抗核仁素抗体的制作方法
本申请要求2016年3月7日提交的美国临时申请号62/304,742、2016年4月15日提交的美国临时申请号62/323,159、2016年10月28日提交的美国临时申请号62/414,316的权益，所有上述申请均通过引用以其全文并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是基于美国国立卫生研究院、国家癌症研究所授予的基金ncica109254-04s1以及基于美国陆军医学研究和物资司令部授予的基金#w81xwh-12-1-0241和#w81xwh-12-1-0242在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ascii格式以电子方式提交，并且通过引用以其全文并入于此。在2017年3月7日创建的所述ascii副本被命名为39723-709_601_sl.txt并且大小为60,062个字节。
援引并入
本文公开的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。如果本文公开的术语与所并入的参考文献中的术语之间存在冲突，则以本文中的术语为准。
背景技术
抗体是一类被称为“生物制剂”的药剂。抗体来源可以是多克隆供应，如人血清或马血清，或来源于单克隆来源(单细胞克隆)。凭借控制和选择特异性抗原结合的技术能力，单克隆抗体已经产生了显著的治疗益处。然而，为某些靶标生成特异性抗体的困难限制了成功，并且治疗剂的潜力仍然在很大程度上尚未开发。
开发用于人类治疗的单克隆抗体的一个障碍是需要对这样的抗体进行“人源化”，这样的抗体通常在小鼠、大鼠和兔子中制成。如果人类患者在没有人源化恒定区的情况下施用这样的抗体，则他们可能患有“血清病”，这意味着接受者对该非人抗体序列产生内源性免疫应答。对研究动物中产生的单克隆抗体进行人源化可以避免这个问题。然而，抗体人源化的时间和费用成本可能是相当大的。
核仁素在慢性淋巴细胞白血病(cll)细胞、急性髓样白血病(aml)细胞、某些形式的乳腺癌以及其他肿瘤的细胞表面上表达。因此，核仁素构成用于靶向治疗剂(包括抗体)的有前景的肿瘤抗原。
技术实现要素：
在许多方面中的一些方面，本公开内容涉及免疫学识别、结合和/或灭活核仁素的特异性抗体。本文还提供了抗核仁素抗体的轻链和重链序列，该轻链和重链序列可直接用于制备抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，或者可用于提供特异性序列元件(例如，cdr序列)，该特异性序列元件可以掺入不同的、所需的抗体背景中。包含本文公开的序列的抗体可用于涉及使核仁素失活的多种疗法。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与氨基酸序列seqidno：42具有至少60％序列同一性的重链cdr1；与氨基酸序列yis具有至少60％序列同一性的重链cdr2；与氨基酸序列dm具有至少60％序列同一性的重链cdr3；与氨基酸序列seqidno：65具有至少60％序列同一性的轻链cdr1；与氨基酸序列seqidno：54具有至少60％序列同一性的轻链cdr2；以及与氨基酸序列seqidno：66具有至少60％序列同一性的轻链cdr3。在一些实施方案中，所述至少60％序列同一性是至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或100％序列同一性。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有包含seqidno：42的氨基酸序列的重链cdr1；具有包含yis的氨基酸序列的重链cdr2；具有包含dm的氨基酸序列的重链cdr3；具有包含seqidno：65的氨基酸序列的轻链cdr1；具有包含seqidno：54的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有包含seqidno：66的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与选自seqidno.24至26的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr1；与选自yis和seqidno.30至32的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr2；与选自seqidno.37至39的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr3；与选自seqidno.46至48的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr1；与选自seqidno.52至54的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr2；以及与选自seqidno.58至61的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr3。在一些实施方案中，所述至少60％序列同一性是至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或100％序列同一性。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：24的氨基酸序列的重链cdr1；具有seqidno：30的氨基酸序列的重链cdr2；具有seqidno：37的氨基酸序列的重链cdr3；具有seqidno：46的氨基酸序列的轻链cdr1；具有seqidno：52的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有seqidno：58的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：25的氨基酸序列的重链cdr1；具有seqidno：31的氨基酸序列的重链cdr2；具有seqidno：38的氨基酸序列的重链cdr3；具有seqidno：47的氨基酸序列的轻链cdr1；具有seqidno：53的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有seqidno：59的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：26的氨基酸序列的重链cdr1；具有yis的氨基酸序列的重链cdr2；具有seqidno：39的氨基酸序列的重链cdr3；具有seqidno：48的氨基酸序列的轻链cdr1；具有seqidno：54的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有seqidno：60的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：24的氨基酸序列的重链cdr1；具有seqidno：32的氨基酸序列的重链cdr2；具有seqidno：37的氨基酸序列的重链cdr3；具有seqidno：46的氨基酸序列的轻链cdr1；具有seqidno：52的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有seqidno：61的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与seqidno：3的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链可变区(vh)；以及与seqidno：12的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链可变区(vl)。在一些实施方案中，所述至少60％序列同一性是至少：65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或100％序列同一性。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：3的氨基酸序列的vh；以及具有seqidno：12的氨基酸序列的vl。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与seqidno：2的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链；以及与seqidno：11的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链。在一些实施方案中，所述seqidno：2的氨基酸序列由seqidno：1的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述seqidno：11的氨基酸序列由seqidno：10的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述至少60％序列同一性是至少：65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或100％序列同一性。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与seqidno：14的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链；以及与seqidno：11的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链。在一些实施方案中，所述至少60％序列同一性是至少：65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或100％序列同一性。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其包含具有seqidno：2的氨基酸序列的重链；和具有seqidno：11的氨基酸序列的轻链。在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其包含具有seqidno：14的氨基酸序列的重链；和具有seqidno：11的氨基酸序列的轻链。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与dyf的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr1；与seqidno：74的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr2；与ar或seqidno：77的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr3；与seqidno：84的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr1；与nvs的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr2；以及与seqidno：91的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr3。在一些实施方案中，所述至少60％序列同一性是至少：65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或100％序列同一性。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有包含dyf的氨基酸序列的重链cdr1；具有包含seqidno：74的氨基酸序列的重链cdr2；具有包含ar或seqidno：77的氨基酸序列的重链cdr3；具有包含seqidno：84的氨基酸序列的轻链cdr1；具有包含nvs的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有包含seqidno：91的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与seqidno：69或seqidno：70的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr1；与seqidno：73或seqidno：74的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr2；与ar、seqidno：77或seqidno：78的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重链cdr3；与seqidno：83或seqidno：84的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr1；与nvs或seqidno：87的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr2；以及与seqidno：90或seqidno：91的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：69的氨基酸序列的重链cdr1；具有seqidno：73的氨基酸序列的重链cdr2；具有seqidno：77的氨基酸序列的重链cdr3；具有seqidno：83的氨基酸序列的轻链cdr1；具有seqidno：87的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有seqidno：90的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：70的氨基酸序列的重链cdr1；具有seqidno：74的氨基酸序列的重链cdr2；具有seqidno：78的氨基酸序列的重链cdr3；具有seqidno：84的氨基酸序列的轻链cdr1；具有nvs的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有seqidno：90的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：70的氨基酸序列的重链cdr1；具有seqidno：74的氨基酸序列的重链cdr2；具有ar的氨基酸序列的重链cdr3；具有seqidno：84的氨基酸序列的轻链cdr1；具有nvs的氨基酸序列的轻链cdr2；以及具有seqidno：91的氨基酸序列的轻链cdr3。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：与seqidno：17的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的vh；以及与seqidno：19的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的vl。在一些实施方案中，所述seqidno：17的氨基酸序列由seqidno：16的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述seqidno：19的氨基酸序列由seqidno：18的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所述至少60％序列同一性是至少：65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％或100％序列同一性。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其中所述分离的抗体或其片段与人核仁素结合，并且包含：具有seqidno：17的氨基酸序列的vh；以及具有seqidno：19的氨基酸序列的vl。
在一些情况下，本文提供了分离的抗体或其片段，其包含本文公开的重链cdr、vh或其片段与本文公开的轻链cdr、vl或其片段的任何组合。
在一些情况下，本文提供了分离的抗核仁素抗体或其片段，其与氨基酸序列seqidno：21结合。在一些情况下，本文提供了分离的抗核仁素抗体或其片段，其与氨基酸序列seqidno：20的残基g300至e466内的表位结合。在一些实施方案中，所述表位包含选自e453、r457、d455、k348、k427、g426、k403、y402及其任何组合的氨基酸。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段包含与e453、r457或其组合结合的轻链cdr1。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段包含与d455结合的轻链cdr2。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段包含与k348结合的轻链cdr3。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段包含与k427结合的重链cdr1。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段包含与k427、g426或其组合结合的重链cdr2。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段包含与k403、y402或其组合结合的重链cdr3。在一些实施方案中，所述核仁素是细胞表面核仁素。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段是人的或人源化的。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段是igg抗体。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段是为fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体的片段。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段是包含抗原结合区的片段。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段对正常细胞或组织无毒性。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段具有细胞毒性，例如对肿瘤或癌细胞具有细胞毒性。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段在人血清的存在下具有细胞毒性。在一些实施方案中，当与肿瘤或癌细胞群体一起温育一段时间时，所述分离的抗体或其片段杀死该肿瘤或癌细胞群体的至少10％。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段杀死该肿瘤或癌细胞群体的至少：20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％；或约100％。在一些实施方案中，所述温育是在人血清的存在下进行的。在一些实施方案中，所述一段时间为约48-96小时。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞包括选自人肺癌细胞、皮肤癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞、白血病细胞、脑癌细胞和胰腺癌细胞中的一种、两种或更多种类型的癌细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞包括选自a549、a375、mcf-7、hep3b、hct-116、nci-h358、786-0、du-145、mda-mb-231、mv4-11、u251、cg-emt、mia-paca2和panc-1细胞中的一种、两种或更多种类型的癌细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含乳腺癌细胞，例如mcf-7或mda-mb-231细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含急性髓样白血病(aml)细胞，例如mv4-11细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含前列腺癌细胞，例如du-145细胞或cg-emt细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含肺癌细胞，例如a549或nci-h358细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含皮肤恶性黑素瘤细胞，例如a375细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含肝细胞癌细胞，例如hep3b细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含结肠癌细胞，例如hct-116细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含肾癌细胞，例如786-0细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含脑肿瘤细胞，例如u251细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤或癌细胞群体包含胰腺癌细胞，例如mia-paca2或panc-1细胞。
在一些情况下，本文提供了产生本文公开的分离的抗体或其片段的重组细胞。在一些情况下，本文提供了分离的核酸，其编码本文公开的分离的抗体或其片段。在一些情况下，本文提供了包含本文公开的核酸的载体。在一些情况下，本文提供了宿主细胞，其包含本文公开的核酸或本文公开的载体。在一些情况下，本文提供了产生抗体或其片段的方法，其包括培养本文公开的宿主细胞，从而产生所述抗体或其片段。
在一些情况下，本文提供了药物组合物，其包含有效量的本文公开的分离的抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述分离的抗体或其片段是多克隆抗体。
在一些情况下，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含本文公开的分离的抗体或其片段的药物组合物。在一些实施方案中，所述施用是注射。在一些实施方案中，所述施用是静脉内或皮下注射。在一些实施方案中，所述施用每周进行1-3次。在一些实施方案中，所述方法使所述受试者中的肿瘤大小减小至少：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％。在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些实施方案中，所述药物组合物的剂量为0.15mg至3mg/kg受试者体重，例如0.5mg至2mg/kg受试者体重。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，所述癌症包括选自人肺癌、皮肤癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、白血病、脑癌和胰腺癌细胞中的一种、两种或更多种类型的癌症。
在一些情况下，本文提供了杀死癌细胞的方法，其包括使癌细胞与本文公开的分离的抗体或其片段接触。在一些情况下，本文提供了本文公开的分离的抗体或其片段用于治疗癌症或杀死癌细胞的用途。
在一些情况下，本文提供了本文公开的分离的抗体或其片段在制备药物中的用途。在一些实施方案中，所述药物用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述药物用于杀死癌细胞。
在一些情况下，本文提供了重组哺乳动物细胞系，其中所述重组哺乳动物细胞系包含一种或多种细胞，所述一种或多种细胞包含seqidno：1的第一核酸序列和seqidno：10的第二核酸序列。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列处于同一构建体中。在一些实施方案中，重组或合成产生所述第一核酸序列和所述第二核酸序列并将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，所述表达载体是ptt5表达载体。在一些实施方案中，将所述第一核酸序列和所述第二核酸序列转染到所述一种或多种细胞中。
在一些情况下，本文提供了激活人类受试者中的免疫系统的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的分离的抗体或其片段。在一些情况下，本文提供了通过抑制人类受试者中的转化生长因子β(tgfβ)来治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的分离的抗体或其片段，从而抑制所述tgfβ并且治疗所述癌症。在一些实施方案中，所述tgfβ是tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3。
本文提供了通过防止人类受试者中的致癌mrna的稳定化来治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的分离的抗体或其片段，从而使所述致癌mrna不稳定并且治疗所述癌症。在一些实施方案中，所述致癌mrna是肿瘤蛋白p53mrna、b细胞淋巴瘤-超大(bcl-xl)mrna、(b细胞淋巴瘤-2)bcl-2mrna、胃泌素mrna、(生长阻滞和dna损伤诱导α)gadd45αmrna、基质金属肽酶9(mmp9)mrna、拟南芥驱动蛋白(atkl)mrna、细胞周期蛋白1mrna、白细胞介素-2(il-2)mrna、前列腺素-h合酶1(pghs-1)mrna或其任何组合。在一些情况下，本文提供了通过降低人类受试者中的致癌蛋白的表达水平来治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用本文公开的分离的抗体或其片段，从而使所述致癌蛋白的表达水平不稳定并且治疗所述癌症。在一些实施方案中，所述致癌蛋白是肿瘤蛋白p53、bcl-xl、bcl-2、胃泌素、gadd45α、mmp9、atk1、细胞周期蛋白1、il-2、pghs-1或其任何组合。在一些实施方案中，所述癌症包括选自人肺癌、皮肤癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、白血病、脑癌和胰腺癌细胞中的一种、两种或更多种类型的癌症。
在一些情况下，本文提供免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含与治疗剂连接的抗原结合剂，并且其中所述抗原结合剂包含本文公开的分离的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述免疫缀合物是融合蛋白，并且所述治疗剂是多肽。在一些实施方案中，所述抗原结合剂是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合剂是前体(probody)。在一些实施方案中，所述前体包含由肿瘤细胞激活的抗原结合区。在一些实施方案中，所述抗原结合区包含通过蛋白酶可切割连接体与轻链的n-末端连接的肽。在一些实施方案中，所述抗原结合剂与所述治疗剂共价、非共价或重组连接。在一些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是多柔比星(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、澳瑞他汀(auristatin)、美登素(maytansinoid)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、微管蛋白裂解素(tubulysins)、多卡霉素(duocarmycins)、喜树碱(camptothecin)、sn-38、吡咯苯并二氮杂
在一些情况下，本文提供了药物组合物，其包含本文公开的免疫缀合物和药学上可接受的载体。在一些情况下，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用包含本文公开的免疫缀合物的药物组合物。在一些情况下，本文提供了本文公开的免疫缀合物用于治疗癌症的用途。在一些情况下，本文提供了本文公开的免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1是显示抗体cp1以及igg和igm标准品的sdspage凝胶的图像。sdspage凝胶的考马斯蓝染色显示，在不存在β-巯基乙醇的情况下(泳道10)，全长的抗体cp1具有约150kda的分子量。用β-巯基乙醇还原cp1(泳道11)表明该抗体属于igg类，其重链和轻链分别为约50kda和26kda。
图2是显示使用mabselect1.0ml蛋白a柱纯化的cp1的sdspage凝胶的图像。
图3是显示cp1的蛋白质印迹分析的图像。在还原条件下用已知量的抗体cp1以及igg1和igm标准品进行sdspage。将转移膜切成两部分，并且一部分用人igg1特异性的hrp-缀合的第二抗体探测，而第二部分用人igm特异性的hrp-缀合的第二抗体探测。未显示的对cp1重链和轻链的cdna的测序表明该抗体属于igg1κ亚类。
图4是显示cp1与人重组核仁素结合的柱状图。将不同量的人重组核仁素结合到96孔板上。用封闭缓冲液洗涤该板，然后向孔中添加不同量的抗体cp1或人igg对照抗体。用封闭缓冲液洗涤该孔以去除未结合的抗体，然后与人igg1特异性的hrp缀合的第二抗体一起温育。
图5是显示cp1对肿瘤和正常细胞活力的细胞毒性作用的线图。将各种实体瘤类型和aml(mv4-11)以及正常乳腺上皮细胞在含有10％人血清的rpmi1640培养基中在96孔板中温育24h。24h后，将细胞与人igg1抗体(对照)或不同浓度的抗体cp1一起温育96h。然后用台盼蓝对细胞进行染色，并在nexcelomcellometerautot4plus计数器中计数。ic50结果是三次测定的平均值加上s.d。
图6是显示cp1(来自b细胞或重组细胞)对不同人细胞系的作用的柱状图。cp1在体外对血液肿瘤细胞和实体瘤细胞二者均具有有效的广泛抗癌活性，但对正常细胞的毒性可忽略不计。
图7是显示cp1对mcf7乳腺癌细胞和mcf10a正常乳腺上皮细胞的作用的线图。
图8是显示cp1对患者前列腺癌cg-emt细胞活力的体外作用的线图。cg-emt细胞是从患有激素难治性前列腺癌的患者中分离的原发癌的细胞。
图9是显示cp1与癌细胞的细胞表面和质膜结合的一组图像。将未渗透化的mcf-7细胞在室温下与fitc标记的同种型对照抗体或cp1一起温育1h。通过使用cp1和fitc缀合的第二抗体的间接免疫荧光确定cp1向质膜中的渗透。用碘化丙锭复染细胞核。核仁素的点状外观表明它被掺入质膜中的脂筏内。
图10是显示在96h时纯化(顶线)和部分纯化(底线)的cp2对mcf7细胞数目的影响的一组线图。
图11是验证实施例2中蛋白质/抗体表达的一组sds-page图像。
图12是显示cp1重组κ轻链对mv4-11细胞活力的影响的线图。
图13是显示比较适体as1411和cp1对人mcf-7乳腺癌细胞活力的影响的线图。
图14是显示cp1的作用的kaplan-meier图——在具有mv411人白血病异种移植物的裸鼠模型中，30％长期存活。
图15a是显示第1组(10只小鼠)的小鼠中肿瘤体积变化的线图：对照(10mg/kg，iv，第1、4、7、10、13、16天)。图15b是显示第2组(10只小鼠)的小鼠中肿瘤体积变化的线性图表：cp1(10mg/kg，iv，第1、4、7、10、13、16天)。
图16是抗体cp1与人核仁素结合的分子模型的图像。
具体实施方式
本公开内容提供了抗核仁素抗体及其使用方法。这些抗体对质膜中表达核仁素的细胞(如癌症、自身免疫性病症和病毒性病症中涉及的细胞)展现出细胞毒性。因此，这些抗体对某些形式的癌症、过度增生性和新生血管性病症以及自身免疫性疾病具有治疗潜力。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在比对序列并引入空位(如果需要)以达到最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开可得的计算机软件如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序align-2生成％氨基酸序列同一性值。align-2序列比较计算机程序由genentech,inc创作。所有序列比较参数均由align-2程序设置并且没有变化。
在采用align-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列a与给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者将其表述为具有或包含与给定氨基酸序列b具有特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)如下计算：分数x/y的100倍，其中x是由序列比对程序align-2在该程序对a和b的比对中得分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中y是b中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a与b的％氨基酸序列同一性将不等于b与a的％氨基酸序列同一性。除非另外特别说明，否则本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值均如前一段中所述的那样使用align-2计算机程序获得。
术语“约”意指所引用的数字加上或减去该引用数字的15％。
在一些方面，本公开内容提供永生化b细胞，例如表达结合并灭活核仁素的igg抗体的人b细胞。虽然发现这些永生化细胞表达超过一种抗体序列，但通过使用抗体测序技术，确定了潜在抗体的身份和氨基酸序列，并且现在可以被提供以用于构建免疫治疗试剂。细胞培养也用于分离单个抗体。随后测试每个分离的抗体的效力和与细胞表面核仁素的结合。
本文提供了可以与核仁素结合的分离的抗体或其片段，其包含重链可变区(vh)，该重链可变区(vh)可包含一个或多个互补决定区(cdr)，每个互补决定区(cdr)与表7或表8中的一个或多个相应的vhcdr具有至少60％的序列同一性。vh可包含一个cdr，该cdr与表7或表8中的一个或多个相应的vhcdr具有至少60％的序列同一性。在一些情况下，相应的vhcdr可以是cdrh1。在一些情况下，相应的vhcdr可以是cdrh2。在一些情况下，相应的vhcdr可以是cdrh3。在一些方面，vh可包含两个cdr，每个cdr与表7或表8中的一个或多个相应的vhcdr具有至少60％的序列同一性。在一些方面，所述两个相应的vhcdr可以是cdrh1和cdrh2。在一些情况下，所述两个相应的vhcdr可以是cdrh1和cdrh3。在一些情况下，所述两个相应的vhcdr可以是cdrh2和cdrh3。
本文还提供了抗体或其片段，其中vh可包含三个cdr，每个cdr与表7中的一个或多个相应的cdrh1、cdrh2或cdrh3具有至少60％的序列同一性。在一些情况下，本文提供了抗体或其片段，其中所述vh可包含三个cdr，每个cdr与表8中的相应的cdrh1、cdrh2和cdrh3具有至少60％的序列同一性。在一些情况下，抗体或其片段可包含氨基酸序列同一性，其可以是至少：65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或100％。
本文还提供了与核仁素结合的分离的抗体或其片段，其包含轻链可变区(vl)，该含轻链可变区(vl)包含与表7或表8中的一个或多个相应的vlcdr具有至少60％的序列同一性的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些情况下，vl可包含一个cdr，该cdr与表7或表8中的一个或多个相应的vhcdr具有至少60％的序列同一性。在一些情况下，相应的vlcdr可以是cdrl1。在一些情况下，相应的vlcdr可以是cdrl2。在一些情况下，相应的vlcdr可以是cdrl3。
在一些情况下，vl可包含两个cdr，每个cdr与表7或表8中的一个或多个相应的vlcdr具有至少60％的序列同一性。在一些情况下，两个相应的vlcdr可以是cdrl1和cdrl2。在一些情况下，两个相应的vlcdr可以是cdrl1和cdrl3。在一些情况下，两个相应的vlcdr可以是cdrl2和cdrl3。在一些方面，vl可包含三个cdr，每个cdr与表7中的相应的cdrl1、cdrl2或cdrl3具有至少60％的序列同一性。在一些情况下，vl可包含三个cdr，每个cdr与表8中的相应的cdrl1、cdrl2或cdrl3具有至少60％的序列同一性。在一些方面，氨基酸序列同一性可以是至少：65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或100％。
本文还提供了与核仁素结合的分离的抗体或其片段，其包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，该重链可变区(vh)包含一个或多个互补决定区(cdr)，每个互补决定区(cdr)与表7或表8中的一个或多个相应的vhcdr具有至少60％的序列同一性；该轻链可变区(vl)包含与表7或表8中的一个或多个相应的vlcdr具有至少60％序列同一性的一个或多个互补决定区(cdr)。在一些情况下，与核仁素结合的分离的抗体或其片段可包含与表7中的vh具有至少60％序列同一性的vh。在一些情况下，与核仁素结合的分离的抗体或其片段可包含与表7中的vl具有至少60％序列同一性的vl。在一些情况下，与核仁素结合的分离的抗体或其片段可包含与表8中的vh具有至少60％序列同一性的vh。在一些情况下，与核仁素结合的分离的抗体或其片段可包含与表8中的vl具有至少60％序列同一性的vl。在一些情况下，抗体或其片段可包含一个或多个cdr的任何组合。在一些情况下，抗体或其片段可具有氨基酸序列同一性，其可以是或可以至少是：65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或100％。
在一些情况下，本文公开的抗体或其片段包含含有表7或表8中的氨基酸序列的cdrh1；含有表7或表8中的氨基酸序列的cdrh2；以及/或者含有表7或表8中的氨基酸序列的cdrh3。在一些情况下，本文公开的抗体或其片段包含含有表7或表8中的氨基酸序列的cdrl1；含有表7或表8中的氨基酸序列的cdrl2；以及/或者含有表7或表8中的氨基酸序列的cdrl3。
在一些情况下，本文公开的核仁素可以是细胞表面核仁素。在一些情况下，本文公开的核仁素可以指核仁素片段。在一些情况下，本文公开的核仁素是人核仁素。
本文还提供了可以是人的或人源化的抗体或其片段。抗体或其片段可以是igg抗体。在一些情况下，抗体或其片段可以是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。在一些情况下，抗体或其片段可以是单克隆抗体。在一些情况下，抗体或其片段可以是无毒性的。在一些情况下，抗体或其片段可以是细胞毒性的。在一些情况下，抗体或其片段可以对肿瘤或癌细胞具有细胞毒性。在一些情况下，抗体或其片段在人血清的存在下可具有细胞毒性。在一些情况下，抗体或其片段可展现或诱导对肿瘤或癌细胞的补体依赖性细胞毒性。在一些情况下，抗体或其片段可展现或诱导对肿瘤或癌细胞的补体非依赖性细胞毒性。
在一些情况下，当与细胞一起温育一段时间时，抗体或其片段可杀死肿瘤或癌细胞群体的至少10％。在一些情况下，抗体或其片段可杀死肿瘤或癌细胞群体的至少：20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些情况下，抗体或其片段可杀死肿瘤或癌细胞群体的约100％。在一些情况下，抗体或其片段可具有为约48-96小时的一段时间。在一些情况下，一段时间可以是约96小时。在一些情况下，细胞可以是乳腺癌细胞。在一些情况下，细胞可以是mcf-7。在一些情况下，细胞可以是急性髓样白血病(aml)细胞。在一些情况下，细胞可以是hct-116、nci-h358、du-145、mda-mb-231、mv4-11、mia-paca2或panc-1细胞。在一些情况下，细胞可以是前列腺癌细胞。在一些情况下，细胞可以是激素难治性前列腺癌细胞。在一些情况下，细胞可以是cg-emt细胞。在一些情况下，分离的单克隆细胞毒性抗体或其片段可以与核仁素seqidno：20的残基#300至#466内的表位结合。在一些实施方案中，表位具有/跨越约：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70或80个氨基酸。在一些情况下，分离的单克隆细胞毒性抗体或其片段可以与包含一个或多个选自e453、r457、d455、k348、k427、g426、k403和y402的氨基酸的表位结合。在一些情况下，抗体或其片段可包含表7中的vlcdr1，该vlcdr1与e453、r457或其组合结合。在一些情况下，抗体或其片段可包含表7中的vlcdr2，该vlcdr2可与d455结合。在一些情况下，抗体或其片段可包含表7中的vlcdr3，该vlcdr3可与k348结合。在一些情况下，抗体或其片段可包含表7中的vhcdr1，该vhcdr1可与k427结合。在一些情况下，抗体或其片段可包含表7中的vhcdr2，该vhcdr2可与k427、g426或其组合结合。在一些情况下，抗体或其片段可包含表7中的vhcdr3，该vhcdr3与k403、y402或其组合结合。
在一些情况下，本文公开的抗核仁素试剂对核仁素或其片段，例如氨基酸#300至#466(seqidno：21)或其中的表位具有约10μm、1μm、0.1μm、0.05μm、10nm、5nm、2.5nm、1nm或更低的kd。在一些实施方案中，该kd为约2.5nm或更低。
在一些情况下，抗体或其片段可以是igg抗体。在一些实施方案中，其片段可以是fab、fab'、f(ab')2或fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体；或由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些情况下，其片段可包含其抗原结合区。
本文还提供了可以产生抗体或其片段的重组细胞。在一些情况下，细胞可以是b细胞。在一些情况下，细胞可以是人b细胞。在一些情况下，细胞可以是杂交瘤细胞。
本文还提供了编码本文公开的抗体或其片段的分离的核酸。在一些情况下，载体可包含本文公开的核酸。在一些情况下，宿主细胞可包含本文公开的载体。
本文还提供了产生抗体或其片段的方法，其包括培养宿主细胞，以便可以产生抗体或其片段。
本文还提供了药物组合物，其包含抗体或其片段和药学上可接受的载体。在一些情况下，抗体或其片段可用作药物。
本文还提供了用抗体或其片段治疗癌症的方法。本文还提供了用抗体或其片段杀死癌细胞的方法。本文还提供了抗体或其片段治疗癌症的用途。在一些情况下，抗体或其片段的用途可用于杀死癌细胞。在一些情况下，抗体或其片段的用途可用于制备药物。药物可用于治疗癌症。药物可用于杀死癌细胞。
本文还公开了制备抗癌抗体或其片段的方法，其包括：在允许表达由载体编码的多肽和组装抗体或其片段的条件下在培养基中培养细胞；以及从培养的细胞或细胞培养基中纯化抗体或片段。
在一些情况下，可以用本文公开的第一构建体γ重链和本文公开的第二构建体κ轻链编码的抗体构建体转染重组哺乳动物细胞系。在一些情况下，可以用本文公开的第一构建体γ重链和本文公开的第二构建体λ轻链编码的抗体构建体转染重组哺乳动物细胞系。在一些情况下，所述重链和所述轻链处于同一构建体中。在一些情况下，可以合成产生抗体构建体并将其克隆到表达载体ptt5中。在一些情况下，细胞可以维持在(0.25至5)×106个细胞/ml的密度。
在一些情况下，由抗体或其片段治疗的癌症包括选自人肺癌、皮肤癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、白血病、脑癌和胰腺癌中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种类型。
在一些情况下，由抗体或其片段杀死的癌细胞包括选自人肺癌、皮肤癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、白血病、脑癌和胰腺癌细胞中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种类型。在一些实施方案中，癌细胞包括选自a549、a375、mcf-7、hep3b、hct-116、nci-h358、786-0、du-145、mda-mb-231、mv4-11、u251、cg-emt、mia-paca2和panc-1细胞中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种类型。
1.核仁素
1a.综述
核仁素是与dna、rna和质膜的外表面结合的一种多功能蛋白质。核仁素在细胞内执行多种多样功能的能力与蛋白质内的多个结构域有关。核仁素带负电荷的n-末端结构域通过诱导核仁染色质解凝来调节rdna转录(srivastava等人,1989)，而中心球状结构域含有四个rna结合域(rbd)(serin等人,1997)。有人提出，核仁素经由其rbd及其富含rgg的c-末端结构域与前核糖体rna的结合，通过将正确折叠的rrna与rrna成熟和核糖体组装所必需的其他组分聚集在一起，起到装配因子的作用(ginisty等人,2001)。核仁素也可能参与将核糖体输出到细胞质，同时在细胞质与细胞核之间穿梭(srivastava和pollard,1999)。可以在登录号nm_005381、xm_002342275、np_005372和xp_002342316下获取核仁素基因编码和蛋白质序列。核仁素也被称为c23、flj45706、flj59041和ncl。
人ncl基因由14个外显子和13个内含子组成，并且跨度大约11kb。核仁素蛋白质含有多个介导其功能的功能域。n-末端部分含有多个磷酸化位点并富含酸性氨基酸。核仁素的中心部分包括四个rna结合域(rbd)，并且c-末端部分包含富含甘氨酸和精氨酸的结构域(称为rgg或gar结构域)(farin等人,2009)。
大量证据支持核仁素在mrna稳定化中的作用。核仁素与淀粉样蛋白前体蛋白mrna的3'-非翻译区(3'-utr)结合并稳定该mrna(westmark和malter,2001)。还需要在t细胞活化过程中发生的il-2mrna的稳定(chen等人,2000)。
核仁素存在于各种类型的肿瘤细胞的外表面上(otake等人,2007；soundararajan等人,2008；chen等人,2008；hovanessian等人,2000；sinclair和o'brien,2002)，尽管它缺少跨膜域或信号序列(srivastava等人,1989；lapeyre等人,1987)。结果显示，核仁素不是从mv4-11细胞或k-562细胞分泌到组织培养基中的(soundararajan等人,2009)。这表明细胞表面上核仁素的存在不是通过肿瘤细胞的细胞表面上的大分子吸附分泌的核仁素的结果。然而，核仁素经历了大量的翻译后修饰(srivastava等人,1989；lapeyre等人,1987)。它已经从各种类型的增殖细胞表面分离为糖-磷酸-蛋白质(hovanessian等人,2000；pfeifle和anderer,1983)。也有可能是核仁素的棕榈酰化、异戊烯化或豆蔻酰化可允许蛋白质的这些疏水区域插入或锚定到质膜中。据认为核仁素在质膜与细胞核之间起到穿梭蛋白的作用(hovanessian等人,2000)。在增殖的肿瘤细胞中，核仁素通常与从质膜内陷的内吞囊泡相关(hovanessian等人,2000)。核仁素还充当各种配体的细胞表面受体，因为与这些囊泡内的核仁素结合的配体在温度依赖性过程中内化。例如，据报道质膜核仁素起到大肠杆菌的紧密黏附素-γ(sinclair和o'brien,2002)、抗hiv剂中期因子(said等人,2002)、层粘连蛋白-1(kibbey等人,1995)、dna纳米颗粒(chen等人,2008)和抗血管生成假肽hb-19(destouches等人,2008)的受体的作用。核仁素是核仁中涉及以指数方式生长的真核细胞核糖体的生物合成和成熟的重要蛋白质。在这方面，核仁素的一个重要功能是作为细胞质与细胞核之间的穿梭蛋白，其涉及rna加工和其他细胞生物学过程。在正常的细胞生理学中，核仁素主要定位于细胞核和细胞质中，在某些条件下，特别是在各种疾病状态下，它也已经显示在细胞表面以磷酸化形式存在。在这方面，细胞膜中的核仁素充当各种配体的结合蛋白，其驱动细胞增殖、分化、粘附、有丝分裂和血管生成。
1b.癌症中的核仁素
多条证据表明，核仁素是用于基于抗体的免疫疗法的优异肿瘤抗原。核仁素在包括人慢性淋巴细胞白血病(cll)(otake等人,2007)、急性髓样白血病(aml)(soundararajan等人,2008)和乳腺癌细胞(soundararajan等人,2008)等多种人类肿瘤的质膜和细胞质中过表达，但不在正常的cd19+b细胞(otake等人,2007)、cd33+髓样细胞(gattoni-celli等人,2009)，也不在正常乳腺上皮细胞(soundararajan等人,2008)中过表达。令人感兴趣的是，植入nod/scid小鼠中的来自患者的aml母细胞在质膜和细胞质中显示出强烈的核仁素染色，而正常小鼠骨髓细胞和脾淋巴细胞是核仁素阴性的(gattoni-celli等人,2009)。在正常人髓样细胞中，核仁素染色集中在核仁中，而在患者aml-1细胞中，在细胞核和细胞质/细胞表面观察到大量的核仁素染色(核仁素的异常表达)。
核仁素靶向适体as1411靶向核仁素。最近报道了质膜核仁素是人mv4-11白血病细胞中as1411的受体(soundararajan等人,2009)。
as1411与肿瘤细胞外表面上过表达的核仁素结合，并且当核仁素从质膜穿梭到细胞质和细胞核时获得细胞内通路。已显示as1411在过表达核仁素的广泛癌细胞系中展现出抗增殖活性(表1)。
表1.过表达核仁素和/或在核仁素抑制后被杀死的癌细胞系
来自as1411的nci肿瘤细胞系筛选的数据(在6.3μm时，≥50％生长抑制)。(bates等人,2009)。
抗核仁素抗体也可利用质膜核仁素的穿梭功能，并且在与细胞表面核仁素结合后内化。这表明抗核仁素抗体可通过细胞内机制和/或抗体依赖性细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdcc)引发抗肿瘤作用。
1c.抗体或其片段
在一些实施方案中，本文公开的任何方法可以用抗核仁素抗体或其片段实施。在一些实施方案中，抗核仁素抗体或其片段用于检测在其表面表达核仁素的细胞。在一些实施方案中，抗核仁素抗体或其片段用于抑制或杀死在其表面表达核仁素的细胞。在一些实施方案中，抗核仁素抗体或其片段用于治疗或预防肿瘤疾病(例如，癌症)、自身免疫性疾病、炎性疾病或病况、呼吸系统疾病、病毒感染或黄斑变性。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体或其片段与毒素、化学治疗剂、免疫刺激性核酸序列(例如，cpg序列)、放射性核素或免疫治疗剂缀合、连接或融合。在一些实施方案中，抗核仁素抗体或其片段与放射性核素、荧光基团、化学发光化合物、荧光化合物或酶缀合、连接或融合。在一些实施方案中，抗核仁素抗体或其片段用于接触在细胞表面表达核仁素的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是癌前细胞、癌细胞或免疫细胞。
在一些实施方案中，其抗核仁素抗体片段是人抗核仁素抗体或片段。在一些实施方案中，其抗核仁素抗体片段是其非人抗核仁素抗体片段。在一些实施方案中，其抗核仁素抗体片段是其嵌合抗核仁素抗体片段。在一些实施方案中，其抗核仁素抗体片段是其人源化抗核仁素抗体片段。
在一些实施方案中，其抗核仁素抗体片段由抗核仁素抗体生成。在一些实施方案中，所述抗核仁素抗体片段与作为亲本抗体的核仁素具有相同的结合特异性。在一些实施方案中，所述抗核仁素抗体片段与作为亲本抗体的核仁素具有改善的结合特异性。在一些实施方案中，所述抗核仁素抗体片段与作为亲本抗体的核仁素具有相同的结合亲和力。在一些实施方案中，所述抗核仁素抗体片段与作为亲本抗体的核仁素具有改善的亲和力。在一些实施方案中，抗核仁素抗体或其片段是抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)片段。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分或其抗原结合区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2或fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为"fab"片段(每个片段具有单个抗原结合位点)，以及残留的"fc"片段，其名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
"fv"是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一些实施方案中，双链fv物质由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体组成。在单链fv(scfv)物质中，一个重链和一个轻链可变区可以通过弹性肽连接体共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链fv物质的"二聚体"结构缔合。在该构型中，每个可变区的三个hvr相互作用以在vh-vl二聚体表面上限定抗原结合位点。总体来说，六个hvr赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或仅包含三个抗原特异性hvr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
fab片段含有重链和轻链可变区，并且还含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端添加了少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh在本文中是指这样的fab'，其中恒定域的半胱氨酸残基带有游离巯基基团。f(ab')2抗体片段最初是作为fab'片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
"单链fv"或"scfv"抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scfv多肽进一步包含vh与vl结构域之间的多肽连接体，其使得scfv能够形成用于抗原结合所需的结构。关于scfv的综述，参见，例如，pluckthun,inthepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburg和moore编,(springer-verlag,newyork,1994),pp.269-315。
术语"双抗体"是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含与同一多肽链(vh-vl)中的轻链可变区(vl)连接的重链可变区(vh)。通过使用因太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的连接体，该结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更全面地描述于，例如，ep404,097；wo1993/01161；hudson等人,nat.med.9:129-134(2003)；和hollinger等人,pnasusa90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于hudson等人,nat.med.9:129-134(2003)。
如本文所用的术语"单克隆抗体"是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能突变(例如，自然发生的突变)之外，包含该群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语"单克隆"表示该抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，此类单克隆抗体通常包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合的多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合的多肽序列的方法获得。例如，选择过程可以是从多个克隆中选择独特的克隆，如b细胞或杂交瘤细胞克隆、噬菌体克隆或重组dna克隆的库。应当理解，可以进一步改变所选择的靶标结合序列，例如，以提高对靶标的亲和力、使靶标结合序列人源化、提高其在细胞培养中的产量、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含所改变的靶标结合序列的抗体也可以是单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体制剂可以是有利的，因为它们通常未被其他免疫球蛋白污染。
修饰语"单克隆"表示如从基本上均质的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本公开内容使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括，例如，杂交瘤细胞或b细胞方法(例如，kohler和milstein,nature,256:495-97(1975)；hongo等人,hybridoma,14(3):253-260(1995)、harlow等人,antibodies:alaboratorymanual,(coldspringharborlaboratorypress,第2版,1988)；hammerling等人,in:monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas563-681(elsevier,n.y.,1981))、重组dna方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见，例如，clackson等人,nature,352:624-628(1991)；marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1992)；sidhu等人,j.mol.biol.338(2):299-310(2004)；lee等人,j.mol.biol.340(5):1073-1093(2004)；fellouse,pnasusa101(34):12467-12472(2004)；和lee等人,j.immunol.methods284(1-2):119-132(2004))，以及用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见，例如，wo1998/24893；wo1996/34096；wo1996/33735；wo1991/10741；jakobovits等人,pnasusa90:2551(1993)；jakobovits等人,nature362:255-258(1993)；bruggemann等人,yearinimmunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；marks等人,bio/technology10:779-783(1992)；lonberg等人,nature368:856-859(1994)；morrison,nature368:812-813(1994)；fishwild等人,naturebiotechnol.14:845-851(1996)；neuberger,naturebiotechnol.14:826(1996)；以及lonberg和huszar,intern.rev.immunol.13:65-93(1995))。
修饰语"多克隆"表示如从非均质的抗体群体来源获得的抗体的特征。多克隆抗体包含超过一种抗体，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种抗体。
本文中的单克隆抗体包括人、非人、人源化和"嵌合"抗体。"嵌合"抗体(其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源)以及此类抗体的片段，只要它们展现出所需的生物活性(美国专利号4,816,567；和morrison等人,pnasusa81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括primatizedtm抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如具有感兴趣的抗原的免疫猕猴产生的抗体。
"人源化"形式的非人(例如，鼠)抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔子或具有所需特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(fr)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个(并且通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。对于进一步的详细说明，参见jones等人,nature321:522-525(1986)；riechmann等人,nature332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。还参见以下综述文章和其中引用的参考文献：vaswani和hamilton,ann.allergy,asthma&immunol.1:105-115(1998)；harris,biochem.soc.transactions23:1035-1038(1995)；hurle和gross,curr.op.biotech.5:428-433(1994)。
"人抗体"是具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人产生的和/或已使用本文公开的制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特异性地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库。hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等人,j.mol.biol.,222:581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的方法描述于cole等人,monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,p.77(1985)；boerner等人,j.immunol.,147(1):86-95(1991)。还参见vandijk和vandewinkel,curr.opin.pharmacol.,5:368-74(2001)。可以通过将抗原施用于转基因动物来制备人抗体，该转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击来产生此类抗体，而其内源性基因座已被禁用，例如，免疫的转基因鼠(参见，例如，有关xenomouse.tm.技术的美国专利号6,075,181和6,150,584)。还参见，例如，有关通过人b细胞杂交瘤细胞技术生成人抗体的li等人,pnasusa,103:3557-3562(2006)。
2.ig轻链和重链的克隆和表达
可以采用各种方法来克隆和表达免疫球蛋白轻链和重链序列。通过引用并入本文的weltschof等人(1995)详细描述了本文的方法。可以克隆可变区或可变+恒定区。
在一些实施方案中，这些抗体可以通过wo2011/062997(通过引用以其全文并入本文)中描述的技术制备，例如就氨基酸序列而言，该技术允许人们直接鉴定、分离和表征来自使用人免疫细胞如扁桃体细胞制备的永生化抗体生成细胞的人抗核仁素抗体。
一些技术，如由takekoshi等人(2001)描述的技术，也是有用的。在该参考文献中，使用商业试剂盒(rneasymini试剂盒，qiagen)从丸化细胞中分离总细胞rna。使用随机9-聚体引物、核苷酸和逆转录酶(takara，rna-pcr试剂盒，ohtsu)，合成cdna，并用对免疫球蛋白(ig)特异性的重链和轻链引物，通过聚合酶链反应(pcr)进行扩增。采用“递降”pcr方案，即三个循环，每个循环在95℃下变性1min、退火1min以及在72℃下延伸2min，总共11个循环。退火温度在65-55℃之间变化，步长为1℃。递降循环之后是使用55℃的退火温度的25个循环。将得到的pcr产物在琼脂糖中凝胶纯化，并使用qiaquick旋柱(qiagen)提取。然后将轻链和重链fc基因克隆到表达载体pfab1-his2的nhei/asci和sfii/noti位点。将具有轻链(κ和λ)和fc重链基因(γ和μ)的连接的pfab1-his2载体引入感受态的大肠杆菌jm109细胞(toyobo，osaka)。转化后，将大肠杆菌细胞接种到luria-bertani(lb)/氨苄青霉素(50μg/ml)板上。将分离的细菌菌落在具有氨苄青霉素(50μg/ml)和mgcl2(1.5mm)的2ml的superbroth(sb)中于30℃下温育。使用异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)来诱导fab蛋白的产生。将来自细菌培养物的细胞沉淀压成丸，用蛋白酶抑制剂混合物(complete，boehringermannheim)重悬于0.3ml的b-per(pierce)中，并在室温下摇动5min。将细胞裂解物在15,000g下离心10min，并收集含有fab抗体部分的所得上清液。
在一些实施方案中，重链和轻链可以在同一克隆构建体中。在一些实施方案中，重链和轻链在不同的克隆构建体中发现。可以同时克隆含有重链基因、轻链基因或其任何组合的序列的构建体。同时克隆可包括同时引入含有重链和轻链基因二者的载体或两个单独的载体，每个单独的载体含有重链或轻链。在一些实施方案中，可以顺序克隆含有重链基因、轻链基因或其任何组合的序列的构建体。顺序克隆可包括引入含有重链基因的载体，随后引入含有轻链基因的第二载体。例如，可以用含有重链和轻链二者的基因序列的载体对细胞进行遗传修饰。
3.抗体生产
克隆后，可以将轻链和重链的核酸插入合适的表达载体中，并转移至支持抗体生产的宿主细胞(例如，抗体生成细胞)中。用于生产的示例性细胞系是293细胞、cho细胞、cos细胞或各种形式的骨髓瘤细胞，一些缺少igg。可以以两种基本方式利用这些细胞进行抗体(例如，人的和/或单克隆的)生产。首先，可将骨髓瘤或永生化细胞注射(通常注射到腹腔)到用于为原始融合提供体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容性动物(例如，同系小鼠)中，或注射到免疫缺陷动物中以注射不相容细胞。任选地，在注射之前，用烃，尤其是如姥鲛烷(四甲基十五烷)的油使动物致敏。注射的动物产生分泌由转染的骨髓瘤产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后可以抽出动物的体液，如血清或腹水，以提供高浓度的抗体(例如，人的和/或单克隆的)。其次，可以在体外培养单个细胞系，其中将抗体(例如，人的和/或单克隆的)自然地分泌到培养基中，从中可以容易地获得高浓度的抗体。
如果需要，可以使用超滤、离心和各种色谱方法如hplc、亲和色谱法或离子交换色谱法对通过任一种方法产生的抗体(例如，人的和/或单克隆的)进行进一步纯化。本公开内容的单克隆抗体的片段可以从通过包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通过化学还原裂解二硫键的方法如此产生的单克隆抗体中获得。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)由永生化b细胞(例如，人b细胞)产生。在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)使用如通过引用以其全文并入本文的pct/us2008/072124或美国专利申请12/671,936中所述的方法产生。
在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的cdna可以通过从产生抗体同源物的杂交瘤细胞(通过融合特异性抗原生成b细胞和骨髓瘤细胞)中克隆编码的抗核仁素抗体的免疫球蛋白轻链和重链的cdna或基因组dna来产生。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)由b细胞(例如，人b细胞)产生。在一些实施方案中，通过从b细胞(例如，人b细胞)分离的一种或多种多核苷酸序列转染细胞，其中所述多核苷酸序列编码抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)。可以将编码多肽的cdna或基因组dna插入表达载体中，使得两个基因与它们自己的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。然后可以选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。在一些实施方案中，单独的表达载体用于重链和轻链抗体。
原核或真核细胞可用作表达宿主。在真核宿主细胞中的表达可能是合适的，因为这样的细胞比原核细胞更有可能组装和分泌正确折叠且免疫活性的抗体。然而，根据众所周知的方法(kim和baldwin,1982)，由于不适当的折叠而产生的任何无活性的抗体可以是可复性的。宿主细胞将可能产生完整抗体的一部分，如轻链二聚体或重链二聚体，其也是根据本公开内容的抗体同源物。
应当理解，上述程序的变化在本公开内容的范围内。在一些实施方案中，用编码抗体同源物的轻链或重链(但不是两者)的dna转化宿主细胞。重组dna技术也可用于去除编码对于核仁素结合不必要的轻链和重链中任一个或两个的dna的一些或全部。由这种截短的dna分子表达的分子是抗体同源物。在一些实施方案中，产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的同源物，而另一条重链和轻链对核仁素以外的抗原或核仁素的另一个表位具有特异性。
在一些实施方案中，将编码分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的dna转移至哺乳动物细胞系用于以“生产”或商业量表达。人们早就认识到，中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)是重组或非内源dna的优良表达媒介物。参见美国专利4,816,567。已经开发了一系列dhfr缺陷型cho细胞株，其允许扩增编码特定蛋白质或dna序列的插入dna，如美国专利5,981,214中所述。用于以“生产”或商业量表达的另外的哺乳动物细胞系的实例包括但不限于293hek细胞、hela细胞、cos细胞、nih3t3细胞、jurkat细胞、nso细胞和huvec细胞。适用于表达重组蛋白的其他哺乳动物细胞系已在文献中鉴定，并且可以同样适用于本申请的公开内容。
4.抗体的修饰
在一些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。变体通常在一个或多个置换、缺失、添加和/或插入方面不同于本文具体公开的多肽。此类变体可以是天然存在的或可以是合成生成的，例如，通过修饰一种或多种上述多肽序列并评估如本文所述多肽的一种或多种生物活性以及/或者使用本领域熟知的许多技术中的任何技术。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过多肽合成来制备。此类修饰包括，例如，抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合和/或效力。
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。通过置换进行诱变的感兴趣的位点包括cdr和构架(fr)。可以将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中并筛选出所需活性的产物，例如保留/改善抗原结合、降低免疫原性或改善adcc或cdc。氨基酸置换的非限制性实例如表2所示。
表2.氨基酸置换的实例
疏水性氨基酸包括：正亮氨酸、met、ala、val、leu和ile。中性亲水性氨基酸包括：cys、ser、thr、asn和gln。酸性氨基酸包括：asp和glu。碱性氨基酸包括：his、lys和arg。具有影响链取向的残基的氨基酸包括：gly和pro。芳香族氨基酸包括：trp、tyr和phe。
在一些实施方案中，置换、插入或缺失，例如，通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，可以在恒定区或一个或多个cdr内发生，其中所述置换、插入或缺失基本上不会降低抗体与抗原的结合。例如，可以在cdr中进行基本上不降低结合亲和力的保守置换。这种改变可能在cdr“热点”或sdr之外。在变体vh和vl序列的一些实施方案中，每个cdr未改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
可以在cdr中进行改变(例如，置换)，例如通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，以提高抗体亲和力。这种改变可以在体细胞成熟过程中具有高突变率的cdr编码密码子中进行。(参见，例如，chowdhury,methodsmol.biol.207:179-196(2008)),并且可以检测所得变体的结合亲和力。亲和力成熟(例如，使用易错pcr、链改组、cdr的随机化或寡核苷酸定向诱变)可用于改善抗体亲和力(参见，例如，hoogenboom等人inmethodsinmolecularbiology178:1-37(2001))。参与抗原结合的cdr残基可以进行特异性鉴定，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模(参见，例如，cunninghamandwellsscience,244:1081-1085(1989))。通常靶向cdr-h3和cdr-l3。在一些实施方案中，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。可以靶向或消除这类接触残基和邻近残基作为置换候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的性质。
氨基酸序列插入和缺失包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入和缺失。末端插入的实例包括具有n-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的n-或c-末端与酶(例如，对于adept)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。抗体分子的序列内插入变体的实例包括在轻链中插入3个氨基酸。末端缺失的实例包括在轻链末端缺失7个或更少氨基酸的抗体。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体可被配制为免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，如在epstein等人(1985)；hwang等人(1980)；和美国专利4,485,045和4,544,545中所述。美国专利5,013,556中公开了具有增加的循环时间的脂质体。
可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物生成有用的脂质体。通过限定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。本公开内容的抗体的fab'片段可以通过二硫化物交换反应与如在martin等人(1982)中所述的脂质体缀合。化学治疗剂(例如多柔比星)任选地包含在脂质体内。参见gabizon等人(1989)。
在一些实施方案中，通过将抗体与前药活化酶缀合而在adept中使用抗核仁素抗体，该前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗药物，参见wo81/01145)转化为活性药物。参见，例如，wo88/07378和美国专利4,975,278。可用于adept的免疫缀合物的酶组分包括能够以这样的方式作用于前药的任何酶，以便将其转化为展现出所需生物学性质的更有活性的形式。
可以有用的酶包括但不限于碱性磷酸酶，可用于将含有磷酸盐的前药转化成游离药物；芳基硫酸酯酶，可用于将含有硫酸盐的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，可用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶b和l)，其可用于将含有肽的前药转化为游离药物；d-丙氨酰羧肽酶，可用于转化含有d-氨基酸取代基的前药；碳水化合物切割酶如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，可用于将糖基化的前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素v酰胺酶或青霉素g酰胺酶，分别可用于在其胺氮处用苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物。在一些实施方案中，具有酶活性的抗体(本领域也称为“抗体酶”)可用于将本公开内容的前药转化为游离活性药物(参见，例如，massey,1987)。抗体-抗体酶缀合物可如本文所述制备，用于将抗体酶递送至所需的细胞群体。
酶可以通过本领域熟知的技术(如使用上文讨论的异型双功能交联剂)与抗核仁素抗体共价结合。在一些实施方案中，可以使用本领域熟知的重组dna技术(参见，例如，neuberger等人,1984)构建融合蛋白，该融合蛋白至少包含与本公开内容的酶的至少功能活性部分相连的本公开内容的抗体的抗原结合区。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体包含抗体片段，而不是完整抗体。在这种情况下，可以修饰抗体片段，以便增加其血清半衰期。例如，这可以通过将补救受体结合表位掺入抗体片段中来实现(例如，通过抗体片段中的适当区域的突变或通过将表位掺入肽标签中，然后该肽标签在任一端或中间处与抗体片段融合，例如，通过dna或多肽合成)。参见1996年10月17日公开的wo96/32478。
补救受体结合表位通常构成其中将来自fc结构域的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基转移至抗体片段的类似位置的区域。例如，转移来自fc结构域的一个或两个环的三个或更多个残基。例如，表位取自fc区的ch2结构域(例如，igg)并转移至抗体的ch1、ch3或vh区，或超过一个这样的区域。例如，表位取自fc区的ch2结构域并转移至抗体片段的cl区或vl区或二者。
在一些实施方案中，通过共价连接修饰抗核仁素抗体。共价连接可包括但不限于通过化学合成或通过抗体的酶促或化学切割。通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与选择的侧链或n-或c-末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体的其他类型的共价修饰引入分子中。多肽的示例性共价修饰描述于美国专利5,534,615中，其通过引用明确并入本文。抗体的一种类型的共价修饰包括将抗体以美国专利
4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式，与多种非蛋白质聚合物中的一种(例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)连接。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(如人抗体)通过将其与另一种异源多肽或氨基酸序列缀合进行修饰。在一些实施方案中，将抗核仁素抗体(如人抗体)修饰为包含靶向免疫缀合物部分，该部分能够有效生成针对肿瘤或病原体的先天性和适应性免疫应答。在一些实施方案中，将分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)修饰为包含靶向免疫缀合物部分，该部分能够有效生成针对肿瘤或病原体的先天性和适应性免疫应答。在一些实施方案中，将由b细胞(例如，人b细胞)产生的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)修饰为包含靶向免疫缀合物部分，该部分能够有效生成针对肿瘤或病原体的先天性和适应性免疫应答。免疫缀合物可以能够同时满足增加针对靶向肿瘤或病原体的有效抗体和/或细胞介导的免疫应答的多个关键要求，其包括但不限于：(i)通过抗原递呈细胞(apc)/树突状细胞(dc)诱导或增加肿瘤或病原体抗原或抗原决定簇的摄取和交叉递呈；(ii)促进靶细胞环境中树突状细胞(dc)的成熟；(iii)提供cd4+t细胞有助于生成cd8+t细胞记忆和针对肿瘤或病原体的抗体；(iv)使靶向肿瘤细胞对抗体依赖性细胞毒性(adcc)和t细胞介导的细胞死亡敏感。此类免疫缀合的抗体可用于靶向免疫疗法或免疫预防肿瘤疾病、传染性疾病和其他病症。例如，模式识别受体(prrs)，如toll样受体，识别由多种传染性微生物(细菌、真菌、原生动物、病毒)表达的病原体相关分子模式(pamp)以及由受损宿主组织释放的分子(损伤相关分子模式/警报)。添加与分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)缀合的pamp提供了包含被prr识别的核酸或蛋白质的部分，最终导致消除与抗核仁素抗体结合的靶细胞的免疫应答。可以与抗核仁素抗体缀合的pamps的实例包括但不限于已知的病毒和致病表位，如聚肌苷-聚胞苷酸、脂多糖(lps)、脂质a、鞭毛蛋白、富含gu的短单链rna、未甲基化的cpg-寡脱氧核苷酸。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(如人抗体)通过将其与另一种异源多肽或氨基酸序列融合或缀合进行修饰。在一些实施方案中，抗核仁素抗体(如人抗体)与标签多肽融合或缀合，该标签多肽提供抗标签抗体可选择性与其结合的表位。表位标签可以置于抗核仁素抗体的氨基或羧基末端。这种表位标记形式的抗核仁素抗体的存在可以使用针对标签多肽的抗体检测。此外，提供表位标签使得抗核仁素抗体能够通过使用抗标签抗体或与表位标签结合的另一种类型的亲和基质的亲和纯化而容易地纯化。各种标签多肽及其各自的抗体是本领域熟知的。实例包括聚组氨酸(poly-his)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感ha标签及其抗体12ca5(field等人,1988)；c-myc标签及其8f9、3c7、6e10、g4、b7和9e10抗体(evan等人,1985)；以及单纯疱疹病毒糖蛋白d(gd)标签及其抗体(paborsky等人,1990)。其他标签多肽包括flag-肽(hopp等人,1988)；kt3表位肽(martin等人,1992)；α-微管蛋白表位肽(skinner等人,1991)；以及t7基因10蛋白肽标签(lutz-freyermuth等人,1990)。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)或片段与纳米颗粒连接。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与纳米颗粒连接。在一些实施方案中，由b细胞(例如，人b细胞)产生的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与纳米颗粒连接。据报道，细胞表面核仁素可作为由聚乙二醇化的聚赖氨酸和dna组成的dna纳米颗粒的受体(chen等人,2008)。在一些实施方案中，抗体-纳米颗粒缀合物可以比未缀合的抗体更快速和更广泛地渗透在其表面上表达核仁素的细胞。在一些实施方案中，细胞是癌细胞、肿瘤细胞、病毒感染的细胞、淋巴细胞或活化的淋巴细胞。
5.治疗应用
5.1抗核仁素抗体
在一些实施方案中，提供了可用于抑制或杀死癌细胞的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)。在一些实施方案中，提供了可用于抑制或杀死癌细胞的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)。在一些实施方案中，提供了可用于抑制或杀死癌细胞的由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)。在一些实施方案中，所述癌细胞在其表面上或其细胞质中表达核仁素。下文描述了可被抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)抑制或杀死的癌细胞的实例。
在一些实施方案中，与未暴露于抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的细胞相比，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于将受试者样品中癌细胞的细胞活力降低30％至80％。在一些实施方案中，与未暴露于抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的细胞相比，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于将受试者样品中癌细胞的细胞活力降低30％至80％。在一些实施方案中，提供了从b细胞(例如，人b细胞)产生的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，并且与未暴露于抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的细胞相比，用于将受试者样品中癌细胞的细胞活力降低30％至80％。
在一些实施方案中，与未暴露于抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的细胞相比，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于将受试者中癌细胞的细胞活力降低30％至80％。在一些实施方案中，与未暴露于抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的细胞相比，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于将受试者中癌细胞的细胞活力降低30％至80％。在一些实施方案中，提供了从b细胞(例如，人b细胞)产生的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，并且与未暴露于抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的细胞相比，用于将受试者中癌细胞的细胞活力降低30％至80％。
在一些实施方案中，将抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)施用于患有一种或多种癌症形式的人类受试者。在一些实施方案中，将分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)施用于患有一种或多种癌症形式的人类受试者。在一些实施方案中，至少一种癌症形式由抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)抑制或杀死。在一些实施方案中，将分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)施用于人类受试者，其中所述癌症对其他癌症治疗具有抗性。在一些实施方案中，提供了从b细胞(例如，人b细胞)产生的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)并将其施用于人类受试者，其中所述癌症对其他癌症治疗具有抗性。例如，癌症可对放射疗法、化学疗法或生物疗法具有抗性。在一些实施方案中，人类受试者的免疫系统对分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)比对分离的非抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的抗体)更耐受。在一些实施方案中，人类受试者的免疫系统对分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)比对分离的人源化抗核仁素抗体更耐受。在一些实施方案中，人类受试者的免疫系统对分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)比对分离的嵌合抗核仁素抗体更耐受。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)作为辅助疗法的一部分用于抑制或杀死细胞。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)作为辅助疗法的一部分用于抑制或杀死细胞。在一些实施方案中，提供了由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)并用作辅助疗法的一部分。辅助疗法可包括化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法或生物疗法。本文所用的辅助疗法是指在初次治疗后给予的治疗，以降低癌症复发的风险。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与辅助疗法联合使用，用于抑制或杀死细胞。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与辅助疗法联合使用，用于抑制或杀死细胞。在一些实施方案中，提供了由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)作为辅助疗法的一部分。辅助疗法可包括化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法或生物疗法。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于抑制或杀死非恶性细胞增殖性病症的细胞，其中核仁素在细胞表面上或在细胞质中表达。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于抑制或杀死非恶性细胞增殖性病症的细胞，其中核仁素在细胞表面上或在细胞质中表达。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)由b细胞(例如，人b细胞)表达。例如，可用抗核仁素抗体治疗或抑制的非恶性细胞增殖性病症的具体非限制性实例包括但不限于疣、良性前列腺增生、皮赘和非恶性肿瘤。例如，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)可用于通过靶向表征这种去除条件的不良细胞来确定此类细胞增殖性病症，如良性前列腺增生或有害的生殖器疣。核仁素在肿瘤内皮细胞的细胞表面上的表达已被证明是肿瘤血管生成的独特标志物(christian等人,2003)。在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在受试者中抑制或杀死包含血管生成肿瘤的细胞。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在受试者中抑制或杀死包含血管生成肿瘤的细胞。在一些实施方案中，提供了由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，其可在受试者中抑制或杀死包含血管生成肿瘤的细胞。本文所用的血管生成肿瘤是具有血管网络增殖的肿瘤细胞，该血管网络渗透到癌性生长中，提供营养和氧气并去除废物。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在肿瘤低氧条件下在受试者中抑制或杀死肿瘤细胞。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在肿瘤低氧条件下在受试者中抑制或杀死肿瘤细胞。在一些实施方案中，提供了由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，其可以在肿瘤低氧条件下在受试者中抑制或杀死肿瘤细胞。在肿瘤细胞被剥夺氧气的情况下发生肿瘤低氧。肿瘤低氧可能是在肿瘤组织中经历高度细胞增殖，从而导致更高的细胞密度的结果，并且因此对局部供养造成负担。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在受试者中抑制或杀死在其表面上表达核仁素的淋巴细胞。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在受试者中抑制或杀死在其表面上表达核仁素的淋巴细胞。在一些实施方案中，提供了由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，其可用于在受试者中抑制或杀死在其表面上表达核仁素的淋巴细胞。在一些实施方案中，该淋巴细胞包含b细胞、t细胞或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，该淋巴细胞包含cd4阳性或cd8阳性细胞。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在受试者中抑制或杀死在其表面上表达核仁素的活化的淋巴细胞或记忆细胞。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于在受试者中抑制或杀死在其表面上表达核仁素的活化的淋巴细胞或记忆细胞。在一些实施方案中，提供了由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，其可用于在受试者中抑制或杀死在其表面上表达核仁素的活化的淋巴细胞或记忆细胞。在进一步的实施方案中，该活化的淋巴细胞包含活化的b细胞、t细胞或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于抑制或杀死患有自身免疫性病症的受试者中的细胞。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于抑制或杀死患有自身免疫性病症的受试者中的细胞。在一些实施方案中，提供了由b细胞(例如，人b细胞)表达的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)，其可用于抑制或杀死患有自身免疫性病症的受试者中的细胞，包括但不限于斑秃(alopeciagreata)、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病(autoimmuneaddison'sdisease)、哮喘、肾上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞氏病(behcet'sdisease)、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻皮炎(celiacsprue-dermatitis)、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(cfids)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、churg-strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、crest综合征、冷凝集素病、克罗恩病(crohn'sdisease)、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、糖尿病、1型糖尿病、糖尿病视网膜病变、嗜酸性筋膜炎、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(graves'disease)、格林-巴利综合征(guillain-barre)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto'sthyroiditis)、亨-舍二氏紫癜(henoch-schonleinpurpura)、特发性肺纤维化、特发性/自身免疫性血小板减少性紫癜(itp)、iga神经病、幼年型关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮(lupuserthematosus)、梅尼埃病(meniere'sdisease)、混合性结缔组织病、多发性硬化症、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、天疱疮相关病症(例如，寻常型天疱疮)、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺现象(raynaud’sphenomenon)、莱特尔综合征(reiter'ssyndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征(sjogren'ssyndrome)、僵人综合征、系统性红斑狼疮(sle)、sweet综合征、斯蒂尔病(still'sdisease)、红斑狼疮(lupuserythematosus,)、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎如疱疹样皮炎血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿(wegener'sgranulomatosis)。炎性病症的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺疾病(copd)、变态反应性病症、感染性休克、肺纤维化，未分化的脊柱关节病、未分化的关节病、关节炎，炎性骨溶解、移植物抗宿主病、荨麻疹、伏格特-小柳-原田三氏综合征(vogt-koyanagi-haredasyndrome)、慢性炎性肺炎和由慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。
在一些实施方案中，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)或片段用于抑制或杀死由病毒感染的受试者中的细胞，包括但不限于用以下病毒感染的细胞：逆转录病毒科(例如，人免疫缺陷病毒，如hiv-1(也称为htlv-iii、lav或htlv-iii/lav或hiv-iii)；和其他分离株，如hiv-lp)；小核糖核酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如，引起胃肠炎的菌株)；披膜病毒科(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒科(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如，流感病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒、布尼亚病毒(bungaviruses)、白蛉热病毒和内罗病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双rna病毒科；嗜肝dna病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(hsv)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒)；劳斯肉瘤病毒(rsv)、禽白血病病毒(alv)和禽类成髓细胞瘤病毒(amv))和c型b组(包括猫白血病病毒(felv)、长臂猿白血病病毒(galv)、脾坏死病毒(snv)、网状内皮组织增殖病病毒(rv)和猿猴肉瘤病毒(ssv))、d型逆转录病毒(包括mason-pfizer猴病毒(mpmv)和猴逆转录病毒1型(srv-1))、复杂的逆转录病毒(包括慢病毒亚群、t细胞白血病病毒和泡沫病毒)、慢病毒属(包括hiv-1、hiv-2、siv、绵羊髓鞘脱落病毒(visnavirus)、猫免疫缺陷病毒(fiv)和马传染性贫血病毒(eiav)、猿猴t细胞白血病病毒(stlv)和牛白血病病毒(blv))、泡沫病毒(包括人泡沫病毒(hfv)、猴泡沫病毒(sfv)和牛泡沫病毒(bfv))、痘病毒科(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如，非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体、δ肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷体)、非a、非b型肝炎的病原体(1类＝内部传播；2类＝肠胃外传播(即，丙型肝炎))；诺瓦克和相关病毒以及星形病毒)、分枝杆菌属(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌、麻风杆菌)、肺炎球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、白喉、李斯特菌属、丹毒丝菌属、炭疽、破伤风、梭菌属、混合厌氧菌、奈瑟菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、嗜血杆菌属、大肠杆菌、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、假单胞菌属、土拉巴斯德氏菌(pasteurellatularensis)、耶尔森菌属、霍乱弧菌、巴尔通体属、军团菌属、螺旋体属(密螺旋体、钩端螺旋体、疏螺旋体)、真菌、放线菌属、立克次体属、支原体、衣原体、原生动物(包括内阿米巴属、疟原虫、利什曼原虫、锥虫、弓形虫、肺孢子虫、巴贝虫、贾第虫属、隐孢子虫、毛滴虫)、蠕虫(旋毛虫、吴策线虫、盘尾丝虫属、血吸虫、线虫、绦虫、吸虫)和病毒性肺炎。可以作为本公开内容的组合物的靶标的抗原的另外的实例是已知的，如在美国专利公开号2007/0066554中公开的抗原。在进一步的方面，缀合物可包含如本文所述的抗原或细胞组分，但是除了靶向部分和免疫刺激核酸分子之外。
5.2.抗体缀合物
在一些实施方案中，本公开内容提供与至少一种治疗剂连接以形成抗体缀合物的分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)。在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与至少一种治疗剂(如分子或部分)连接或共价结合或复合。治疗剂包含具有所需活性(例如，细胞毒活性)的分子。在一些实施方案中，可以与抗体附接的治疗剂包括但不限于毒素(如催化地抑制蛋白质合成的延伸步骤的肽免疫毒素)、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性核素、抗病毒剂、如本文所述的螯合剂、细胞因子、生长因子或寡核苷酸或多核苷酸。
在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与酶活性毒素或其片段缀合。酶活性毒素及其片段的实例包括但不限于白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素a链、相思豆毒素a链、莫迪素a链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白，美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、美洲商陆抗病毒蛋白、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素、卡利奇霉素或单端孢霉烯类。
在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与放射性核素缀合。合适的放射性核素的实例包括但不限于124锑、125锑、74砷、211砹、103钡、140钡、7铍、206铋，207铋、212bi、109镉、115镉、45钙、14碳、139铈、141铈、144铈、137铯、51铬、36氯、56钴、57钴、58钴、60钴、67铜、169铒、152铕、67镓、153钆、195金、199金、175铪、175+181铪、181铪、3氢、123碘、125碘、131碘、111铟、131in、192铱、55铁、59铁、85氪、210铅、177镥、54锰、197汞、203汞、99钼、147钕、237镎、63镍、95铌、185+191锇、103钯、32磷、184铂、143镨、147钷、233镤、226镭、186铼、188铼、86铷、130钌、106钌、44钪、46钪、45硒、75硒、110m银、111银、22钠、85锶、89锶、90锶、35硫、182钽、99m锝、125m碲、132碲、160铽、204铊、228钍、232钍、170铥、113锡、44钛、185钨、48钒、49钒、88钇、90钇、91钇、169镱、65锌和/或95锆。
抗体与细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂制备，如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)、亚氨基四氢噻吩(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二亚酰胺hcl)、活性酯(如双琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对-重氮基苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯-2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如vitetta等人(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见wo94/11026。
在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与细胞因子缀合。术语“细胞因子”是由作为细胞间介质作用于另一种细胞的一种细胞群体释放的蛋白质的通用术语。这类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。所述细胞因子中包括生长激素如人生长激素、n-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和黄体生成素(lh)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；泌乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(tpo)；神经生长因子如ngf-β；血小板生长因子；转化生长因子(tgfs)如tgf-α和tgf-β；胰岛素样生长因子-i和-ii；促红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(csfs)，如巨噬细胞-csf(m-csf)；粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)；和粒细胞-csf(g-csf)；白细胞介素(ils)如il-1、il-1a、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-11、il-12；和其他多肽因子(包括lif和kit配体(kl))。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与化学治疗剂缀合。多种化学化合物，也称为“化学治疗剂”，起到诱导dna损伤的作用。适合于与分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)缀合的化学治疗剂的类别包括但不限于烷化剂、蒽环类、细胞骨架破坏剂、埃博霉素、拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂、核苷和核苷酸类似物和前体类似物、肽抗生素、基于铂的药剂、类维生素a或长春花生物碱及衍生物。这些组中的特定化学治疗剂包括但不限于放线菌素-d、全反式视黄酸阿扎胞苷、阿霉素硫唑嘌呤、博莱霉素、喜树碱、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛(docetaxel)、去氧氟尿苷、多柔比星、表柔比星、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5fu)、吉西他滨、羟基脲、过氧化氢、伊达比星、伊马替尼、氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素c、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨。本公开内容还包括使用一种或多种dna损伤剂的组合，无论是基于辐射的化合物还是实际的化合物，例如x射线与顺铂的使用或顺铂与依托泊苷的使用。
在一些实施方案中，分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)与抗病毒剂缀合。可与分离的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)一起使用的抗病毒剂的实例包括但不限于底物和底物类似物、抑制剂和严重损害、衰弱或以其他方式破坏病毒感染的细胞的其他药剂。底物类似物包括氨基酸和核苷类似物。底物可与毒素或其他杀病毒物质缀合。抑制剂包括整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂和转录酶抑制剂如逆转录酶抑制剂。
5.3.药物组合物和施用
可以设想为了向有需要的受试者施用，抗体将悬浮在适合于向宿主施用的组合物中。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体抗体是抗核仁素抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗核仁素抗体是人源单克隆抗核仁素抗体。本公开内容的水性组合物包含分散在药学上可接受的组合物和/或水性介质中的有效量的抗体。短语“药学上和/或药理学上可接受的”是指在适当地施用于动物，并且特别是施用于人时，不产生不良反应、变态反应和/或其他不利反应的组合物。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和/或抗真菌剂、等渗和/或吸收延缓剂等。这类介质或药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。也可将补充的活性成分掺入组合物中。对于向人体施用，制剂应符合fda生物制品标准办公室所要求的无菌、致热原性、一般安全性和/或纯度标准。
在一些实施方案中，本公开内容的抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)可以在任何无菌的、生物相容的药物载体中给药，包括但不限于生理盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。这些分子中的任何一种可在药物组合物中单独或者与其他药剂、药物或激素联合施用于患者，其中该药物组合物与合适的赋形剂、佐剂和/药学上可接受的载体混合。在本公开内容的一些实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。
药物组合物的施用通过口服或胃肠外完成。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内(例如，直接至肿瘤)、肌内、皮下、髓内、鞘内、脑室内、静脉内、腹腔内或鼻内施用。除了活性成分之外，这些药物组合物可含有合适的药学上可接受的载体，该药学上可接受的载体包含赋形剂和其他促进将活性化合物加工成可药学上使用的制剂的化合物。有关制剂和施用技术的进一步细节可在最新版的“remington’spharmaceuticalsciences”(maackpublishingco，eastonpa.)中找到。可将抗体组合物冻干。抗体组合物可以是水性抗体。用于体内施用的组合物通常是无菌的(例如，通过无菌滤膜过滤)。
一些组合物可适合于靶向递送至受试者的脑或脑脊液。组合物可以基本上不含防腐剂。一些组合物稳定至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月或至少约30个月。一些组合物在约-80℃至约40℃、约0℃至约25℃、约0℃至约10℃，如约-80℃至约-50℃或约2℃至约8℃下稳定。
用于口服施用的药物组合物可以使用本领域熟知的药学上可接受的载体以适合于口服施用的剂量进行配制。这类载体使得药物组合物能够配制成适合于患者摄取的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。参见pct公开wo93/23572。
用于口服使用的药物制剂可以通过活性化合物与固体赋形剂的组合，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，在添加合适的另外的化合物后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心来获得。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白填充剂，包括但不限于糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和植物胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白质如明胶和胶原蛋白。如果需要，可以添加崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠。
为糖衣丸核心提供合适的包衣如浓缩糖溶液，其也可含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素添加至片剂或糖衣丸包衣中以用于产品鉴定或表征活性化合物的量(即，剂量)。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入式胶囊，以及由明胶和包衣(如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。推入式胶囊可含有与填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体(如脂肪油、液体石蜡或具有或不具有稳定剂的液体聚乙二醇)中。
用于胃肠外施用的药物组合物包括活性化合物的水溶液。对于注射，本公开内容的药物组合物可以配制在水溶液中，例如在生理上相容的缓冲液如hank溶液、林格氏溶液(ringer'ssolution)或生理缓冲盐水中。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。另外，可将活性化合物的悬浮液制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。
对于局部或鼻腔施用，在组合物中使用适合于待渗透的特定屏障的渗透剂。这类渗透剂在本领域中通常是已知的。
本公开内容的药物组合物可以以与本领域已知的方式类似的方式制备(例如，通过常规混合、溶解、制粒、制糖衣、磨细、乳化、包封、包埋或冻干工艺)。
药物组合物可作为盐提供，并且可以用许多酸形成，包括但不限于用阴离子形成的盐，如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子，和用阳离子形成的盐，如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等形成的阳离子。盐倾向于更易溶于相应的游离碱形式的水性或其他质子溶剂中。在一些实施方案中，制剂可以是在1mm-50mm组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇中的冻干粉末，ph范围为4.5至5.5，其在使用前与缓冲液组合。
载体也可以是溶剂或分散介质，其包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、在分散的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚，山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，其可能适合包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)而引起可注射组合物的延长吸收。
适用于本公开内容使用的药物组合物包括其中活性成分以实现预期目的有效量包含在内的组合物。“治疗有效量”或“药理学有效量”是公认的短语，并且是指有效产生预期药理结果的药剂的量。因此，治疗有效量是足以改善所治疗疾病症状的量。确定给定应用的有效量(例如治疗有效量)的一种有用的测定方法是测量对细胞存活的影响。实际施用的量将取决于待施加治疗的个体，并且将可能是优化的量，使得实现预期效果而没有显著的副作用。
对于任何化合物，最初可以在细胞培养测定中或在任何合适的动物模型中估计治疗有效剂量。动物模型也用于获得所需的浓度范围和施用途径。然后，这些信息可用于确定人体施用的有效剂量和途径。
在动物中，“治疗有效量”是与不存在治疗的典型临床结果相比，由于治疗而导致改善的临床结果的化合物的量。“改善的临床结果”是指，例如，由于治疗而导致预期寿命更长、并发症更少、症状更少、身体不适更少和/或住院次数更少。改善的临床结果可以量化为在一定时间段内接受施用并改善其疾病状态的受试者的一定百分比。接受施用并改善其疾病状态的受试者的一定百分比可以是约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。接受施用并改善其疾病状态的受试者的一定百分比可以是约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或85％。接受施用并改善其疾病状态的受试者的一定百分比可以是约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。测定改善的临床结果的一定时间段可以是1、2、3、4、5、6或7天。测定改善的临床结果的一定时间段可以是1、2、3或4周。测定改善的临床结果的一定时间段可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。
关于癌症，“改善的临床结果”包括更长的预期寿命。它还可以包括减慢或阻止肿瘤的生长速率、引起肿瘤大小的缩小、转移率降低或生活质量改善(例如，身体不适减少或移动性增加)。
关于免疫系统的调节，“改善的临床结果”是指如果个体患有涉及免疫抑制的疾病，则个体中免疫应答程度增加。对于免疫系统受抑制的个体的“改善的临床结果”也可以指对传染性疾病较小的易感性。对于涉及过度活跃的免疫系统的疾病，“改善的临床结果”可以指免疫应答程度的降低。在两种情况下，如上所述，改善的临床结果还可涉及生活质量的改善。
确切的剂量由个体医师根据待治疗的患者选择。调整剂量和施用以提供足够水平的活性部分或维持所需效果。可以考虑的其他因素包括疾病状态的严重程度(例如，肿瘤大小和位置；患者的年龄、体重和性别；饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/应答)。施用可以是每天、每隔一天、每周、每隔一周、每月、每隔一月或其任何变化。包含抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的剂型的施用可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。包含抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的剂型的施用可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。包含抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的剂型的施用可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。包含抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的剂型的施用可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12年。一种或多种药剂(例如，抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的))与另一种药剂的施用可以是间歇性的；例如，施用可以是每两天一次、每三天一次、每五天一次、每周一次、每月一次或两次等。长效药物组合物可以取决于特定组合物的半衰期和清除率每3至4天、每周或每两周一次施用。文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导(参见美国专利4,657,760；5,206,344；和5,225,212，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，向患者施用包含抗核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)的组合物的剂量为约患者体重的0.1mg/kg至500mg/kg。不同形式的量、形式和/或总量可以在不同的施用时间下变化。
本文公开的抗体或组合物(和任何其他的治疗剂)可以通过任何合适的方式(包括胃肠外、肺内和鼻内)施用，并且如果需要局部治疗，病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药。例如，可以通过注射(例如，静脉内或皮下注射)给药。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在不同时间点上的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
本文公开的抗体可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用方案以及执业医师所知的其他因素。抗体不必是，而是任选地用一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药剂配制。这样的其他药剂的有效量取决于组合物中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或者以任何剂量和通过经验/临床确定为合适的任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本文公开的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是否用于预防或治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的应答以及主治医师的自由裁量权。将抗体一次或在一系列治疗中适当地施用于患者。约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)抗体可以是向患者施用的初始候选剂量(例如，通过一次或多次单独的施用或通过连续输注)。每日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于数天或更长时间的重复施用，通常持续治疗直至出现所需的感染或疾病症状的抑制。抗体的一个示例性剂量为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一种或多种剂量。这些剂量可以间歇施用(例如，每周或每三周)。可施用初始较高负荷剂量，随后一种或多种较低剂量。
通过以冻干组合物或水溶液的形式将具有所需纯度的这种抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合来制备如本文所述的抗体的药物组合物(参见，例如，remington'spharmaceuticalsciences第16版,osol,a.ed.(1980))。药学上可接受的载体通常在所用的剂量和浓度下对受体无毒。示例性的药学上可接受的载体包括缓冲液(例如，磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵)；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他糖类(例如，葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(例如，edta)；糖(例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)；成盐抗衡离子(例如，钠)；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂(例如，聚乙二醇(peg))。本文中示例性的药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂(例如，可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp))。在一个方面，shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(例如，软骨素酶)组合。
活性成分可以包埋在微囊(例如，羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯))中。活性成分可以包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中的微囊中。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实施包括含有所述抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质是成型制品(例如，薄膜或微囊)的形式。
在一些液体组合物中，抗体的浓度为约0.1mg/ml至约60mg/ml、约40mg/ml至约60mg/ml、约17mg/ml至约23mg/ml、约50mg/ml、约30mg/ml、约17mg/ml至约23mg/ml、约20mg/ml、约17mg/ml、约10mg/ml、约5mg/ml、约2mg/ml或1mg/ml。在一些组合物中，至少有一种张度剂(例如，d-甘露醇)并且以约1％w/v至约10％w/v、约2％w/v至约6％w/v或4％w/v的浓度存在。在一些组合物中，至少一种缓冲剂(例如，组氨酸、琥珀酸)以约0.1mm至约25mm、约5mm至约15mm、约5mm或约10mm的浓度存在。在一些组合物中，抗氧化剂(例如，甲硫氨酸)以约0.1mm至约25mm、约5mm至约15mm或约10mm的浓度存在。在一些组合物中，稳定剂(例如，聚山梨酯80)以约0.001％w/v至约0.01％w/v、约0.005％w/v至约0.01％w/v或约0.005％w/v的浓度存在。本文公开的组合物可具有约4至约8、约4.5至约7.5、约5至约7、约5.5至约6.5、约6.0至约6.5、约6.2、约6.0或约5.5的ph。
在一些实施方案中，本文公开的抗体在组合物中以约0.1mg/ml至约100mg/ml、约0.1mg/ml至约75mg/ml、约0.1mg/ml至约50mg/ml、约0.1mg/ml至约40mg/ml、约0.1mg/ml至约30mg/ml、约10mg/ml至约20mg/ml、约12mg/ml至约17mg/ml、约17mg/ml至约23mg/ml、约20mg/ml至30mg/ml或更高,例如,最高约100mg/ml、约200mg/ml、约500mg/ml或约1000mg/ml或更高存在。在各种实施方案中，抗体以约1、2、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或30mg/ml存在。旨在包括使用上述值的任何组合作为上限和/或下限的值的范围。
在一些实施方案中，本文公开的组合物对冷冻、冻干和/或重构是稳定的。此外，示例性实施方案在延长的时间段内是稳定的。例如，组合物稳定至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个月。在一些实施方案中，组合物稳定至少约12个月、至少约18个月、至少约24个月或至少约30个月。在一些实施方案中，组合物可储存在约-80℃至约40℃、约0℃至约25℃、约0℃至约15℃或约0℃至约10℃，例如约2℃至约8℃的温度下。在各种实施方案中，组合物可储存在约0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下。在一些实施方案中，组合物储存在约5℃下。通常，组合物是稳定的并且在这些范围内保持生物活性。上述温度中间的范围(例如，约2℃至约17℃)也旨在是本发明的一部分。例如，旨在包括使用上述值的任何组合作为上限和/或下限的值的范围。
剂量
组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可以治疗包括转基因哺乳动物在内的非人哺乳动物。需要滴定治疗剂量以优化安全性和疗效。
对于使用抗体的被动免疫，示例性剂量为约0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.15mg/kg至约3mg/kg、0.5mg/kg至约2mg/kg，例如约1mg/kg至约2mg/kg宿主体重。在一些示例性实施方案中，剂量可以为约0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1.0、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.75、1.8、1.9或2.0mg/kg。用于被动免疫的其他示例性剂量为约1mg/kg至20mg/kg。在一些示例性实施方案中，剂量可以为约5、10、15或20mg/kg。受试者可以每日、隔日、每周或根据经验分析确定的任何其他时间表施用这样的剂量。示例性治疗需要在延长的时期(例如，至少六个月)内以多剂量施用。另外的示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。示例性剂量方案包括连续日1-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，施用的每种抗体的剂量均落在所示的范围内。
通常多次施用抗体。单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测定患者体内抗体的血液水平所示，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调节剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到25-300μg/ml。在一些实施方案中，抗体可以作为缓释组合物施用，在这种情况下，需要较低频率的施用。剂量和频率根据患者中抗体的半衰期而变化。通常，人抗体显示出最长的半衰期，其次是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。
施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性的而变化。在预防性应用中，将含有本发明抗体或其混合物的组合物施用于尚未处于疾病状态的患者以增强患者的抵抗力。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在该用途中，精确量还取决于患者的健康状况和全身免疫力，但通常为每剂量0.1至25mg，特别是每剂量0.5至2.5mg。在较长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者在余生中持续接受治疗。
在一些治疗应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量(例如，每剂量约0.5或1至约200mg/kg抗体(例如0.5、1、1.5、2、5、10、20、25、50或100mg/kg)，其中更常使用5至25mg/kg的剂量)，直至疾病进展减少或终止，并且例如直至患者显示疾病症状部分或完全改善。此后，患者可以施用预防性方案。
特别有利的是提供单位剂型的组合物，以便于施用以及剂量的均匀性。组合物可以以胶囊、安瓿、冻干形式或在多剂量容器中呈现。术语“容器”是指某物，例如，保持器、接受器或器皿，物体或液体可放置或容纳在其中，例如，用于储存。单位剂型可包含本文所述的任何组合物，包括活性成分的悬浮液、溶液或乳液以及配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在一个示例性实施方案中，在施用于患者之前，例如通过静脉内输注，可以将药物剂量单位形式与合适的稀释剂(例如，无菌无热原的水或生理盐水溶液)一起添加至静脉内滴注袋(例如50ml、100ml或250ml或500ml滴注袋)中。一些药物单位剂型可能需要在添加至静脉内滴注袋之前用合适的稀释剂重构，例如冻干形式。在示例性实施方案中，药物单位剂型是含有本文所述组合物的容器。例如，容器可以是10ml玻璃、i型、管式小瓶。通常，容器应保持组合物的无菌性和稳定性。例如，可以用血清塞子封闭小瓶。此外，在各种实施方案中，容器应被设计成使得允许取出约100mg组合物或活性成分(例如，一次性使用)。在一些实施方案中，容器可适合于更大量的组合物或活性成分，例如，约10mg至约5000mg、约100mg至约1000mg以及约100mg至约500mg、约40mg至约250mg、约60mg至约80mg、约80mg至约120mg、约120mg至约160mg，或其范围或间隔，例如，约100mg至约200mg。上述量中间的范围(例如，约25mg至约195mg)也旨在是本发明的一部分。例如，旨在包括使用上述值的任何组合作为上限和/或下限的值的范围。在一些实施方案中，组合物通常以单位剂型的液体形式提供。
在一些方面，本公开内容提供了包括药物剂量单位形式(例如，具有本文公开的组合物的容器)和使用说明书的试剂盒。因此，容器和试剂盒可被设计成为多种用途提供足够的组合物。在各种实施方案中，试剂盒可进一步包括稀释剂。稀释剂可包括分离的或组合的赋形剂。例如，稀释剂可包括张度调节剂如甘露醇、缓冲剂如组氨酸、稳定剂如聚山梨酯80、抗氧化剂如甲硫氨酸和/或其组合。如本领域技术人员认为必要的，稀释剂可含有其他赋形剂，例如，冻干保护剂。
赋形剂
在各种实施方案中，本公开内容提供了可包含各种赋形剂(包括但不限于缓冲剂、抗氧化剂、张度剂和稳定剂)的组合物。另外，该组合物可含有用于ph调节的另外的试剂(例如，hcl)和稀释剂(例如，水)。在一些实施方案中，不同形式的组氨酸可用于ph调节。部分地，赋形剂用于维持抗体的稳定性和生物活性(例如，通过维持蛋白质的适当构象)和/或维持ph。
缓冲剂
在各个方面，组合物包括缓冲剂(缓冲液)。缓冲液用于维持生理学上合适的ph。另外，缓冲液可用于增强组合物的等渗性和化学稳定性。通常，组合物应具有生理学上合适的ph。在各种实施方案中，组合物的ph为约5至约7、约5.5至约6.5，例如约6.0至约6.5。在一些实施方案中，组合物的ph为约6。上述ph水平中间的范围(例如，约ph5.2至约ph6.3、例如，ph6.0或ph6.2)也旨在是本发明的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值的范围。可以根据需要通过本领域已知的技术调节ph。例如，可以根据需要添加hcl以将ph调节至所需水平，或者可以使用不同形式的组氨酸将ph调节至所需水平。
缓冲液可包括但不限于琥珀酸盐(钠或磷酸盐)、组氨酸、磷酸盐(钠或钾)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐、其他有机酸及其混合物。在一些实施方案中，缓冲液是组氨酸(例如，l-组氨酸)。在一些实施方案中，缓冲液是琥珀酸盐。在一些实施方案中，组合物包括以足以使组合物维持在生理学上合适的ph的量存在的氨基酸如组氨酸。组氨酸是在生理学ph范围内具有缓冲能力的示例性氨基酸。组氨酸从其咪唑基团中衍生出其缓冲能力。在一个示例性实施方案中，缓冲液是l-组氨酸(碱)(例如c6h9n3o2，fw：155.15)。在一些实施方案中，缓冲液是l-组氨酸一氯化物一水合物(例如c6h9n3o2.hcl.h2o，fw：209.63)。在一些实施方案中，缓冲液是l-组氨酸(碱)和l-组氨酸一氯化物一水合物的混合物。
在一些实施方案中，缓冲液(例如，l-组氨酸或琥珀酸盐)浓度为约0.1mm至约50mm、约0.1mm至约40mm、约0.1mm至约30mm、约0.1mm至约25mm、约0.1mm至约20mm、或约5mm至约15mm，例如5mm或10mm。在各种实施方案中，缓冲液可以以约6mm、7mm、8mm、9mm、11mm、12mm、13mm、14mm或15mm存在。在一些实施方案中，缓冲液以约10mm存在。上述浓度中间的范围(例如，约12mm至约17mm)也旨在是本发明的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值的范围。在某些实施方案中，缓冲剂以足以维持生理学上合适的ph的量存在。
张度剂
在各个方面，组合物包括张度剂。部分地，张度剂有助于维持组合物的等渗性，并且维持蛋白质水平。部分地，张度剂有助于保持存在于组合物中的治疗活性多肽的水平、比率或比例。如本文所用，术语“张度”是指生物组分在流体环境或溶液中的行为。等渗溶液具有与血浆相同的渗透压，并且因此可以静脉内输注到受试者中而不改变受试者的血浆渗透压。在一些实施方案中，张度剂以足以使得组合物适合于静脉内输注的量存在。通常，张度剂也用作膨胀剂。因此，该试剂可以允许蛋白质克服各种应力如冷冻和剪切。
张度剂可包括但不限于cacl2、nacl、mgcl2、乳糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖、棉子糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉、甘氨酸及其混合物。在一些实施方案中，张度剂是甘露醇(例如，d-甘露醇，例如，c6h14o6，fw：182.17)。
在一些实施方案中，张度剂以约2％w/v至约6％w/v或约3％w/v至约5％w/v存在。在一些实施方案中，张度剂以约3.5％w/v至约4.5％w/v存在。在一些实施方案中，张度剂以约20mg/ml至约60mg/ml、约30mg/ml至约50mg/ml或约35mg/ml至约45mg/ml存在。例如，张度剂以约4％w/v或约40mg/ml存在。在一些实施方案中，张度剂以约6％w/v存在。在一些实施方案中，张度剂以约10％w/v存在。
上述浓度中间的范围(例如，约3.2％w/v至约4.3％w/v或约32mg/ml至约43mg/ml)也旨在是本发明的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值的范围。张度剂应以足以维持组合物的张度的量存在。
抗氧化剂
在各个方面，所述组合物包含抗氧化剂，以便部分地保存组合物(例如，通过防止氧化)。抗氧化剂可包括但不限于gla(γ-亚麻酸)-硫辛酸、dha(二十二碳六烯酸)-硫辛酸、gla-生育酚、二-gla-3,3'-硫代二丙酸，以及连接有任何一种通常可与其化学连接的天然或合成的抗氧化剂的gla、dgla(二氢-γ-亚麻酸)、aa(花生四烯酸)、sa(水杨酸)、epa(二十碳五烯酸)或dha(二十二碳六烯酸)中的任意一种。这些抗氧化剂包括酚类抗氧化剂(例如丁子香酚、鼠尾草酸、二羟基肉桂酸、bht(丁基化羟基苯甲醚)、没食子酸、生育酚、生育三烯酚和类黄酮抗氧化剂(如杨梅黄酮和非瑟酮)、多烯(例如，维甲酸)、不饱和甾醇(例如，δ5-燕麦甾醇(δ5-avenosterol))、有机硫化合物(例如，蒜素)、萜烯(例如，香叶醇、松香酸)和氨基酸抗氧化剂(例如，甲硫氨酸、半胱氨酸、肌肽)。在一些实施方案中，抗氧化剂是抗坏血酸。抗氧化剂是甲硫氨酸或其类似物，例如，硒代甲硫氨酸、羟甲基丁酸、乙硫氨酸或三氟甲硫氨酸。
在一些实施方案中，抗氧化剂(例如，甲硫氨酸如l-甲硫氨酸，例如ch3sch2ch2ch(nh2)co2h，fw＝149.21)以约0.1mm至约50mm、约0.1mm至约40mm、约0.1mm至约30mm、约0.1mm至约20mm或约5mm至约15mm存在。在各种实施方案中，抗氧化剂可以以约5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm或15mm存在。例如，抗氧化剂以约10mm存在。在一些实施方案中，抗氧化剂以约15mm存在。上述浓度中间的范围(例如，约12mm至约17mm)也旨在是本发明的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值的范围。在一些实施方案中，抗氧化剂应以足以保存组合物(部分地，通过阻止氧化)的量存在。
稳定剂
在各个方面，组合物包括稳定剂，也称为表面活性剂。稳定剂是与组合物中的生物分子和/或一般药物赋形剂相互作用并使其稳定的特定的化学化合物。在某些实施方案中，稳定剂可以与较低温度的储存结合使用。稳定剂通常保护蛋白质免受空气/溶液界面诱导的应力和溶液/表面诱导的应力，否则可能导致蛋白质聚集。稳定剂可包括但不限于甘油、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯80、二羧酸、草酸、琥珀酸、己二酸、富马酸、邻苯二甲酸及其组合。在一些实施方案中，稳定剂是聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，稳定剂(例如，聚山梨醇酯80)浓度为约0.001％w/v至约0.01％w/v、约0.001％w/v至约0.009％w/v或约0.003％w/v至约0.007％w/v。例如，稳定剂浓度为约0.005％w/v。在一些实施方案中，稳定剂以约0.01％w/v存在。上述浓度中间的范围(例如，约0.002％w/v至约0.006％w/v)，也旨在是本发明的一部分。例如，旨在包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
在一些实施方案中，组合物基本上不含防腐剂。在一些实施方案中，可以根据需要添加防腐剂。例如，可以包括冷冻保护剂或冻干支持剂，例如，如果组合物是冻干的。
5.4.表达核仁素的癌症和非恶性细胞
在一些实施方案中，根据本公开内容产生的分离的抗-核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)用于治疗多种细胞，包括癌细胞和非癌细胞二者。在一些实施方案中，分离的抗-核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)是单克隆抗体。在一些实施方案中，分离的抗-核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)是多克隆抗体。术语“癌症”在本文先前描述。可以用分离的抗-核仁素抗体(例如，人的和/或单克隆的)抑制或治疗的癌症类型的实例包括但不限于：急性淋巴细胞性白血病；髓样白血病；急性髓样白血病；慢性髓样白血病；肾上腺皮质癌肾上腺皮质癌；aids相关癌症；aids相关淋巴瘤；肛门癌；星形细胞瘤，儿童小脑；星形细胞瘤，儿童大脑；基底细胞癌；胆管癌，肝外；膀胱癌；膀胱癌；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤；脑瘤；脑瘤，脑干胶质瘤；脑瘤，小脑星形细胞瘤；脑瘤，大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；脑瘤，室管膜瘤；脑瘤，成神经管细胞瘤；脑瘤，幕上原始神经外胚层瘤；脑瘤，视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；乳腺癌，女性；乳腺癌，男性；支气管腺瘤/类癌瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤；大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；宫颈癌；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性脊髓增生性病症；结肠癌；结直肠癌；皮肤t细胞淋巴瘤；b细胞淋巴瘤子宫内膜癌；室管膜瘤；食道癌；食道癌；尤因肿瘤家族(ewing'sfamilyoftumors)；颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑色素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；胃肠道类癌瘤；生殖细胞瘤，颅外；生殖细胞瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤；胶质瘤，儿童脑干；胶质瘤，儿童大脑星形细胞瘤；胶质瘤，儿童视觉通路和下丘脑神经；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌，成人(原发性)；肝细胞(肝)癌，儿童(原发性)；霍奇金淋巴瘤(hodgkin'slymphoma)；妊娠期间霍奇金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑神经和视觉通路胶质瘤；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西肉瘤(kaposi'ssarcoma)；肾(肾细胞)癌；肾癌；喉癌；白血病，急性淋巴细胞性；白血病，急性淋巴细胞性；白血病，急性髓样；白血病，急性髓样；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病；慢性骨髓性；唇和口腔癌；肝癌，成人(原发性)；肝癌，儿童(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，aids相关的；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤t细胞，参见蕈样肉芽肿病和塞泽里综合征；淋巴瘤，霍奇金；淋巴瘤，妊娠期间霍奇金；淋巴瘤，非霍奇金；淋巴瘤，非妊娠期间霍奇金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦(waldenstrom's)；骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤；成神经管细胞瘤；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内的(眼)；梅克尔细胞癌；间皮瘤，成人恶性；间皮瘤；转移性鳞状颈癌伴隐匿性原发性；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤蕈样肉芽肿病；骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；骨髓性白血病，慢性；骨髓性白血病，成人急性；骨髓性白血病，儿童急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增生性病症，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；成神经管细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；妊娠期间非霍奇金淋巴瘤；口癌；口腔癌，唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在瘤；胰腺癌；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金淋巴瘤；妊娠和非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；唾液腺癌；肉瘤，尤因氏肿瘤家族；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫；塞泽里综合征；皮肤癌(非黑色素瘤)；皮肤癌；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，参见皮肤癌(非黑色素瘤)；鳞状颈癌伴隐匿性原发性，转移性；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌；幕上原始神经外胚层瘤；t-细胞淋巴瘤，皮肤，参见蕈样肉芽肿病和塞泽里综合征；睾丸癌；胸腺瘤；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠；输尿管和肾盂，移行细胞癌；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；视觉通路和下丘脑神经胶质瘤；外阴癌；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；以及维尔姆斯瘤(wilms'tumor)。
已知表达核仁素的癌细胞包括肺癌(例如，非小细胞肺癌)、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、白血病(例如，aml、cll)、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤和胃癌。此外，表达核仁素的非癌细胞包括免疫细胞、诸如树突细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞和胶质细胞，以及血管平滑肌细胞和内皮细胞。在一些实施方案中，本公开内容的抗体用于治疗患有高免疫和高血管生成疾病的受试者，后者在美国专利公开号2009/0191244中描述，该专利通过引用并入本文。
6.某些抗体性质
6.1.突变频率
本文公开的抗体可包含来自种系序列的具有至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的突变频率的重链序列。抗体可包含cdr3区，其是来自种系序列的具有至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的突变频率的轻链序列。抗体可包含来自种系序列的具有至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的突变频率的重链序列和轻链序列。抗体可包含来自vh家族的vh区，该vh家族选自vh家族4-59中的任一个。
6.2.重链长度与轻链长度
本文公开的抗体可包含长度为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的cdr3区。抗体可包含长度为至少约18个氨基酸的cdr3区。
本文公开的抗体可包含在轻链末端处的缺失。抗体可包含在轻链末端处3个或更多个氨基酸的缺失。抗体可包含在轻链末端处7个或更少个氨基酸的缺失。抗体可包含在轻链末端处3、4、5、6或7个氨基酸的缺失。
本文公开的抗体可包含在轻链中的插入。抗体可包含在轻链中插入1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸。抗体可包含在轻链中插入3个氨基酸。
6.3.亲和力
亲和力是分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。以下描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
在一些实施方案中，本文公开的抗体对人核仁素具有约1μm、100nm、10nm、5nm、2nm、1nm、0.5nm、0.1nm、0.05nm、0.01nm或0.001nm或更小(例如，10-8m或更小、例如，10-8m至10-13m、例如，10-9m至10-13m)的解离常数(kd)。亲和力成熟的抗体是在一个或多个高变区(hvr)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这种改变的亲本抗体相比，这种改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。这些抗体可以与人核仁素结合，该人核仁素的kd为约5×10-9m、2×10-9m、1×10-9m、5×10-10m、2×10-9m、1×10-10m、5×10-11m、1×10-11m、5×10-12m、1×10-12m或更小。
kd可以通过任何合适的测定来测量。例如，kd可以通过放射性标记的抗原结合测定(ria)来测量(参见，例如，chen等人,j.mol.biol.293:865-881(1999)；presta等人,cancerres.57:4593-4599(1997))。例如，可以使用表面等离子体共振测定法(例如，使用
6.4.半胱氨酸工程化的抗体变体
在一些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换的“thiomabs”。在一些实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点上。反应性硫醇基团可以位于与其他部分(如药物部分或连接体-药物部分)缀合的位点，以产生免疫缀合物。在一些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸置换：v205(kabat编号)的轻链；a118(eu编号)的重链；以及重链fc区的s400(eu编号)。可以如所述生成半胱氨酸工程化的抗体(参见，例如，美国专利号7,521,541)。
6.5.抗体衍生物
在一些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以包含本领域已知的且易于获得的其他非蛋白质部分。适合于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造上具有优势。
聚合物可以是任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体附接的聚合物的数目可以变化，并且如果附接两种或更多种聚合物，它们可以是相同或不同的分子。
在一些实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(参见，例如，kam等人,proc.natl.acad.sci.usa102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但是将非蛋白质部分加热到杀死抗体-非蛋白质部分附近的细胞的温度的波长。
7.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体(参见，例如，美国专利号4,816,567)。在一些实施方案中，提供了编码本文所述的核仁素抗体的分离的核酸。这种核酸可以编码包含vl的氨基酸序列和/或包含抗体的vh的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，提供了包含这种核酸的一种或多种载体。载体是能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入其中已导入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。
在一些实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。宿主细胞是已经导入外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和由其衍生而不考虑传代数的后代。后代可能与亲本细胞的核酸含量不完全相同，但可能含有突变。本文包括与最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变后代。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用其转化)含有编码包含抗体的vl的氨基酸序列和包含抗体的vh的氨基酸序列的核酸的载体或含有编码包含抗体的vl的氨基酸序列的核酸的第一载体和含有编码包含抗体的vh的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴细胞(例如，y0、ns0、sp20细胞)。在一些实施方案中，提供了制备核仁素抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养包含编码如上提供的抗体的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞或宿主细胞培养基中回收抗体。
为了重组核仁素抗体的产生，将编码抗体的分离的核酸(例如，如上所述的)插入一种或多种载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离和测序这种核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，例如，当不需要糖基化和fc效应子功能时(参见，例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523；charlton,methodsinmolecularbiology,vol.248,pp.245-254(2003))。表达后，可以在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离抗体，并且可以进一步纯化。
除了原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主(参见，例如，gerngross,nat.biotech.22:1409-1414(2004)以及li等人,nat.biotech.24:210-215(2006))。用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物体，包括无脊椎动物和脊椎动物。无脊椎动物的实例包括植物和昆虫细胞(参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978以及6,417,429)。脊椎动物细胞的实例包括哺乳动物细胞系，由sv40(cos-7)转化的猴肾cv1系；人胚肾细胞系(如在graham等人,j.genvirol.36:59(1977)中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠支持细胞(tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；水牛大鼠肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562)；tr1细胞；mrc5细胞；fs4细胞；中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞；以及骨髓瘤细胞系如y0、ns0和sp2/0。(参见，例如，yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,vol.248,pp.255-268(2003))。
8.实施例
实施例1.来自人b细胞(cp1)的抗体cp1的亚克隆和纯化
将来自每个亲本b细胞系的细胞解冻并扩充。在补充有10％fbs的常规生长培养基(rpmi)中培养细胞。通过以三种不同密度(2个细胞/孔、1个细胞/孔和0.5个细胞/孔)在96孔板上接种来亚克隆培养物。在至少2周的时间范围内监测克隆生长。抗原特异性elisa(“核仁素elisa”)用于检测抗核仁素抗体和筛选单细胞克隆。使用抗人iggelisa反向筛选阳性孔以估计阳性孔中的抗体滴度。每个亲本b细胞系最多10个阳性亚克隆扩充并在每个至少20个小瓶的库中冷冻保存。将细胞在含有5％dmso的rpmi中冷冻。在库时从来自上面冷冻的每个亚克隆中的1x107个细胞中制备trizol提取物。从每个样品中制备rna和寡-dt引发的cdna。使用3’特异性重链和轻链恒定区引物和寡-dt作为5’引物，将来自每个trizol提取物的cdna多聚腺苷酸化并用作pcr反应中的模板，以便扩增表达抗体的可变区。将500bp插入物凝胶分离并连接到pbluescript中。对于每个插入组，对六个vh插入物和六个vl插入物进行测序和比对。
将冷冻培养物解冻并扩充。b细胞上清液制备：在75:25的aim培养基:rpmi(1％抗生素)(总共2500ml)中将细胞以约[0.8x106个细胞/ml]接种到28xt225烧瓶(a)(各75ml，总共2100ml)和10xt75烧瓶(b)(各40ml，总共400ml)中。当细胞达到约4,400ml(36xt225烧瓶)的总体积时，用centricon离心收获上清液cp1。细胞#：平均细胞数＝8.8x105个细胞/ml，平均细胞活力＝70.5％。离心过滤：centriconplus-70离心过滤装置，100k。melon凝胶纯化igg：melon凝胶igg纯化200ml树脂(或1l总体积)，thermoscientific(cat#pi-45214)。总共1l凝胶溶液(含有20％珠子浆液，200ml)。合并400ml使用的凝胶溶液+600ml未使用的凝胶溶液约总共1l。
实施例2.从重组细胞(cp1(rc))生产抗体cp1
在补充有0.1％pluronicf-68、4mmglutamax的f17培养基中，用cp1γ重链/κ轻链或cp1γ重链/λ轻链转染初始密度为2.1x106个细胞/ml的cho3e7(中国仓鼠卵巢)细胞。用密码子优化合成地产生用于哺乳动物细胞表达的cdna编码，并通过标准方法在指定的限制性位点将其克隆到表达载体ptt5中。使用polyplus线性q-pei以1:4(w/v)的dna:pei比率，用1mg的质粒dna/l培养物转染在125ml摇瓶中的两个30mlcho3e7细胞培养物。转染后24小时，向培养物补充4.5mlcd高效饲料b(lifetechnologies)。针对密度和活力使用vicellxr监测培养参数。
通过在1000xg下离心5分钟，在转染后10天(第二次转染6天)收获培养物上清液。通过在9100xg下离心30分钟澄清条件培养上清液(ccs)，用0.2μmpes过滤系统过滤灭菌，并在4℃下储存。
通过还原和非还原sds-page分析蛋白质表达。参见图11。表达验证sds-page。通过在4-20％tris-甘氨酸tgx凝胶(bio-rad)上还原(左图)和非还原(右图)sds-page评估40微升条件培养上清液(ccs)样品，并用instantblue凝胶染色剂染色。
cp1(rc)与人重组核仁素(kd＝2.6±0.7nm，sem.)紧密结合，并且与人肿瘤细胞的质膜核仁素结合。在37℃下与cp1(rc)温育的panc-1和du-145肿瘤细胞的共聚焦显微镜检查显示出抗体在这些细胞的质膜中的点状定位以及抗体内化到细胞质中。抗体在质膜中的病灶内的定位表明抗体与掺入质膜内的脂质筏中的核仁素结合。
在6l培养规模的cho3e7细胞中质粒分离和瞬时表达。目标是分离编码cp1γ重链的无内毒素表达质粒dna。使用线性pei用γ重链和κ轻链质粒dna瞬时转染6l的cho3e7细胞。监测培养参数，并且当活力降至约85-90％(目标90％)时收获条件培养物上清液(ccs)。预计转染后3-4天会达到活力目标。通过还原和非还原sds-page分析ccs中的蛋白质表达。将澄清的ccs无菌过滤并在4℃下储存。
实施例3.通过elisa测定与重组核仁素结合
试剂：由santacruz生产的山羊抗人iggab-hrp抗体作为非特异性igg对照，通过nanodrop(yokootake)和femto-elisa-hrp试剂盒进行重组核仁素定量。
制备：将100μl结合缓冲液(对照)或重组核仁素(含有200ng、400ng或800ng)添加至immuno96孔板中的指定孔中。将板在室温下在轨道振荡器上以100rpm温育1h。温育1h后，小心地将板倒空并轻轻地敲打出残留的液体。向每个孔中添加200μl稀释的1xnap-阻滞剂，并在轨道振荡器上以100rpm温育该板15min。温育后，小心地将板倒空并轻轻敲打出残留的液体。
第一抗体温育：将100μl的封闭缓冲液中的连续稀释的上清液在室温下在轨道振荡器上以100rpm温育1h。温育后，小心地将板倒空并轻轻地取出残留的液体。为了洗掉抗体，用1xfemto-tbst(200μl)填充每个孔并等待30秒，随后将板倒转并敲打以清空每个孔中的残余液体。
第二抗体温育：将100μl的*1→500稀释的2抗人iggab-hrp原液在室温下在轨道振荡器上以100rpm温育1h。为了洗掉抗体，用1xfemto-tbst(200μl)填充每个孔并等待30秒，随后将板倒转并敲打以清空每个孔中的残余液体。
用于读取的制备：将100μl的femto-elisa-hrp底物添加至每个孔中。产生可溶的蓝色，使用底物作为空白在620nm处读取。每10分钟进行监测，持续1h。
结果：抗体cp1与具有n-末端缺失(δ1-283)和6x-his(seqidno:94)的截短的人重组核仁素的结合的elisa分析产生2.6±0.7nm(s.e.m，n＝4)的平衡解离常数，参见图4。
实施例4.活性/效力测试
通过细胞计数/tbe在96h对mcf-7和mcf-10a细胞上的抗体进行melon凝胶纯化。通过melon凝胶(cpexpt407)；igg浓度[533.26μg/ml](cpexpt409)；约2.0ml；具有100mm精氨酸的1xpbs缓冲液旋转柱纯化抗体。将mcf7细胞和mcf10a细胞以[1x104个细胞/ml](或每孔2x103个细胞/200μl)接种。在96孔板(mcf7细胞a-d、mcf10a细胞e-h)中以[1x104个细胞/ml]1x(或每孔2x103个细胞/200μl)设置mcf-7和mcf-10a细胞。对于25ml的[1x104个细胞/ml]1x，收集2.5x105个细胞。如下所示，在每个细胞系的96孔的每个孔中接种200μl的细胞溶液。温育过夜。第二天，检查汇合：mcf7细胞约30％汇合，mcf10a细胞约10％汇合。
使用以下方案进行96h药物治疗。对于1/2板的mcf7细胞，使用适当的培养基(含1％抗生素的rpmi)或用于mcf7细胞的1ml人血清和4mlrpmi培养基或用于mcf10a细胞的humec完全培养基，制备含有20％人血清(ab型)的5ml培养基。在0、0.1、0.25、0.5、1、2和4μg/mligg下测试各种浓度的cp1m4.2，一式三份。首先在用于mcf7细胞的1％抗生素的rpmi培养基或用于mcf10a细胞的humec完全培养基中制备[4μg/ml]1x(或[8μg/ml]2x)(0.7ml)的cp1的原液。对于igg对照，首先制备与相同溶液中(具有100mm精氨酸的1xpbs缓冲液)的cp1m4样品[53.26μg/ml]的原液相同浓度的原液。然后，为每个细胞系准备与cp1m4.2完全相同的系列稀释液(参见步骤4)。开始药物治疗。通过移液丢掉所有溶液(200μl)。每孔(x3)添加100μl含20％人血清的培养基。如下所示，在样品设置中添加100μl不含人血清(例如，rpmi/1％抗生素)、igg对照或上清液的常规培养基。放回培养箱。计数细胞数目并在96小时(星期二)进行tbe测定以确定抗体cp1和对照igg抗体的作用。
细胞毒性：时间＝96h。使用以下方案来测定细胞毒性。96小时时，在显微镜下短暂检查细胞形态。一次使用一组样品(例如，igg对照)，去除上清液。向每孔添加*30μl胰蛋白酶，并温育15min。添加170μlpbs(总体积200μl)。将细胞溶液转移到0.5ml管中并充分移液以破碎细胞。向另一0.5ml管中加入10μl在pbs(过滤的)中的0.2％台盼蓝。使用2个样品，将20μl细胞溶液添加至10μl0.2％台盼蓝中。充分混合，装载到室中，然后温育1min，随后用cellometer(例如，每个样品20μl)计数活力和活细胞数目。
结果显示在图7中。与igg对照相比，cp1对mcf7乳腺癌细胞具有有效的杀伤力，但对正常乳腺细胞的毒性可以忽略不计。
与适体as1411比较
将mcf-7细胞与适体as1411(a)或与以下所述浓度的与当前权利要求(b)一致的抗核仁素抗体一起温育96小时。使用涉及四唑鎓化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h-四唑鎓的活细胞的生物还原的显色测定(或mts测定)(a)或通过台盼蓝排除测定(b)测量细胞活力。结果是六个实验(a)或3个实验(b)的平均值±s.e.m.(平均值的标准误差)。
因此，将mcf-7细胞活力降低至50％(ic50)所需的as1411浓度为约7μm，而要求保护的抗体对mcf-7细胞的ic50值低至约0.8nm或0.0008μm，如图13所示。因此，要求保护的抗体在杀死mcf-7细胞方面比as1411更有效约9000倍。
实施例5.抗体对裸鼠中mv411人白血病异种移植模型的影响
在雌性ncrnu/nu小鼠(8-12周龄；n＝40)的肋腹部皮下注射50％(v/v)matrigel中的1x107个mv411肿瘤细胞。当肿瘤达到100-150mm3的平均大小时进行配对，以将小鼠分为两组，每组10只。然后用igg同种型对照抗体(第1组)或如要求保护的抗体如cp1(第2组)处理小鼠。每组具有10只雌性crlnnu/nu小鼠，并在第1、4、7、10、13、16天以0.1ml的注射体积静脉内施用10mg/kg的剂量。对动物进行单独监测。第一周每日进行体重测量，并随后每两周进行一次。每两周一次对肿瘤大小进行卡尺测量。本研究的终点是2000mm3的肿瘤体积或76天，以先到达者为准。当达到终点时，对动物施以安乐死。
cp1具有良好的耐受性，其中唯一的不良事件是平均体重瞬时损失16％。cbc是正常的。所有主要器官的尸检结果均正常。
在这种mv4-11人异种移植小鼠模型中，cp1处理导致30％的长期存活者(风险比为0.22-0.29)，而不会对小鼠产生任何严重的毒性。与具有无显著器官或血液学毒性的同种型对照抗体相比，用cp1处理的裸鼠的存活率统计学显著增加。已知没有其他生物制剂在该模型中作为单一药剂显示存活益处。图14示出了在第2组中，30％的小鼠存活了80天。更出人意料的是，有20％的小鼠到大约第40天时表现出肿瘤完全消退(数据未示出)。而明显相反，对照组(第1组)中的全部小鼠都显示出快速的肿瘤生长，达到终点体积2000mm3，并在大约第40天不得不施以安乐死。
图15a和图15b是根据肿瘤体积变化比较第1组和第2组的另一种方式。在处理的10只小鼠(第2组)中，有3只出人意料地存活了至少76天，更出人意料的是，存活小鼠中有2只到大约第40天时表现出肿瘤完全消退。而明显相反，对照组(第1组)中的全部10只小鼠都显示出快速的肿瘤生长，并在大约第40天时不得不施以安乐死。图15a显示，第1组中的所有小鼠在用igg对照抗体处理后均显示出快速的肿瘤生长。相反，图15b显示，在用请求保护的抗体处理后，第2组中的1号小鼠和3号小鼠的肿瘤体积到大约第40天时下降至不可检出的水平。处理的10号小鼠同样存活，并且其肿瘤体积从大约第60天起基本不再变化。
实施例6.预测cdr的方法
基于构架区和互补决定区(cdr)的氨基酸编号由以下之一定义：
rosierosetta。参考文献：lyskovs等人,"serverificationofmolecularmodelingapplications:therosettaonlineserverthatincludeseveryone(rosie)".plosone.2013年5月22日；8(5):e63906.doi:10.1371/journal.pone.0063906.2013年出版。rosettaantibody3程序的rosieapp接口用于模拟抗体cp1的高变区的3-d结构并鉴定六个cdr。第一阶段利用基于下面所述的chothia定义和最低能量结构的典型模板选择和组装。使用rosetta方案对其进行组装，从而导致粗糙结构。在第二阶段，cdr-h3从头重建。基于下面所述的paratome方法同时精制paratope侧链和环骨架。cdr-h3包含小于10个氨基酸，这表明均方根偏差为大约1.5埃且模型高度准确。
paratome。参考文献：kunikv等人,(2012).paratome:anonlinetoolforsystematicidentificationofantigenbindingregionsinantibodiesbasedonsequenceorstructure.nucleicacidsres.2012年7月；40(webserverissue):w521-4.doi:10.1093/nar/gks480.epub2016年6月6日。paratome网络服务器(http://www.ofranlab.org/paratome/)用于鉴定抗体cp1的高变区内的六个抗体结合区(abr)。abr类似于cdr，但也包含有助于抗体与抗原的结合的cdr附近的氨基酸侧链。从抗体cp1的一级结构，paratome网络服务器能够通过与非冗余组的所有抗体-抗原复合物比对的多重结构内的结构共有区域进行比较来鉴定抗体的abr。
p.i.g.s.(免疫球蛋白结构的预测)编号系统。参考文献：marcatilip.等人,pigs:automaticpredictionofantibodystructures.bioinformatics200824:1953。
chothia定义。参考文献：chothiac等人,conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions.nature1989342:887。chothia定义是用于对抗体的高变区的氨基酸残基以及在高变区内的六个互补区(cdr)中的每一个的开始和结束进行编号的方案。该方案基于对众多抗体的典型结构的分析。使用chothia定义，我们能够通过与抗体cp1的一级结构比较来鉴定六个cdr的开始和结束处的氨基酸的位置以及cdr内的剩余的氨基酸。
kabat。参考文献：kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991。
如英国伦敦大学学院的andrewc.r.martin博士的生物信息学小组所公布的，遵循一组规则来鉴定cdr，或者如下。
cdr-l1(l24-l34)
cdr-l2(l50-l56)
开始在l1末端后总是16个残基
之前的残基通常是ile-tyr，又可以是，val-tyr、ile-lys、ile-phe
长度总是7个残基(除了在该区具有缺失的new(7fab))
cdr-l3(l89-l97)
cdr-h1(h31-h35b)
cdr-h2(h50-h65)
cdr-h3(h95-h102)
imgt(immunogenetics)。遵循以下imgt规则以鉴定cdr。参考文献：lefranc,m.-p.,theimmunologist,7,132-136(1999)。
表3.根据imgt对fr和cdr的定义
(c23)1st-cys、(w41)conserved-trp、(c104)2nd-cys、位置118对应于文本中描述的j-phe或j-trp。imgt注释：(1)种系cdr3-imgt是种系v-genes的v-region的特异性。其在v-heptamer之前包含0、1或2个核苷酸。(2)重排的cdr3-imgt和fr4-imgt是v-domain(v-j-region或v-d-j-region)的特异性。其是重排的v-j-genes和v-d-j-genes以及相应的cdna和蛋白质的特征。
实施例7.计算机模拟抗核仁素抗体与核仁素结合的方法
利用cluspro2.0蛋白质-蛋白质对接软件(可从http://cluspro.bu.edu获得)来预测rosettarosie预测的抗体cp1(rc)的结构与人核仁素的rna结合域(rbd)1和2的溶液结构之间的相互作用。人核仁素rbd1和rbd2的溶液结构，也称为“2krr”，可通过结构生物信息学研究合作组织蛋白质数据库(rcsbpdb)公开获得。
要在cluspro2.0中开始对接，将包含rosettarosie预测的抗体结构的.pdb文件指定为“receptor”，并且将包含2krr结构的.pdb文件指定为“ligand”。在“高级选项”下，选择“使用抗体模式”。在抗体模式中，cluspro2.0使用不对称电位用于对接抗体和抗原对。在发现抗体-抗原相互作用不展现出高度的表面互补性(如酶-底物相互作用)之后，这种不对称潜力得以实现。相反，抗体-抗原相互作用展现出大部分平坦、疏水性较小的界面。最后，由于抗体通过其互补决定区(cdr)与其抗原相互作用，因此选择“自动掩蔽非cdr区”的选项。
为了执行对接，cluspro2.0利用了蛋白质-蛋白质对接程序piper，这是一种使用基于结构的成对电位作为其能量函数的一个组成部分的基于fft(快速傅立叶变换)的对接程序；在抗体模式中，使用不对称电位。当抗体在三维网格上保持就位时，配体以每5°
cp1和cp1(rc)与细胞表面核仁素结合，并且该复合物似乎利用脂筏介导的内吞作用进入细胞。在细胞质中，cp1和cp1(rc)与人核仁素的rna结合域1和rna结合域2。
图16是抗体cp1(rc)与人核仁素结合的分子模型的图像，其中标记了与核仁素接触的cdr。以抗体模式中利用了cluspro2.0蛋白质-蛋白质对接软件来预测cp1(rc)的变区与蛋白质数据库(pdb)中各种核仁素片段的结构之间的相互作用。利用将cp1(rc)(其cdr预测用rosierosetta完成)与人核仁素(pdb2krr，seqidno：20的残基300-466的氨基酸序列)rna结合域1和2(rbd1和2)结合而获得所示模型。
表4中列出了抗体cdr中的残基与核仁素(ncl)的残基之间的一些最近距离。
表4.核仁素-抗体cp1(rc)结合模型中选择的氨基酸的距离。
实施例8.cp1对肿瘤和正常细胞活力的影响
cp1是体外肿瘤细胞活力的有效抑制剂。图5和图6示出了cp1相对于广泛的肿瘤细胞获得小于1μg/ml的ic50值。例如，cp1对人mv4-11aml细胞的ic50为0.4μg/ml。相反，cp1相对于正常人b细胞和髓样细胞、乳腺上皮细胞和肺成纤维细胞的ic50浓度大于10μg/ml。与肿瘤细胞不同，这些正常细胞在质膜或细胞质中均不表达可检测水平的核仁素。与相应的正常细胞相反，多功能蛋白质核仁素在人肿瘤细胞中的广泛和异常表达解释了抗体cp1的广谱抗癌活性和肿瘤选择性二者。
源自患者的cg-emt前列腺癌细胞从南卡罗来纳州医科大学hollings癌症中心(thehollingscancercenteratthemedicaluniversityofsouthcarolina)的michaelb.lilly,m.d.获得。将细胞在含有10％热灭活的胎牛血清和1％抗生素的rpmi培养基中培养32代直至细胞生长变得一致。为了测试纯化的cp1在杀死cg-emt细胞方面的效力，将细胞以每孔6000个细胞的密度接种到96孔板上。第二天，在10％人a/b血清的存在下，将细胞一式三份与0至8μg/ml的cp1或与0至8μg/ml的同种型对照人igg1一起温育。96小时后，使用台盼蓝排除法测定细胞活力，并用nexcelomcellometer进行细胞计数。结果显示在图8中。
实施例9.cp1(rc)对肿瘤细胞活力的影响
说明性的ic50值确定
用promega的celltiter-
表5.ic50研究中使用的细胞和抗体
将人肿瘤细胞以总体积90μl/孔接种在透明的聚苯乙烯96孔微量培养板(
表6.ic50测量的结果
9.cp1(rc)、cp1、cp2、核仁素的序列
9.1.cp1(rc)
cp1(rc)γ重链，核苷酸序列seqidno:1
cp1(rc)γ重链，氨基酸序列seqidno:2
r234、e376、m378是通过比较cp1抗体的测序与其他人抗体中的已知同种异型序列而鉴定的同种异型残基。
cp1(rc)γ重链的残基q20至a137：可变区，氨基酸序列seqidno:3
qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsinsggfywswirqhpgkglewigyisytgstyynpslksrvnisadtsknrfslklssvtaadtavyycardmndglqiwgqgtlvtvsa
cp1(rc)γ重链的残基a138至k467：恒定区，氨基酸序列seqidno:4
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
cp1(rc)γ重链的残基m1至s19：天然信号肽(前导)，氨基酸序列seqidno:5
mkhlwfflllvaaprwvls
cp1(rc)γ重链的残基a138至v235：人ch1，氨基酸序列seqidno:6
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrv
cp1(rc)γ重链的残基e236至p250：人g1铰链，氨基酸序列seqidno:7
epkscdkthtcppcp
cp1(rc)γ重链的残基a251至g361：人ch2，氨基酸序列seqidno:8
apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakg
cp1(rc)γ重链的残基q362至k467：人ch3，氨基酸序列seqidno:9
qprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
cp1(rc)κ轻链，核苷酸序列seqidno:10
cp1(rc)κ轻链，氨基酸seqidno:11
a175和v213是通过比较cp1抗体的测序与其他人抗体中的已知同种异型序列而鉴定的同种异型残基。
残基m1至c22是天然信号肽(前导)。
cp1(rc)κ轻链的残基d23至k129：可变区，氨基酸序列seqidno:12
diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisrwlawyqqkpgkapklliykastlesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsysrafgqgtkveik
cp1(rc)κ轻链的残基r130至c236：恒定区，氨基酸序列seqidno:13
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
9.2.cp1
cp1重链，氨基酸seqidno:14
cp1重链的残基20-137：可变区，氨基酸序列seqidno:3
qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsggsinsggfywswirqhpgkglewigyisytgstyynpslksrvnisadtsknrfslklssvtaadtavyycardmndglqiwgqgtlvtvsa
cp1重链的残基138-467：恒定区，氨基酸序列seqidno:15
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
cp1轻链，氨基酸序列seqidno:11
cp1轻链的残基d23至k129：可变区，氨基酸序列seqidno:12
diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisrwlawyqqkpgkapklliykastlesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsysrafgqgtkveik
cp1轻链的残基r130至c236：恒定区，氨基酸序列seqidno:13
rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
9.3.抗体cp2
cp2重链可变区，核苷酸序列seqidno:16
ggaaggtgtgcacgccgctggtcagggcgcctgagttccacgacaccgtcaccggttcggggaagtagtccttgaccaggcagcccagggccgctgtgcccccagaggtgctcttggaggagggtgccagggggaagaccgatgggcccttggtggaggctgaggagacggtgaccagggttcccaggccccagtaaactcctataataatcacttcagaaatccttccggaagtggtgcaataatacacggctgtgtcctcggtttgcaggctgttcatttgcagatacatcgtattttttgaatcatctcttgagatggtgaacctgtcattcacggctgcggcgtagtctgttgtcccaccatcagatctgcccttaatacggccaacccactccagccccttccctggaacccggcggacccaattcatccaactgttcgcgagactgagtccagagactgtacaggagagtctaagggacccccccggctgtaccaagtctccccccgactcctccaactgcacctcacactggacacctt
cp2重链可变区，氨基酸序列seqidno:17
cp2轻链可变区，核苷酸序列seqidno:18
atgaggctccctgctcagctgctggggctgctaatgctcagcgtcccagggtccagtggggatgttgtgctgactcagtctccactctccctgcccgtaacccctggacagccggcctccatatcctgcacgtctactcaaagcctcgcacacagcaatggagacacctacttgaattggtttctgcagaggccaggccaagctccaaggcgcctattttataacgtttctgaccgcgactttggggtcccggacagattcagcggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggcatttattactgcatgcagggtacactctggcctccgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcc
cp2轻链可变区，氨基酸序列seqidno:19
9.4.核仁素
核仁素，氨基酸序列seqidno:20
核仁素的残基g300至e466，氨基酸序列seqidno:21
gtepttafnlfvgnlnfnksapelktgisdvfakndlavvdvrigmtrkfgyvdfesaedlekaleltglkvfgneiklekpkgkdskkerdartllaknlpykvtqdelkevfedaaeirlvskdgkskgiayiefkteadaektfeekqgteidgrsislyytge
根据本公开内容，无需过度实验即可制备和执行本文公开和本文要求保护的所有组合物和/或方法。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述方法的组合物和/或方法以及步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，显而易见的是，化学和生理学二者相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将会获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改均被视为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
序列表
<110>查尔斯顿制药有限责任公司
musc研究发展基金会
<120>抗核仁素抗体
<130>39723-709.601
<140>
<141>
<150>62/414,316
<151>2016-10-28
<150>62/323,159
<151>2016-04-15
<150>62/304,742
<151>2016-03-07
<160>95
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1401
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400>1
atgaaacacctgtggttctttctcctgctggtggctgctcccaggtgggtgctgagccag60
gtgcagctgcaggaaagcggacctggcctggtcaaaccctcccagacactgagcctgacc120
tgcaccgtcagcggcggatccatcaactccggcggcttctactggagctggatcagacag180
catcctggcaagggcctcgagtggatcggctacattagctataccggcagcacctactac240
aatccctccctgaagagcagggtgaacattagcgccgacacctccaagaacaggttcagc300
ctgaagctcagcagcgtcaccgccgccgataccgccgtgtactactgcgccagggacatg360
aacgacggcctgcagatctggggacagggcacactggtcaccgtgtccgctgccagcacc420
aagggacccagcgtgttccccctggctccctcctccaagagcacctccggaggcaccgcc480
gccctgggctgcctggtgaaggattacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagc540
ggagccctgacaagcggagtgcacacattccctgccgtgctgcagagcagcggcctgtac600
tccctgagctccgtggtcacagtgcctagctcctccctcggcacccagacctacatctgc660
aacgtgaaccataagccctccaataccaaggtggacaagagggtcgagcccaaatcctgc720
gacaagacacacacctgtcctccttgccccgcccccgaactgctgggcggaccctccgtc780
ttcctcttccctcctaagcccaaggataccctgatgatcagcaggacacctgaggtgacc840
tgcgtggtggtggacgtctcccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggat900
ggcgtggaggtccacaacgccaagaccaagcccagagaggagcagtacaacagcacatac960
agggtggtctccgtcctgacagtgctccaccaggactggctgaatggcaaggagtacaag1020
tgcaaggtcagcaacaaagccctgcccgcccctatcgagaagaccatcagcaaggctaag1080
ggccagcccagggagccccaggtctataccctgccccccagcagggaagagatgaccaag1140
aatcaggtctccctgacctgtctggtgaagggcttctaccctagcgacatcgccgtggag1200
tgggagagcaacggccagcctgaaaacaactacaagaccacccctcctgtgctggactcc1260
gacggatccttcttcctgtactccaagctgaccgtggataaaagcaggtggcaacagggc1320
aacgtgttctcctgctccgtcatgcacgaagctctgcacaaccactacacccagaagagc1380
ctgtccctgagccctggcaag1401
<210>2
<211>467
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>2
metlyshisleutrpphepheleuleuleuvalalaalaproargtrp
151015
valleuserglnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallys
202530
proserglnthrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserile
354045
asnserglyglyphetyrtrpsertrpileargglnhisproglylys
505560
glyleuglutrpileglytyrilesertyrthrglyserthrtyrtyr
65707580
asnproserleulysserargvalasnileseralaaspthrserlys
859095
asnargpheserleulysleuserservalthralaalaaspthrala
100105110
valtyrtyrcysalaargaspmetasnaspglyleuglniletrpgly
115120125
glnglythrleuvalthrvalseralaalaserthrlysglyproser
130135140
valpheproleualaproserserlysserthrserglyglythrala
145150155160
alaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrval
165170175
sertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproala
180185190
valleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrval
195200205
proserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhis
210215220
lysproserasnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercys
225230235240
asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleugly
245250255
glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet
260265270
ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis
275280285
gluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluval
290295300
hisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyr
305310315320
argvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly
325330335
lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproile
340345350
glulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnval
355360365
tyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalser
370375380
leuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglu
385390395400
trpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro
405410415
valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrval
420425430
asplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmet
435440445
hisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuser
450455460
proglylys
465
<210>3
<211>118
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>3
glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln
151015
thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserileasnsergly
202530
glyphetyrtrpsertrpileargglnhisproglylysglyleuglu
354045
trpileglytyrilesertyrthrglyserthrtyrtyrasnproser
505560
leulysserargvalasnileseralaaspthrserlysasnargphe
65707580
serleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyr
859095
cysalaargaspmetasnaspglyleuglniletrpglyglnglythr
100105110
leuvalthrvalserala
115
<210>4
<211>330
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>4
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
argvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
proalaprogluleuleuglyglyproservalpheleuphepropro
115120125
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<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
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151015
valleuser
<210>6
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>6
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
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argval
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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肽
<400>7
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151015
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<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>8
alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys
151015
prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval
202530
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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多肽
<400>9
glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu
151015
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202530
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多肽
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多肽
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<211>107
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<220>
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多肽
<400>13
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
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202530
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505560
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65707580
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100105
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>14
metlyshisleutrpphepheleuleuleuvalalaalaproargtrp
151015
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202530
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505560
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lysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys
225230235240
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glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumet
260265270
ileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhis
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465
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<212>prt
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<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
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151015
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202530
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354045
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290295300
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<212>dna
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<220>
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<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>17
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151015
servallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr
202530
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glyalaleuvalthrvalserala
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400>18
atgaggctccctgctcagctgctggggctgctaatgctcagcgtcccagggtccagtggg60
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<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>19
aspvalvalleuthrglnserproleuserleuprovalthrprogly
151015
glnproalaserilesercysthrserthrglnserleualahisser
202530
asnglyaspthrtyrleuasntrppheleuglnargproglyglnala
354045
proargargleuphetyrasnvalseraspargasppheglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile
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100105110
<210>20
<211>710
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>20
metvallysleualalysalaglylysasnglnglyaspprolyslys
151015
metalaproproprolysgluvalglugluaspsergluaspgluglu
202530
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354045
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505560
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65707580
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seraspgluglugluaspaspaspserglugluaspglugluaspasp
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glualametgluthrthrproalalysglylyslysalaalalysval
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vallysglualaproglylysarglyslysglumetalalysglnlys
275280285
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290295300
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progluleulysthrglyileseraspvalphealalysasnaspleu
325330335
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340345350
aspphegluseralagluaspleuglulysalaleugluleuthrgly
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370375380
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glypheargglyglyargglyglyglyglyasphislysproglngly
690695700
lyslysthrlyspheglu
705710
<210>21
<211>167
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>21
glythrgluprothrthralapheasnleuphevalglyasnleuasn
151015
pheasnlysseralaprogluleulysthrglyileseraspvalphe
202530
alalysasnaspleualavalvalaspvalargileglymetthrarg
354045
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65707580
lysprolysglylysaspserlyslysgluargaspalaargthrleu
859095
leualalysasnleuprotyrlysvalthrglnaspgluleulysglu
100105110
valphegluaspalaalagluileargleuvalserlysaspglylys
115120125
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130135140
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serleutyrtyrthrglyglu
165
<210>22
<211>25
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>22
glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln
151015
thrleuserleuthrcysthrvalser
2025
<210>23
<211>26
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>23
glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergln
151015
thrleuserleuthrcysthrvalsergly
2025
<210>24
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>24
glyglyserileasnserglyglyphetyrtrpser
1510
<210>25
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>25
glyserileasnserglyglyphetyrtrpser
1510
<210>26
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>26
glyglyserileasnserglygly
15
<210>27
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>27
trpileargglnhisproglylysglyleuglutrpilegly
1510
<210>28
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>28
trpileargglnhisproglylysglyleuglu
1510
<210>29
<211>18
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>29
phetyrtrpsertrpileargglnhisproglylysglyleuglutrp
151015
ilegly
<210>30
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>30
tyrilesertyrthrglyserthrtyrtyrasnproserleulysser
151015
<210>31
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>31
trpileglytyrilesertyrthrglyserthrtyrtyr
1510
<210>32
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>32
tyrilesertyrthrglyserthrtyrtyrasnproserleu
1510
<210>33
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>33
argvalasnileseralaaspthrserlysasnargpheserleulys
151015
leuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysalaarg
202530
<210>34
<211>37
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>34
asnproserleulysserargvalasnileseralaaspthrserlys
151015
asnargpheserleulysleuserservalthralaalaaspthrala
202530
valtyrtyrcysala
35
<210>35
<211>41
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>35
tyrthrglyserthrtyrtyrasnproserleulysserargvalasn
151015
ileseralaaspthrserlysasnargpheserleulysleuserser
202530
valthralaalaaspthralavaltyr
3540
<210>36
<211>34
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>36
lysserargvalasnileseralaaspthrserlysasnargpheser
151015
leulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcys
202530
alaarg
<210>37
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>37
aspmetasnaspglyleuglnile
15
<210>38
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>38
argaspmetasnaspglyleuglnile
15
<210>39
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>39
tyrcysalaargaspmet
15
<210>40
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>40
trpglyglnglythrleuvalthrvalserala
1510
<210>41
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>41
asnaspglyleuglniletrpglyglnglythrleuvalthrvalser
151015
ala
<210>42
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>42
glyserileasnserglygly
15
<210>43
<211>23
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>43
aspileglnmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcys
20
<210>44
<211>26
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>44
aspileglnmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaser
2025
<210>45
<211>25
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>45
aspileglnmetthrglnserproserthrleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargala
2025
<210>46
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>46
argalaserglnserileserargtrpleuala
1510
<210>47
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>47
glnserileserargtrpleuala
15
<210>48
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>48
serglnserileserargtrpleu
15
<210>49
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>49
trptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuiletyr
151015
<210>50
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>50
trptyrglnglnlysproglylysalaprolys
1510
<210>51
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>51
alatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuiletyr
151015
<210>52
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>52
lysalaserthrleugluser
15
<210>53
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>53
leuleuiletyrlysalaserthrleugluser
1510
<210>54
<211>4
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>54
lysalaserthr
1
<210>55
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>55
glyvalproserargpheserglyserglyserglythrgluphethr
151015
leuthrileserserleuglnproaspaspphealathrtyrtyrcys
202530
<210>56
<211>37
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>56
leugluserglyvalproserargpheserglyserglyserglythr
151015
gluphethrleuthrileserserleuglnproaspaspphealathr
202530
tyrtyrcysglngln
35
<210>57
<211>34
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>57
glyvalproserargpheserglyserglyserglythrgluphethr
151015
leuthrileserserleuglnproaspaspphealathrtyrtyrcys
202530
glngln
<210>58
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>58
glnglntyrasnsertyr
15
<210>59
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>59
glnglntyrasnsertyrserargala
15
<210>60
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>60
tyrasnsertyrserarg
15
<210>61
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>61
tyrasnsertyrserargala
15
<210>62
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>62
serargalapheglyglnglythrlysvalgluilelys
1510
<210>63
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>63
pheglyglnglythrlysvalgluilelys
1510
<210>64
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>64
alapheglyglnglythrlysvalgluilelys
1510
<210>65
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>65
glnserileserargtrpleu
15
<210>66
<211>4
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>66
tyrasnsertyr
1
<210>67
<211>30
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>67
gluvallysleuglngluserglyprogluleuvallysproglyala
151015
servallysilesercyslysalaserglytyrthrphethr
202530
<210>68
<211>25
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>68
gluvallysleuglngluserglyprogluleuvallysproglyala
151015
servallysilesercyslysalaser
2025
<210>69
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>69
asptyrphemetile
15
<210>70
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>70
glytyrthrphethrasptyrphe
15
<210>71
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>71
trpvallysglnserhisglylysserleuglutrpilegly
1510
<210>72
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>72
metiletrpvallysglnserhisglylysserleuglutrpilegly
151015
asp
<210>73
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>73
aspileasnproserasnglyglysersertyrasnleulysphelys
151015
asp
<210>74
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>74
ileasnproserasnglyglyser
15
<210>75
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>75
lysalathrleuthrvalasplysserserasnthralatyrmetasp
151015
leuargserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcysalaarg
202530
<210>76
<211>38
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>76
sertyrasnleulysphelysasplysalathrleuthrvalasplys
151015
serserasnthralatyrmetaspleuargserleuthrsergluasp
202530
seralavaltyrtyrcys
35
<210>77
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>77
glyglnpheargleuproalatrpphealatyr
1510
<210>78
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>78
alaargglyglnpheargleuproalatrpphealatyr
1510
<210>79
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>79
trpglyglnglyalaleuvalthrvalserala
1510
<210>80
<211>22
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>80
glyglnpheargleuproalatrpphealatyrtrpglyglnglyala
151015
leuvalthrvalserala
20
<210>81
<211>23
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>81
aspvalvalleuthrglnserproleuserleuprovalthrprogly
151015
glnproalaserilesercys
20
<210>82
<211>26
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>82
aspvalvalleuthrglnserproleuserleuprovalthrprogly
151015
glnproalaserilesercysthrserthr
2025
<210>83
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>83
thrserthrglnserleualahisserasnglyaspthrtyrleuasn
151015
<210>84
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>84
glnserleualahisserasnglyaspthrtyr
1510
<210>85
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>85
trppheleuglnargproglyglnalaproargargleuphetyr
151015
<210>86
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>86
leuasntrppheleuglnargproglyglnalaproargargleuphe
151015
tyr
<210>87
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>87
asnvalseraspargaspphe
15
<210>88
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>88
glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr
151015
leulysileserargvalglualagluaspvalglyiletyrtyrcys
202530
<210>89
<211>36
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
多肽
<400>89
aspargasppheglyvalproaspargpheserglyserglysergly
151015
thraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalgly
202530
iletyrtyrcys
35
<210>90
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>90
metglnglythrleutrpproprothr
15
<210>91
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>91
metglnglythrleutrppropro
15
<210>92
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>92
pheglyglnglythrlysvalgluilelys
1510
<210>93
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>93
thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
1510
<210>94
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
6xhis标签
<400>94
hishishishishishis
15
<210>95
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成
肽
<400>95
leuglutrpilegly
15
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