片段(例如fab片段)的c端在氨基酸残基k222(根据eu编号)处终止。

在某些实施方案中，本文公开的抗体片段(例如fab片段)的重链的c端终止于具有选自cdktht(seqidno：14)，cdkthl(seqidno：15)，cdkth(seqidno：16)，cdkt(seqidno：17)，cdk和cd的序列的氨基酸。在某些实施方案中，fab片段的重链的c端终止于氨基酸序列cdkthx(seqidno：25)，其中x是除t之外的任何氨基酸。在某些实施方案中，fab片段包含选自“cdktht”(seqidno:14)，“cdkthl”(seqidno:15)，“cdkth”(seqidno:16)，“cdkt”(seqidno:17)，“cdk”或“cd”的重链恒定区，如在表1中公开的。在某些实施方案中，本公开的主题提供了包含重链恒定区的抗体片段，例如fab片段，所述重链恒定区包含如seqidno：1，2，3，4，5或6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的抗体片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含seqidno：5中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的抗体片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含seqidno：6中所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，作为c端截短和/或突变的替代，为了避免预先存在的aha反应，可以使用igg2或igg4fab片段。例如但不作为限制，本公开的抗体片段可包含重链恒定区，所述重链恒定区包含seqidno：7或8中的氨基酸序列。在某些实施方案中，igg2或igg4fab片段可以包含一个或多个，两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个或者五个或更多个氨基酸的c端缺失。在某些实施方案中，本公开的fab是包含以序列verk(seqidno：26)终止的重链恒定区的igg2fab片段。在某些实施方案中，本文公开的抗体片段(例如igg4fab片段)的重链的c端终止于具有选自以下的序列的氨基酸：kygpp(seqidno：18)，kygp(seqidno：19)，kyg，ky和k。在一些实施方案中，本公开的fab是包含选自“kygpp”(seqidno：18)，“kygp”(seqidno：19)，“kyg”，“ky”和“k”的重链恒定区的igg4fab片段，如表1中公开的。例如但不作为限制，本公开的抗体片段可以包含重链恒定区，所述重链恒定区包含如seqidno：9，10，11，12或13所示的氨基酸序列。

表1-fab重链序列

本公开还提供了包含本文公开的序列的保守修饰的抗体片段。例如但不作为限制，本公开提供了包含重链恒定区的抗体片段，所述重链恒定区包含seqidno：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13所示的氨基酸序列或其保守修饰，并且其中所述抗体片段保留本文公开的抗体片段的期望特性。例如但不作为限制，如上所述，此类抗体片段对aha具有降低的或没有反应性。

如本文所用，术语“保守序列修饰”旨在指不显著影响含有氨基酸序列的抗体片段的特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸取代，添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和pcr介导的诱变，将修饰引入本公开的抗体片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。表2中示出了示例性的保守氨基酸取代。

在某些实施方案中，本文公开的序列可以具有多达约一个，多达约两个，多达约三个，多达约四个，多达约五个，多达约六个，多达约七个，多达约八个，多达约九个或多达约十个被修饰和/或取代的氨基酸残基。

氨基酸可根据共同的侧链性质进行分组：

i.疏水性的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；

ii.中性亲水的：cys，ser，thr，asn，gln；

iii.酸性的：asp，glu；

iv.碱性的：his，lys，arg；

v.影响链取向的残基：gly，pro；

vi.芳香族的：trp，tyr，phe。

在某些实施方案中，非保守性替代可能需要将这些类别之一的成员交换为另一类别的。

表2

本公开的其他修饰铰链区可以是完全合成的并且可以被设计成具有期望的性质，例如长度，组成和柔韧性。例如但不作为限制，可以改变本公开的修饰的铰链区以增加或降低铰链区的柔性。例如但不作为限制，可以增加铰链区柔性的修饰包括但不限于一个或多个氨基酸残基被一个或多个增加柔性的氨基酸残基(例如，甘氨酸)取代。在某些实施方案中，可减小铰链区柔性的修饰包括但不限于用一个或多个减小氨基酸残基刚性的一个或多个氨基酸残基(例如脯氨酸)取代。

b.制备抗体片段的方法

在某些实施方案中，抗体片段通过铰链工程技术制备。

在某些实施方案中，用于本文所述方法的抗体片段起始材料可以使用任何合适的酶切割和/或消化技术从任何完整抗体(例如，完整单克隆抗体)获得。在某些实施方案中，抗体片段可以通过用ides切割获得。

在某些实施方案中，通过蛋白水解消化或重组表达产生fab分子。蛋白水解消化是fab生产的最初方法(6)。通过蛋白水解消化产生的fab分子导致由蛋白酶切割位点定义的fab重链的c端序列。进而，fab分子通常包含抗体上铰链的一部分。抗体的该上铰链区充当fab和fc区之间的接头，但在fab分子中不具有结构或功能作用。它可以被认为是一种非结构化的附件(见图1a)，因为它通常在fab分子的晶体结构中不能完全分辨。一种针对血小板表面受体gpiib/iiia的治疗性fab分子(阿昔单抗，)通过蛋白水解切割而商业化生产。

随着分子克隆的进步，抗体片段的重组表达是产生fab分子的有吸引力的途径(7)。与作为生产途径的蛋白水解消化不同，fab分子的重组表达提供了限定包含的上铰链区长度的灵活性。在某些实施方案中，通过重组表达产生fab片段。

抗体的高亲和力通常通过二价靶标接合实现，从而促进亲合力。相反，fab的目标接合是单价的。这通常导致与全长igg相比较低的靶亲和性。通过连接两个fab片段来产生f(ab’)2，亲合力可以恢复，同时保留fab的关键性质，如血清半寿期短。另外，双特异性抗体靶向的多种疾病介质对于治疗性抗体的开发已变得越来越重要(8)。f(ab’)2分子可以提供天然支架以产生小双特异性抗体片段。与fab分子的产生相反，f(ab’)2的重组表达不是天然可能的，因为表达的fab'分子需要非天然的同源或异源二聚体结构域作为融合物(9，10)。因此，有两种主要方法产生f(ab’)2分子：(i)化学缀合和(ii)蛋白水解消化。对于化学缀合，重组产生的fab'分子通过同型或异型双功能交联剂偶联(3，9，11，12)。类似于产生fab分子的蛋白水解消化方法，许多已知的蛋白酶可以切割下铰链区中的完整抗体以产生f(ab’)2分子(13)。这种蛋白水解消化产生非常稳定的f(ab’)2分子，其中两个fab分子通过核心铰链的两个二硫键连接。胃蛋白酶最广泛使用的(14)，但是最近已经描述了化脓性链球菌ides的高度特异性igg降解酶(15，16)。ides的使用通过消除从胃蛋白酶消化观察到的c端异质性产生高度同质的产物(3)。在某些实施方案中，f(ab’)2片段由ides切割产生。

c.重组方法和组合物

可以使用重组方法和组合物，例如，如描述于美国专利号4,816,567来生成抗体片段。在某些实施方案中，提供了编码本文中所述的抗体片段的分离的核酸或包含此类核酸的组合物。此外，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。还提供了包含此类核酸的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴样细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。在某些实施方案中，提供了制备fab分子的方法，其中该方法包括在适合于表达fab的条件下培养包含编码fab的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并且任选地，从宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收fab。

对于fab的重组生成，将编码fab的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码fab的重链和轻链的基因)。

适合于克隆或表达fab编码载体的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成fab。对于抗体片段如fab在细菌中的表达，见例如美国专利no.5,648,237，5,789,199和5,840,523(还参见charlton,methodsinmolecularbiology，第248卷(b.k.c.lo编，humanapress,totowa,nj,2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以将fab自细菌细胞团糊分离在可溶性级分中，并可以进一步纯化。

在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于fab编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株。参见gerngross,nat.biotech.22:1409-1414(2004)，及li等人，nat.biotech.24:210-215(2006)。

适合于表达糖基化蛋白的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(spodopterafrugiperda)细胞。

也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利no.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生成抗体的plantibodies^tm技术)。

也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经sv40转化的猴肾cvl系(cos-7)；人胚肾系(293或293细胞，如描述于例如graham等人，j.genvirol.36:59(1977)的)；幼年仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(tm4细胞，如描述于例如mather,biol.reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(ver0-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；牛鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳房肿瘤(mmt060562)；tri细胞，如描述于例如mather等人，annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982)；mrc5细胞；和fs4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr^－cho细胞(urlaub等人，proc.natl.acad.sci.usa77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如y0、ns0和sp2/0。关于适合于fab生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如yazaki和wu,methodsinmolecularbiology，第248卷(b.k.c.lo编，humanapress,totowa,nj)，第255-268页(2003)。

d.药物制剂

如本文所述的抗体片段(例如fab和f(ab’)2)的药物制剂通过将具有期望纯度的此类抗体片段与一种或多种任选的可药用载体混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备(remington'spharmaceuticalsciences第16版，osol，a.编(1980))。例如，但不作为限制，冻干抗体制剂在美国专利号6,267,958中描述。在某些实施方案中，水性抗体制剂可以包括美国专利号6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，后者制剂包括组氨酸乙酸盐缓冲剂。

在某些实施方案中，本公开的抗体片段可以具有大于约80％，大于约90％，大于约91％，大于约92％，大于约93％，大于约94，大于约95％，大于约96％，大于约97％，大于约98％，大于约99％，大于约99.1％，大于约99.2％，大于约99.3％，大于约99.4％，大于约99.5％，大于约99.6％，大于约99.7％，大于约99.8％或大于约99.9％的纯度。

可药用载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲双铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(peg)。本文中示例性的可药用载体进一步包括中间药物分散剂例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuph20(baxterinternational，inc.)。美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20。在一个方面，shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

本文中的制剂还可以含有针对治疗的特定适应症所需的多于一种活性成分，优选具有互补活性的那些活性成分，它们不会相互不利地影响。这些活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。

本公开的组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。施用的途径和/或模式根据期望的结果而改变。活性化合物可以用保护化合物免于快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入物，透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备此类制剂的方法由例如sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems，j.r.robinson编，marceldekker，inc.，newyork，1978描述。在某些实施方案中，药物组合物在美国食品和药物管理局的goodmanufacturingpractice(gmp)条件下制造。

所述载体可以适用于静脉内，肌肉内，皮下，肠胃外，脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于给药途径，可以将活性化合物即抗体片段包衣在材料中以保护化合物免于可使化合物失活的酸和其它天然条件的作用。

活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中，在胶体药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液(macroemulsions)中。这些技术公开于remington'spharmaceuticalsciences第16版，osol，a.编(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。

待用于体内给药的制剂通常是无菌的。无菌性可以容易地完成，例如通过无菌过滤膜过滤。

本公开的药物组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。可以通过上文的灭菌程序以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等)来确保预防微生物的存在。将等渗剂如糖，氯化钠等包含在组合物中也是期望的。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。

在某些实施方案中，当本发明的抗体作为药物给药人和动物时，它们可以单独给药或作为药物组合物给药，其含有例如约0.01％至约99.5％(或约0.1至约90％)的抗体片段与可药用载体组合。

e.治疗方法和组合物

本文提供的任何抗体片段可以用于治疗方法中。在某些实施方案中，提供了用作药物的抗体片段。在某些实施方案中，提供了用于治疗特定疾病适应症的抗体片段。在某些实施方案中，本公开的抗体片段可以用于治疗眼部疾病和/或病症。在某些实施方案中，本公开的抗体片段可以用于治疗将受益于显示短的全身半寿期的抗体片段的应用的疾病和/或病症。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法中的抗体片段。

在某些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有特定疾病的个体的方法中的抗体片段，所述方法包括向个体施用有效量的抗体片段或包含其的组合物。在某些实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。在某些实施方案中，本公开提供了用于抑制特定分子途径和/或机制的抗体片段。在某些实施方案中，本公开提供了用于抑制个体中的特定分子途径和/或机制的方法的抗体片段，其包括向个体施用有效的抗体片段以抑制特定的分子途径和/或机制。在某些实施方案中，本公开提供了用于激活特定分子途径和/或机制的抗体片段。在某些实施方案中，本公开提供了用于激活个体中特定分子途径和/或机制的方法中的抗体片段，其包括向个体施用有效的抗体片段以抑制特定的分子途径和/或机制。根据任何上述实施方案的”个体”可以是人。

在某些实施方案中，本公开提供了抗体片段在制造或制备药物中的用途。在某些实施方案中，该药物用于治疗特定疾病。在某些实施方案中，该药物用于治疗特定疾病的方法中，所述方法包括向患有所述疾病的个体施用有效量的所述药物。在某些实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。在某些实施方案中，该药物用于抑制或激活特定的分子途径和/或机制。在某些实施方案中，该药物用于抑制或激活个体中的特定分子途径和/或机制的方法中，包括向个体施用有效量的药物以抑制特定分子途径和/或机制。根据任何上述实施方案的”个体”可以是人。

在某些实施方案中，本公开提供了治疗特定疾病的方法。在某些实施方案中，该方法包括向患有此类疾病的个体施用有效量的抗体片段。在某些实施方案中，该方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。根据任何上述实施方案的”个体”可以是人。

在某些实施方案中，本公开提供了用于抑制个体中的特定分子途径和/或机制的方法。在某些实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的抗体片段以抑制特定分子途径和/或机制。在某些实施方案中，“个体”是人。

在某些实施方案中，本公开提供了包含本文提供的任何抗体片段的药物制剂，例如用于任何上述治疗方法。在某些实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗体片段和可药用载体。在某些实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗体片段和至少一种另外的治疗剂，例如如下所述。

本公开的抗体片段可以单独使用或与其他药剂组合用于治疗。例如，本公开的抗体片段可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。

上面提出的这类组合疗法涵盖联合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)和分开给药，在这种情况下，本公开的抗体的给药可以在施用另外的治疗剂或多种治疗剂之前、同时和/或之后发生。在某些实施方案中，抗体片段的施用和另外的治疗剂的施用彼此发生在约一个月内，或约一、二或三周内，或在约一、二、三、四、五或六天内。本文所述的抗体片段也可以与放射疗法联合使用。

抗体片段(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，包括肠胃外，肺内，眼内和鼻内，并且如果期望用于局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内，静脉内，动脉内，眼内，腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如，通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于给药是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次给药，推注(bolus)给药和脉冲输注。

抗体片段按照良好的医疗实践配制、开具剂量和施用。在本上下文中考虑的因素包括被治疗的具体疾病，被治疗的具体哺乳动物，个体患者的临床状况，疾病的原因，药剂的递送部位，给药方法，给药方案以及医师已知的其他因素。抗体片段不一定是，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述疾病的药剂一起配制。这些其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体片段的量，疾病或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或者以本文所述的剂量的约1％至99％使用，或者以通过经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，本公开的抗体片段(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型，抗体片段的类型，疾病的严重程度和病程，施用抗体片段是用于预防或还是治疗目的，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体片段的反应，以及主治医师的判断。抗体片段一次或通过一系列治疗适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体片段可以是用于向患者施用的初始候选剂量，无论是例如，通过一次或多次单独的给药，或通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病况，通常将持续治疗直至发生疾病症状的所需抑制。抗体片段的一个示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这类剂量可以间歇给药，例如，每周或每三周给药(例如，由此使患者接受约2至约20次，或例如约6次剂量的抗体片段)。可以施用初始较高负荷剂量，然后施用一次或多次较低剂量。这种疗法的进展很容易通过常规技术和分析进行监控。

应理解的是，代替本发明的抗体片段或除本发明的抗体片段之外，任一上述制剂或治疗方法可以使用免疫缀合物来进行。

f.免疫偶联

本发明公开的主题还提供免疫缀合物，其包括与一种或多种细胞毒性剂例如化学治疗剂或药物，生长抑制剂，蛋白质，肽，毒素(例如细菌，真菌，植物或动物来源的蛋白质毒素，酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素缀合的本文公开的抗体片段。例如，所公开主题的抗体片段可以与一种或多种其他结合分子例如另一种抗体，抗体片段，肽或结合模拟物功能性连接(例如，通过化学偶联，基因融合，非共价结合或其他方式)。

在某些实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(adc)，其中抗体片段与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见美国专利no.5,208,020、no.5,416,064和欧洲专利ep0425235b1)；奥瑞司他汀(auristatin)诸如单甲基奥瑞司他汀药物部分de和df(mmae和mmaf)(参见美国专利no.5,635,483和no.5,780,588,及νο.7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利no.5,712,374、no.5,714,586、no.5,739,116、no.5,767,285、no.5,770,701、no.5,770,710、no.5,773,001和no.5,877,296；hinman等人，cancerres.53:3336-3342(1993)；及lode等人，cancerres.58:2925-2928(1998))；蒽环类诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见kratz等人，currentmed.chem.13:477-523(2006)；jeffrey等人，bioorganic&med.chem.letters16:358-362(2006)；torgov等人，bioconj.chem.16:717-721(2005)；nagy等人，proc.natl.acad.sci.usa97:829-834(2000)；dubowchik等人，bioorg.&med.chem.letters12:1529-1532(2002)；king等人，j.med.chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利no.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷类(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他赛(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端抱菌素(trichothecene)；和cc1065。

在某些实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体片段，该抗体片段与酶活性毒素或其片段缀合，包括但不限于白喉毒素a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)a链、相思豆毒蛋白(abrin)a链、蒴莲根蛋白(modeccin)a链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(aleuritesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、美洲商陆(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酸霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端抱菌素(tricothecenes)。

在某些实施方案中，免疫缀合物包含本文所述的抗体片段，该抗体片段与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。非限制性实例包括at²¹¹，i¹³¹，i¹²⁵，y⁹⁰，re¹⁸⁶，re¹⁸⁸，sm¹⁵³，bi²¹²，p³²，pb²¹²和lu的放射性同位素。在将放射缀合物用于检测时，它可以包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或i¹²³或自旋标记物用于核磁共振(nmr)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氣-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体片段和细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白质偶联剂诸如n-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(stop)、琥珀酰亚氨基-4-(n-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)、亚氨基硫烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如vitetta等人，science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见w094/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的"可切割接头"。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(chari等人，cancerres.52:127-131(1992)；美国专利no.5,208,020)。上文公开了接头的非限制性例子。

本文公开的免疫缀合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，所述交联剂包括但不限于：商品化(如购自piercebiotechnologyinc.,rockford,il,u.s.a)的bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc、和磺基-smpb、和svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。

g.制造物

在本公开的某些实施方案中，提供了含有上文所述可用于治疗、预防和/或诊断病症的材料的制造物。所述制造物包括容器和所述容器上或与所述容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、管形小瓶、注射器、iv溶液袋等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有独自或与另一组合物组合有效治疗、预防和/或诊断所述疾患的组合物，而且可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是本公开的抗体片段。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗选择的疾患。此外，制造物可包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本公开的抗体片段；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本公开的该实施方案中的制造物可以进一步包含指示组合物可用于治疗特定病症的包装说明书。备选地或额外地，制造物还可以包含第二(或第三)容器，其包含可药用缓冲液，例如注射用抑菌水(bwfi)，磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液，稀释剂，过滤器，针头和注射器。

应理解的是，上述任何制造物可以包括代替本文所述抗体片段的免疫缀合物，或除了抗体片段之外还包括免疫缀合物。

iii.实施例

以下是本公开的方法和组合物的实施例。应该理解，在给出上面提供的一般描述的情况下，可以实践多种其他实施方案。

实施例1-通过铰链工程避免预先存在的抗铰链抗体反应

fab和f(ab’)2抗体片段用作治疗和免疫测定中全长抗体的替代形式。它们提供了体积小、血清半寿期短以及缺乏效应子功能的优点。已知与侵入性疾病相关的几种蛋白酶在铰链区切割抗体并导致针对新表位的抗铰链抗体(aha)。血清中预先存在的aha可以作为替代fc并重新引入缺乏抗体片段的fc的性质。虽然在与疾病作斗争的自然过程期间希望有这种反应，但治疗性抗体片段通常是不想要的。在该研究中，鉴定了通过ides蛋白酶维持有效蛋白水解切割的抗体的下铰链区中的截短。在f(ab’)2c端产生的新表位不具有可检测的预先存在的aha，提供了一种实际的途径以在不希望有预先存在的aha应答时通过蛋白水解消化在体外产生f(ab’)2。在该研究中，还研究了抗体的上铰链区，其提供了人igg1、igg2和igg4的上铰链的c端残基对人血清中预先存在的aha反应性的贡献的详细分析。尽管没有观察到针对igg2和igg4同种型的fab的预先存在的抗体，但是观察到对人igg1的上铰链的大部分残基的显著应答。t225l突变(在本文中也称为“t225l变体”)和天然c端d221被鉴定为具有最小血清反应性的解决方案。该研究使得能够产生fab和f(ab’)2片段用于对预先存在的aha具有最小反应性的治疗和免疫测定法。

材料和方法

质粒构建和抗体表达：如前所述，通过标准分子生物学技术将抗体克隆到大肠杆菌表达载体(9，23)或哺乳动物表达载体(24)中。大肠杆菌表达按照simmons等人(23)所述进行。如先前所述，在cho(25)或hek293t(26)细胞的30ml瞬时转染培养物中表达igg和fab。

ides的克隆、表达和纯化：ides被表达为n端谷胱甘肽s-转移酶(gst)融合蛋白。来自酿脓链球菌mgas1882(uniprotidh8hdr0)的ides的成熟序列经密码子优化用于大肠杆菌表达并由geneart^tm合成并通过标准分子生物学技术克隆到大肠杆菌表达载体中(23)。ides使用simmons等人描述的条件(23)表达并使用谷胱甘肽琼脂糖(gsh)柱纯化。将来自gsh柱的50mmtris-hcl，ph8.0，20mm谷胱甘肽中的洗脱级分浓缩并加载到s200柱上并用200mmk2hpo4，ph6.2，250mmkcl洗脱。

抗体和fab纯化：表达后，细胞通过重力沉淀。将上清液转移到50mlfalcon管(corning，corning，ny，usa)中。将400μl的50％mabselectsure^tm蛋白亲和浆液或gammabind^tmplus浆液(gehealthcare，pittsburgh，pa，usa)分别加入到上清液中，用于igg和fab纯化。将该混合物在室温下在innova2000平台摇床(newbrunswickscientific，enfield，ct，usa)上温育过夜。除去上清液，并将树脂转移到具有25μm尺寸膜(thompsoninstrument，oceanside，ca，usa)的96孔2ml滤板中。使用sorvall^tmht6离心机(thermoscientific，waltham，ma，usa)以1120×g离心5分钟，用1ml1xpbsph7.4洗涤树脂3次。对于fab纯化，在洗脱前用0.2×pbsph5.0进一步洗涤树脂。使用50mm磷酸ph2.9洗脱igg，并通过以1000xg离心5分钟，用20xpbsph11.0中和洗脱物。使用10mm柠檬酸钠ph2.9洗脱fab片段并用0.3mtrisph9.0中和。使用sorvallht6离心机(thermoscientific，waltham，ma，usa)以1,000xg离心5分钟，通过0.2μm96孔过滤板(orochem，naperville，il，usa)过滤洗脱的igg和fab。

ides消化igg铰链变体：在37℃以1mg/ml的igg与所述的ides：igg比率(w/w)温育24小时。为了扩大消化以产生用于aha测定法的大量高纯度f(ab’)2物质，使用高达1:10的ides：igg比率驱动完全消化。

用ides进行igg切割后的f(ab’)2纯化：将ides切割的样品用25mm乙酸钠，ph4.4(缓冲液a)稀释并以150cm/hr(0.7cm直径，10cm床高)上样至在缓冲液a中平衡的1mlspsepharosehighperformance强阳离子交换柱(gehealthcare，pittsburgh，pa，usa)中。使用缓冲液a将柱洗涤至基线，并在30个柱体积使用从0至0.5mnacl线性盐梯度洗脱f(ab’)2。通过加入3mtrisph9.0中和洗脱液以将ph调至7.0，并通过0.22μm(emdmillipore，billerica，ma，usa)过滤。在用缓冲液a稀释以降低电导率<5ms/cm后，在monos5/50gl强阳离子交换柱(gehealthcare，pittsburgh，pa，usa)上进一步纯化sp洗脱的f(ab’)2。用缓冲液a将柱洗涤至基线(<0.05mau)，并使用0至0.6mnacl的盐梯度在40个柱体积上洗脱f(ab’)2。用3mtrisph9.0中和洗脱的f(ab’)2溶液以将ph调节至7.0并通过0.22μm(emdmillipore，billerica，ma，usa)过滤。

fab和f(ab’)2片段的质谱：使用agilent6224toflc-ms系统(agilenttechnology，santaclara，ca，usa)获得质谱数据。用100mm二硫苏糖醇在37℃还原f(ab’)220分钟。用plrp-s反相柱(agilenttechnologies，santaclara，ca，usa)分离多肽链。使用masshunter软件(定性分析b.03.01)通过maximunentropydeconvolution获得完整质量的经还原轻链和重链。

通过毛细管电泳分析蛋白质：通过将5μl样品体积与7μl的ht蛋白质express样品缓冲液混合来制备所有样品，并在70℃温育5分钟。向样品中加入32μl水并以1,000xg离心5分钟。根据labchipgxii用户指南中提供的制造商说明书制备芯片，并且样品在calipergxii微流体系统(biotechnology，waltham，ma，usa)上分析。样品在calipergxii微流体系统(biotechnology，waltham，ma，usa)上分析。所有试剂都获自

预先存在的抗铰链抗体酶联免疫吸附测定法(elisa)：用1μg/mlf(ab’)2或fab在50mm碳酸盐中，ph9.6在4℃过夜包被板(384孔,nunc,thermofisherscientific,rochester,ny,usa)。用0.05％聚山梨酯20的pbs(ph7.4)洗涤平板，然后用0.5％bsa，15ppmproclin的pbs溶液(ph7.4)封闭。在测定缓冲液(0.5％bsa，0.05％聚山梨酯20，15ppmproclin^tm，在pbs中，ph7.4)中系列稀释来自25位女性和25位男性个体的混合人血清(bioreclamationivt，westbury，ny，usa)并添加至板中。温育2小时后，使用在测定缓冲液中的辣根过氧化物酶(hrp)山羊抗f(ab’)2缀合的抗人iggfc(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)，接着是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb，mossinc.，pasadena，md，usa)作为底物检测结合的预先存在的抗铰链抗体。用1m磷酸终止反应，并在450nm读取吸光度。对于图中，使用1:30稀释度时的吸光度读数来显示所有样品。在1:10血清稀释时观察到相似的结果。为了计算相对aha反应性，f(ab’)2的滴定曲线用4参数曲线拟合程序(kaleidagraph，synergsoftware，reading，pa)进行拟合。测定f(ab’)2滴定曲线的midod(顶部和底部od读数的平均od)。计算对应于该midod的fabdktht(seqidno：21)和f(ab’)2的稀释度并将其用于计算相对aha反应性。

sds-page和免疫印迹：对于sds-page，将5μg纯化的f(ab’)2变体和gst-ides与sds-样品缓冲液混合，在95℃加热5分钟，并以16000相对离心力旋转1min。将样品加载到nupage4-12％bistris/mes凝胶(invitrogen)上。对于免疫印迹，将5ng蛋白质样品用于sds-page。将凝胶通过(invitrogen)转移至硝酸纤维素膜上，用抗ides(genovis，usa；目录号a3-af1-010，批号a3af1-7c17h)作为一级抗体进行免疫印迹，并将irdye800cw缀合的驴抗山羊抗体(美国；目录号926-32214，批号b80821-03)作为二级抗体，并用imager(usa)成像。双色蛋白质分子量标记物(usa)用于免疫印迹，并且预染色的plus2(invitrogen，usa)用于考马斯染色的凝胶。

通过差示扫描荧光计的蛋白质稳定性测量：在bioradcfx96touch^tmreal-timesystem(biorad，usa)中以orange染料储备液(molecularprobes^tm，usa)的1:200的最终稀释度测定蛋白质稳定性。将1μl的orange染料储备液加入到24μl的100μg/ml的纯化抗体中。在20-100℃(0.2℃增量，每步骤保持10秒)记录pbs中最终25μl样品的荧光。

结果

fabc端确定对预先存在的aha的反应：最初，用木瓜蛋白酶切割的抗体阿昔单抗(5)研究人血清中针对fab分子上铰链的自身抗体的反应性。木瓜蛋白酶切割在fab上留下c端h224。后来，使用生物素化的肽类似物进行更全面的研究，以剖析上铰链的分别的c端残基的贡献(20)。在该研究中，仅观察到对上铰链残基k222至h224的最小aha反应性。对于具有t225作为c端残基的肽没有观察到信号。合成肽的使用会混淆结果，因为跨越上铰链残基d221至t225的fab-尾(图1a)呈现在完整分子的背景之外。因此，研究了fab-尾在完整fab的设定中对预先存在的aha的结合贡献。

fab分子在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的重组表达允许容易地产生具有定义的c端末端的分子而不需要蛋白水解切割。为了确保c端的完整性，通过完整的质谱证实纯化的fab的正确质量。将fab分子包被在微量滴定板上，并在与汇集的人供体血清温育后，通过抗fc检测对预先存在的aha的结合进行定量。与先前的研究(20)一致，在c端的t223(具有序列dkt，在本文中也被称为“cdkt”(seqidno：17))显示所有上游铰链变体对预先存在的aha的最高反应性(图1b)。在c端具t225(具有序列dktht(seqidno：21)，在本文中也称为“cdktht”(seqidno：14))观察到与先前研究的显著差异。该变体不结合aha作为肽(20)；然而，当测试为fab时，观察到实质的aha反应性。对于在c端具d221(具有序列d，在本文中也称为“cd”)，aha的结合几乎降至背景。因此，在d221处终止fab提供了一种最小化由预先存在的aha的识别，同时维持天然抗体序列的解决方案。

如通过这些实验所证明的，c端fab残基对aha结合具有深远影响。调查了是否通过c端的单个氨基酸变化也可以消除预先存在的抗体的结合，并且提供了d221最小化对aha的反应性的另一种途径。引入t225l变体以在fabc端放置非天然残基，并测试其aha的结合。以前已经描述过t225l变体(7)。突变扰乱了预先存在的aha的结合(图1b)，进一步突出了c端对结合的重要性。为了排除t225l中减少的aha是由于包被效率降低的可能性，使用抗原捕获形式来捕获fab分子，并且还观察到aha信号减少的类似倍数。为了确定这种观察是否可以推广，将三种不同的fab与汇集的人血清一起温育，并通过elisa检测预先存在的抗体的结合。观察到具有dktht(seqidno：21)c端的三种不同fab的显著信号，而确实检测到预先存在的抗体与d221和t225lc端的结合减少。(图1c)。

接下来，研究igg2和igg4同种型的fab分子。尽管通常将igg1、igg2和igg4用于治疗性抗体，但到目前为止尚未利用igg2和igg4fab用于治疗开发。因此，测试了具有完整上铰链区的igg2和igg4fab(图1d；分别为c端k218和p225)。与igg1fab相反，igg2和igg4fab不被预先存在的aha识别。接下来，截短igg4的上铰链。与igg1相比，igg4同种型上铰链的长度更短(参见图6a-b)；然而，由于参与重链轻链的链间二硫键的半胱氨酸位于ch1一级结构的中心，因此在截短实验中能够包括残基k218和y219。这些截短的上铰链fab显示出与完整igg1上铰链相似的信号(图1b)。

相同同种型内的所有fab分子在大肠杆菌和cho中产生相似的表达水平(图7)。在相同的同种型中没有观察到热稳定性的变化(表3)。与igg1同种型相比，igg2和igg4fabs的热稳定性降低了约6℃。

总之，存在对预先存在的aha具有最小反应性的多种fab形式：igg1-d221，igg1-t225l，igg2和igg4。

表3.通过差示扫描荧光计确定的t30mfab的热稳定性

具有igg2下铰链的igg1不能被有效切割：文献(13，27)已经广泛描述了针对f(ab’)2的下铰链区的预先存在的aha。类似于对fab分子的上铰链的aha，这些aha可以用作替代fc或引入检测伪像。因此，阻碍aha结合的f(ab’)2形式的开发是期望的。虽然发现血清中的aha是针对igg1同种型的f(ab’)2，但不可能建立针对igg2同种型的下铰链的自身抗体的存在。有趣的是，这类自身抗体的缺乏与生理相关的人类蛋白酶不能将igg2有效切割成f(ab’)2片段一致(28)。然而，使用ides蛋白酶观察到igg2的低效切割(28)。ides是在g236之后切割的来自酿脓链球菌的igg特异性内切蛋白酶。除了抗体铰链区中的切割位点之外，它还识别fc中有助于其对igg的高特异性的第二个位点(15，16)。igg2抗体的低效切割可能由切割位点外部的外位点(exosite)引起。因此，将igg2的下铰链残基接枝到igg1上以产生igg1-2嵌合体(图2b)。测试了不同ides：igg比率下的切割效率(图2c)。虽然以1：500的ides：igg比率有效切割igg1野生型成f(ab’)2，但为了实现igg1-2嵌合体的相似切割，蛋白酶浓度至少高50倍是必需的。结论是，下铰链序列差异至少部分导致igg2抗体的较差切割效率。因此，igg1-2嵌合体可能不是产生不与预先存在的aha结合的f(ab’)2分子的实用策略。

表征有效的ides切割的p1和p2位置：已用所述fab实验证明预先存在的aha的结合可以通过单个c端t225l突变来阻止。f(ab’)2采用了类似的策略。作为第一步，鉴定了允许由ides蛋白酶切割的p1(eu236)和p2(eu235)位点中的残基。产生了包括用于ides的p2位置处的l235，l235v，l235i或l235m的一组76个fab变体，并与p1中除半胱氨酸外的任何氨基酸组合(图3d和e)。纯化抗体并用ides以1:10的ides：igg比率消化以鉴定可被ides切割的变体。选择这种高蛋白酶与抗体比率来评估蛋白水解，而不考虑切割效率。鉴定被ides切割的七种变体(图3a)。尽管p2位置耐受所有四个测试残基，但只有两个具有非常小侧链的氨基酸：天然甘氨酸和丙氨酸被接受在p1位置。在三种不同的ides：igg比率：1：500，1：200和1：100(图3b)和1:10(图3c)下进一步研究该子集的切割效率。与野生型序列相比，p2位置的变体l235v显示出切割效率的最小改变。所有其他变体的特征在于：仅在铰链一侧的显性单一切割，而留下抗体的另一侧保持完整。虽然在p1位置具有甘氨酸的l235i和l235m变体可以以1：200的ides:igg比率完全切割，但具有p1中丙氨酸的所有p2变体都需要显著更高的蛋白酶量。因此，ides的有效切割需要p1位置的甘氨酸。

c端f(ab’)2变体不阻止被预先存在的aha识别：ides能用假阳性结果混淆预先存在的aha测定法的结果。这可以通过由ides结合血清抗体和它们随后由抗fc检测抗体识别来解释。因此，确保测定法中使用的f(ab’)2分子不含来自前述蛋白水解反应的ides。纯化的f(ab’)2蛋白中的ides的去除通过sds-page，然后考马斯染色和抗ides免疫印迹确认(图4a)。

然后测试纯化的p1和p2f(ab’)2变体对预先存在的aha的识别(图4b)。尽管与野生型相比信号减少，但没有任何具有c端修饰的抗体消除了与血清自身抗体的反应性。对p2位置的改变只有适度的影响。p1位置的g236a变化将信号降低到与fab相当的水平。不受限于特定理论，因此不可能设计具有保留被ides切割的氨基酸变体的下铰链，并且同时消除针对f(ab’)2的预先存在的抗体反应。

下铰链中的缺失在保留ides切割的情况下阻止了被预先存在的aha的识别：采用另一种策略通过截短下铰链来去除aha的表位。留下p1(eu236)和p2(eu235)残基因其切割效率的显著性而未触及，在ides的p3(eu234)，p4(eu233)和p5(eu232)位点产生单残基缺失和双残基缺失以鉴定对切割效率具有最小影响的残基(见图5f)。在p3位置缺失的情况下观察到显著较差的切割效率，因此该位置未被考虑用于进一步的研究(图5a)。测试具有p4、p5缺失和两者组合(δp45；在本文中也称为eu232-233位置处的氨基酸残基缺失)的抗体与aha的结合(图5b)。对于这些变体，观察到比野生型铰链序列更低的信号。为了进一步减少由预先存在的aha的铰链识别，缺失扩展到包括p6(eu231)和p7(eu230)残基(见图5f)。虽然p4到p7位点的缺失(δp4567；在本文中也称为位置eu230-233处的氨基酸残基的缺失)导致切割效率适度降低，但p4到p6位点的缺失(δp456；在本文中也称为eu231-233位的氨基酸残基的缺失)在ides：igg比率为1:200时具有与野生型相当的切割效率(图5c和图8)。两种变体都未导致预先存在的aha识别(图5d)。为确保ides的高切割特异性得以维持，使用esi-tof质谱来分析ides切割的f(ab’)2。对于来自野生型的f(ab’)2以及δp456变体f(ab’)2，仅观察到对应于g236处的预期切割位点的单一质量(图5e)。

如图11所示，观察到的δp456变体f(ab’)2的aha结合信号与两个fabc端变体fabd221和fabt225l相当。对应于f(ab’)2滴定曲线中间的od(1.15)的稀释度对于f(ab’)2和fab分别为70和14。不受限于特定理论，用f(ab’)2与fabt225相比，用f(ab’)2看到的aha活性高5倍可以通过aha与f(ab’)2的潜在二价结合来解释，这表明f(ab’)2分子需要避免预先存在的aha。为了排除在f(ab’)2δp456和fabt225l中看到的降低的aha反应性是由于降低的包被效率的可能性，使用抗原捕获形式来检测aha。在接受f(ab’)2，δp456f(ab’)2，fab，fabt225l和缓冲液1:30的血清稀释的抗原包被孔上，od读数(n＝4)为2.2±0.1，0.34±0.03，1.3±0.1，0.36±0.02和0.32±0.01。因此，这些结果证实与它们相应的野生型分子相比，δp456f(ab’)2和fabt225l具有降低的aha反应性。

这些数据显示δp456变体提供了避免针对f(ab’)2的下铰链的预先存在的aha反应同时保持通过蛋白水解消化物的充分建立的路径产生f(ab’)2抗体片段的可能性的解决方案。

c端f(ab’)2变体中下铰链中的缺失：分析具有下铰链区中的缺失的c端变体以确定由预先存在的aha的识别是否改变。利用各种铰链区缺失产生一组6个变体，包括在p2位置用于ides的l235，l235v，l235i或l235m，并具有在p1处的丙氨酸或甘氨酸(图9)。在三种不同的ides：igg比率：1:10(图9a)，1：100(图9b)和1：500(图9c)下进一步调查该子集的切割效率。如图9d所示，与p5单独缺失相比，变体l235v或g236a与p5处的缺失组合导致aha信号降低。如图10所示，与δp456单独相比，在p2位置中含有l235v，l235i或l235m且具有p1中的丙氨酸或甘氨酸的δp456变体展现出类似的aha信号的减少(图10b)；然而，与δp456组合的变体相比，δp456单独的缺失表现出更好的切割效率(图10a)。

讨论

当同时希望短的全身性半寿期和效应子沉默分子时，抗体片段如fab和f(ab’)2是有吸引力的治疗形式。某些片段也是与侵入性疾病如肿瘤细胞和细菌有关的蛋白酶的天然产物，并且是为了逃避免疫监视而产生的。结果，fab和f(ab’)2片段的c端新表位被免疫系统识别并产生可提供替代fc的aha。

在该研究中，剖析了预先存在的aha对跨越人igg1，igg2和igg4同种型的上铰链区的单个c端残基的反应性。尽管先前报道了针对ides切割的人igg2抗体的下铰链中的新表位不存在预先存在的aha，但迄今尚未完全研究对人类同种型的上铰链的反应性。在此研究中，未检测到针对igg2和igg4同种型的上铰链的预先存在的aha。这反过来可能表明这些同种型不是侵入性疾病蛋白酶的靶标。这可以通过这些同种型的效应子减毒性质，以及移除这些同种型的fc区域不会为肿瘤和细菌提供优势的事实来解释。相反，igg1同种型似乎是这些蛋白酶的主要靶标。实际上，已经描述了几种蛋白酶在人igg1的上铰链上切割，包括纤溶酶，人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和lysc。该研究表明，针对于人igg1的上铰链的除d221之外的所有切割位点存在预先存在的aha。不受限于特定的理论，缺乏针对d221的aha可能反映了人类蛋白酶在该残基之后不能切割或不能产生针对该新表位的抗体。对c端t223fab观察到最高的反应性。有趣的是，这个c端与人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的切割点相吻合，所述人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶是一种在炎症过程中由嗜中性粒细胞和巨噬细胞分泌的破坏细菌和宿主组织的蛋白酶(29)。

预先存在的aha可以快速将效应子功能募集到设计为效应子更少的分子上。使用igg2或igg4同种型的fab可以提供一种策略来提供没有预先存在的抗体反应的分子。备选地，在重链c端引入非天然残基，如t225l突变，或将上铰链截短至d221是用于igg1同种型的策略。虽然t225l突变消除了对预先存在的aha的反应，但这意味着它原则上也可以引发免疫反应。最近一项利用抗tnfr1结构域抗体的研究(34)进一步支持了这一点。c端丙氨酸的添加足以减少体外筛选期间预先存在的人抗vh抗体的结合；然而，发现一位受试者在i期临床试验中出现了对修饰的c端特异的高水平抗体。另外，较长尾巴上的潜在外肽酶活性最终可能导致被预先存在的aha所识别的新表位。像fab-d221一样，一起去除非结构化的上铰链进一步使这种二次反应的风险最小化。这由已经与跨越人igg1的ides切割的下铰链的肽复合结晶的抗铰链抗体的晶体结构所支持(30)。肽以延伸构象与抗体结合，表明截短的上或下铰链可成功除去新表位并抑制针对铰链区的抗体的免疫反应。

这些发现也可能启示食蟹猴研究的设计。虽然下铰链区在食蟹猴和人igg之间高度保守，但上铰链区存在相当大的差异(31)，这将防止跨物种反应性。这可能对食蟹猴的毒理学研究产生影响，因为这些研究无法解决来自预先存在的aha对人fab负有责任。

除了治疗用途之外，fab-d221也可以考虑用于结晶学研究的fab的重组表达，因为由于非结构性质，上铰链通常不在晶体结构中解析。该实施例证明用fab-d221构建体可以实现同等的稳定性和表达。消除非结构化区域可能会进一步改善结晶结果。

到目前为止产生f(ab’)2分子的最有效途径是通过蛋白水解消化，并且优选具有高特异性的蛋白酶如ides。如早前所述，也存在针对f(ab’)2分子的下铰链的预先存在的aha。与fab相比，针对ides切割的抗体的aha效价更高。不受限于特定理论，这可能是由于在测定中提供基于结合组分的亲合力的f(ab’)2的二价性质或导致提高的滴度的f(ab’)2的天然更高的丰度。几种策略被用来在保持ides的切割效率的同时去除aha反应性。

由于c端残基在表位识别中具有重要作用(22)，所以第一策略是突变f(ab’)2的c端残基以去除aha的结合活性。然而，这是不可能的，因为在p1位严格需要甘氨酸用于ides的有效切割。p2位点中选定的突变组对aha结合只有适度的影响，进一步证实了c端残基对与aha反应性的重要性。aha结合与p1和p2变体的ides切割效率的一致性差异(coincidingdifferences)可能解释了为什么具有在p2中的缬氨酸和在p1位置中的丙氨酸的igg2同种型对抗铰链抗体反应较不敏感的原因。为了有效切割，需要位置p1上的甘氨酸伴随着该残基在不同同种型内和不同物种间的高度保守性。

通过缺失下铰链中的三个残基(δp456)，能够保持ides的切割效率，同时去除预先存在的aha识别。它表明p3位点上游的位置具有对于有效切割的小相关性。除了去除针对预先存在的aha的反应性之外，截短下铰链还可抑制针对该表位的免疫反应。基于结构研究，aha以延伸构象结合下铰链，并且五个c端残基与抗体互补决定区(cdr)相互作用(30)。通过去除来自下铰链的三个残基，在ides切割后仅剩余4个残基。这个短序列可能不足以产生强大的免疫反应，并且可能降低产生针对工程铰链的重新抗体的可能性。

已经证明预先存在的抗体在体外降低效应子功能(32)，并且也可以在药物开发期间混淆免疫原性测定。尽管针对人源化抗体的大多数抗治疗性抗体(ata)靶向独特型类风湿因子，但已经描述了针对fc区的低亲和力抗体。在免疫原性测定中消除类风湿因子造成伪影的一种方法是使用不含fc区的抗体片段。然而，使用不被其他预先存在的抗体识别的片段是重要的。这些发现提供了可以满足这些标准的多种fab形式和f(ab’)2形式。

总之，通过选择合适的抗体片段，可以逃避预先存在的aha的识别。对于fab分子，存在几种选择：(1)使用igg2或igg4同种型，(2)c端残基的突变(t225l)，或(3)用残基d221终止fab。由于需要蛋白水解消化，选择对于f(ab’)2分子更受限制。在igg1的下铰链中鉴定出缺失，然而，其保持高切割效率和特异性并且去除了与预先存在的aha的反应性。使用这些形式可以进一步最小化治疗设定中抗体片段的安全性，并消除测定开发中的干扰。

实施例2-f(ab’)2δp456具有降低的aha介导的fcγriiia和c1q结合

先前已经描述了纯化的aha抗体可以充当fc替代物并恢复由ides产生的f(ab’)2所丢失的adcc/cdc功能(20，22)。为了研究由公开的工程化fab和f(ab’)2变体降低的aha结合是否进一步通过fcγ受体和c1q减少的募集来反映，采用桥接实验。为了评估aha与fcγriiia的结合，将人血清加入fab或f(ab’)2包被的孔中并如上所述温育2小时。洗涤平板后，将可溶性fcγriiia(v158)-his-gst(在羧基末端由与gly-his6-谷胱甘肽-s-转移酶(seqidno：28公开的“gly-his6”)融合的胞外域组成))以0.5μg/ml添加。用辣根过氧化物酶缀合的小鼠抗his抗体(penta-his(seqidno：29)，qiagen，germantown，md)然后用tmb作为底物检测结合的fcγriiia(v158)-his-gst。为了评估aha与人c1q的结合，将人血清加入fab或f(ab’)2包被的孔中并如上所述温育2小时。洗涤平板后，加入纯化的人c1q(quidel，sandiego，ca)。用山羊抗c1q抗体(nordicimmunologicallaboratories，tilburg，thenetherlands)然后用兔抗山羊igg-hrp(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)和tmb作为底物检测结合的c1q。

观察到fcγriiia和c1q对f(ab’)2的显著结合，而检测到对δp456f(ab’)2变体的小信号，表明f(ab’)2变体的工程化显著降低了adcc/cdc活化的风险。以1:10稀释的血清，对于fcγriiia结合f(ab’)2、δp456变体和未包被孔，od读数(n＝3)分别为0.45±0.05，0.10±0.02和0.09±0.02，并且对于c1q结合f(ab’)2、δp456变体和未包被孔，od读数(n＝3)分别为0.98±0.09，0.158±0.004和0.107±0.009。

iv.参考文献

1.desjarlais,j.r.,和lazar,g.a.(2011)modulationofantibodyeffectorfunction.experimentalcellresearch.317,1278–1285.

2.olafsen,t.(2012)fcengineering:serumhalf-lifemodulationthroughfcrnbinding.methodsmolbiol.907,537–556.

3.gadkar,k.,pastuskovas,c.v.,lecouter,j.e.,elliott,j.m.,zhang,j.,lee,c.v.,sanowar,s.,fuh,g.,kim,h.s.,lombana,t.n.,spiess,c.,nakamura,m.,hass,p.,shatz,w.,meng,y.g.,和scheer,j.m.(2015)designandpharmacokineticcharacterizationofnovelantibodyformatsforoculartherapeutics.invest.ophthalmol.vis.sci.56,5390–5400.

4.walsh,g.(2014)biopharmaceuticalbenchmarks2014.natbiotechnol.32,992–1000.

5.curtis,b.r.,swyers,j.,divgi,a.,mcfarland,j.g.,和aster,r.h.(2002)thrombocytopeniaaftersecondexposuretoabciximabiscausedbyantibodiesthatrecognizeabciximab-coatedplatelets.blood.99,2054–2059.

6.porter,r.r.(1950)theformationofaspecificinhibitorbyhydrolysisofrabbitantiovalbumin.biochemj.46,479–484.

7.chen,y.,wiesmann,c.,fuh,g.,li,b.,christinger,h.w.,mckay,p.,devos,a.m.,和lowman,h.b.(1999)selectionandanalysisofanoptimizedanti-vegfantibody:crystalstructureofanaffinity-maturedfabincomplexwithantigen.jmolbiol.293,865–881.

8.spiess,c.,zhai,q.,和carter,p.j.(2015)alternativemolecularformatsandtherapeuticapplicationsforbispecificantibodies.mol.immunol.67,95–106.

9.carter,p.,kelley,r.f.,rodrigues,m.l.,和snedecor,b.(1992)highlevelescherichiacoliexpressionandproductionofabivalenthumanizedantibodyfragment.nature.10.1038/nbt0292-163.

10.kostelny,s.a.,cole,m.s.,和tso,j.y.(1992)formationofabispecificantibodybytheuseofleucinezippers.jimmunol.148,1547–1553.

11.glennie,m.j.,mcbride,h.m.,worth,a.t.,和stevenson,g.t.(1987)preparationandperformanceofbispecificf(ab'gamma)2antibodycontainingthioether-linkedfab”gammafragments.jimmunol.139,2367–2375.

12.ellerman,d.,和scheer,j.m.(2011)generationofbispecificantibodiesbychemicalconjugation(kontermann,r.e.ed),pp.47–63,springer-verlagberlinheidelberg,10.1007/978-3-642-20910-9_3.

13.brezski,r.j.,和jordan,r.e.(2010)cleavageofiggsbyproteasesassociatedwithinvasivediseases:anevasiontacticagainsthostimmunity？mabs.2,212–220.

14.nisonoff,a.,wissler,f.c.,和lipman,l.n.(1960)propertiesofthemajorcomponentofapepticdigestofrabbitantibody.science.132,1770–1771.

15.pawel-rammingen,von,u.,johansson,b.p.,和l.(2002)ides,anovelstreptococcalcysteineproteinasewithuniquespecificityforimmunoglobuling.emboj.21,1607–1615.

16.vincents,b.,pawel-rammingen,von,u.,l.,和abrahamson,m.(2004)enzymaticcharacterizationofthestreptococcalendopeptidase,ides,revealsthatitisacysteineproteasewithstrictspecificityforiggcleavageduetoexositebinding.biochemistry.43,15540–15549.

17.osterland,c.k.,harboe,m.,和kunkel,h.g.(1963)anti-gamma-globulinfactorsinhumanserarevealedbyenzymaticsplittingofanti-rhantibodies.voxsang.8,133–152.

18.mellbye,o.j.,和natvig,j.b.(1971)evidenceforimmunecomplexescontainingantibodytothepepsinsiteofigginrheumatoidsynovialfluids.clinexpimmunol.8,889–899.

19.terness,p.,kohl,i.,hübener,g.,battistutta,r.,moroder,l.,welschof,m.,dufter,c.,finger,m.,hain,c.,和jung,m.(1995)thenaturalhumanigganti-f(ab')2antibodyrecognizesaconformationaligg1hingeepitope.jimmunol.154,6446–6452.

20.brezski,r.j.,luongo,j.l.,petrone,d.,ryan,m.h.,zhong,d.,tam,s.h.,schmidt,a.p.,kruszynski,m.,whitaker,b.p.,knight,d.m.,和jordan,r.e.(2008)humananti-igg1hingeautoantibodiesreconstitutetheeffectorfunctionsofproteolyticallyinactivatediggs.jimmunol.181,3183–3192.

21.rispens,t.,devrieze,h.,degroot,e.,wouters,d.,stapel,s.,wolbink,g.j.,和aarden,l.a.(2012)antibodiestoconstantdomainsoftherapeuticmonoclonalantibodies:anti-hingeantibodiesinimmunogenicitytesting.jimmunolmethods.375,93–99.

22.brezski,r.j.,kinder,m.,grugan,k.d.,soring,k.l.,carton,j.,greenplate,a.r.,petley,t.,capaldi,d.,brosnan,k.,emmell,e.,watson,s.,和jordan,r.e.(2014)amonoclonalantibodyagainsthinge-cleavediggrestoreseffectorfunctiontoproteolytically-inactivatediggsinvitroandinvivo.mabs.

23.simmons,l.c.,reilly,d.,klimowski,l.,raju,t.s.,meng,g.,sims,p.,hong,k.,shields,r.l.,damico,l.a.,rancatore,p.,和yansura,d.g.(2002)expressionoffull-lengthimmunoglobulinsinescherichiacoli:rapidandefficientproductionofaglycosylatedantibodies.jimmunolmethods.263,133–147

24.eaton,d.l.,wood,w.i.,eaton,d.,hass,p.e.,hollingshead,p.,wion,k.,mather,j.,lawn,r.m.,vehar,g.a.,和gorman,c.(1986)constructionandcharacterizationofanactivefactorviiivariantlackingthecentralone-thirdofthemolecule.biochemistry.25,8343–8347.

25.wong,a.w.,baginski,t.k.,和reilly,d.e.(2010)enhancementofdnauptakeinfut8-deletedchocellsfortransientproductionofafucosylatedantibodies.biotechnolbioeng.106,751–763.

26.bos,a.b.,duque,j.n.,bhakta,s.,farahi,f.,chirdon,l.a.,junutula,j.r.,harms,p.d.,和wong,a.w.(2014)developmentofasemi-automatedhighthroughputtransienttransfectionsystem.journalofbiotechnology.180,10–16.

27.vanschie,k.a.,wolbink,g.-j.,和rispens,t.(2015)cross-reactiveandpre-existingantibodiestotherapeuticantibodies-effectsontreatmentandimmunogenicity.mabs.7,662–671.

28.brezski,r.j.,oberholtzer,a.,strake,b.,和jordan,r.e.(2011)theinvitroresistanceofigg2toproteolyticattackconcurswithacomparativepaucityofautoantibodiesagainstpeptideanalogsoftheigg2hinge.mabs.3,558–567.

29.belaaouaj,a.,kim,k.s.,和shapiro,s.d.(2000)degradationofoutermembraneproteinainescherichiacolikillingbyneutrophilelastase.science.289,1185–1188

30.malia,t.j.,teplyakov,a.,brezski,r.j.,luo,j.,kinder,m.,sweet,r.w.,almagro,j.c.,jordan,r.e.,和gilliland,g.l.(2014)structureandspecificityofanantibodytargetingaproteolyticallycleavedigghinge.proteins.10.1002/prot.24545.

31.jacobsen,f.w.,padaki,r.,morris,a.e.,aldrich,t.l.,armitage,r.j.,allen,m.j.,lavallee,j.c.,和arora,t.(2011)molecularandfunctionalcharacterizationofcynomolgusmonkeyiggsubclasses.jimmunol.186,341–349.

32.jones,j.d.,shyu,i.,newkirk,m.m.,和rigby,w.f.c.(2013)arheumatoidfactorparadox:inhibitionofrituximabeffectorfunction.arthritisres.ther.15,r20.

33.pollack,c.v.,reilly,p.a.,eikelboom,j.,glund,s.,verhamme,p.,bernstein,r.a.,dubiel,r.,huisman,m.v.,hylek,e.m.,kamphuisen,p.w.,kreuzer,j.,levy,j.h.,sellke,f.w.,stangier,j.,steiner,t.,wang,b.,kam,c.-w.,和weitz,j.i.(2015)idarucizumabfordabigatranreversal.n.engl.j.med.373,511–520.

34.cordy,j.c.,morley,p.j.,wright,t.j.,birchler,m.a.,lewis,a.p.,emmins,r.,chen,y.z.,powley,w.m.,bareille,p.j.,wilson,r.,tonkyn,j.,bayliffe,a.i.,和lazaar,a.l.(2015)specificityofhumananti-variableheavy(vh)chainautoantibodiesandimpactonthedesignandclinicaltestingofavhdomainantibodyantagonistoftnf-αreceptor1.clinexpimmunol.10.1111/cei.12680.

尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明和实施例的方式详细描述了上述组合物和方法，但是说明书和实施例不应被解释为限制本公开的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入本文作为参考。