稳定性改善的特异性地结合在人表皮生长因子受体2的抗体的制作方法

本专利申请主张2016年4月12日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2016-0044747的优先权，其公开内容在此引入作为参考。本发明涉及与人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her2)相关的疾病，尤其涉及用于癌症的预防或治疗的、稳定性改善的人表皮生长因子受体2抗体。
背景技术：
her2/neu(erbb2)基因编码185kda的跨膜糖蛋白，这是表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptors，egfr)家族之一。人表皮生长因子受体2蛋白由由620个氨基酸残基组成的细胞外结构域、23个氨基酸残基的跨膜结构域及具有酪氨酸激酶活性的490个氨基酸残基的细胞内结构域组成(akiyamat，etal.，science，232(4758):1644-1646(1986))。另一方面，在许多文献中公开了具有各种特性的人表皮生长因子受体2抗体，在这些人表皮生长因子受体2抗体中商业上最成功的抗体为曲妥珠单抗(trastuzumab)抗体(商品化为herceptintm，u.s.pat.no.5，821，337)。sapino，a.，etal.，annalsofoncology(2007)18:1963-1968；bussolati，g，etal.，britishjournalofcancer(2005)92，1261-1267；andglazyrina，etal.，jhistology&cytochemistry(2007)55(1):25-33。尽管曲妥珠单抗抗体在商业上是成功的，但该抗体仅在一些过表达人表皮生长因子受体2的患者中有效。因此，试图通过与曲妥珠单抗同时给药来改善对曲妥珠单抗无反应或略微反应的癌症患者的预后。例如，在wo2008/031531中公开了通过同时注射与作为相同的靶的人表皮生长因子受体2相结合的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(pertuzumab)来抑制癌症转移的方法，在wo2014/185704中公开了通过同时注射与曲妥珠单抗和人表皮生长因子受体2的不同表位相结合的hz1e11来具有抗肿瘤活性的方法。提高治疗性抗体的稳定性可以是提高整体效率的一种方式，例如节省成本、增加功效和减少副作用。因此，已经进行了有关通过变型治疗性抗体的序列来获得稳定性改善的抗体的研究(wo2010/047509；diepold，k.，etal.，plosone(2012)7(1):e30295；correia，ir.，mabs(2010)2(3):221-232)。在本发明的整个说明书中引用了许多论文和专利文献并标示了该引用。所引用的论文和专利文献的公开内容通过引用整体并入本文，从而更好地说明本发明所属领域的状态和本发明的内容。技术实现要素：本发明人试图改善由本发明开发的抗体的hz1e11(参考韩国专利第1453462号)的结构稳定性。抗体的结构稳定性药物商业化发展的重要因素，若结构稳定性不好，则存在质量控制变差，疗效降低，副作用增加的问题。在hz1e11的不同位置的氨基酸残基中，本发明人发现了可以极大地影响稳定性的四个氨基酸残基，并且制备了该氨基酸残基的取代突变体并完成了稳定性改善且生产率和功效类似于亲本抗体的hz1e11的突变体。因此，本发明的目的在于提供针对表现出改善的稳定性人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段。本发明的再一目的在于提供用于编码针对表现出改善的稳定性人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。本发明的另一目的在于提供包含上述核酸分子的重组载体。本发明还有一目的在于提供转化成上述重组载体的宿主细胞。本发明的又一目的在于提供用于预防或治疗癌症的药物组合物。本发明的又一目的在于提供包括向受试者注射上述用于预防或治疗癌症的药物组合物的步骤的预防或治疗癌症的方法。本发明的又一目的在于提供用于癌症诊断的试剂盒。根据以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图，本发明的其他目的及优点将变得更加明确。根据本发明的一实例，本发明提供针对表现出改善的稳定性her2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2)的抗体或其抗原结合片段，上述针对表现出改善的稳定性her2的抗体或其抗原结合片段包括：(a)重链可变区，包含：(i)序列表中第一序列的互补性决定区(complementaritydeterminingregion)h1；(ii)序列表中第二序列的互补性决定区h2；以及(iii)序列表中第3序列的互补性决定区h3，上述序列表中第二序列的第4个氨基酸残基和第5个氨基酸残基中的至少一个被另一个氨基酸取代突变；以及(b)轻链可变区，包含：序列表中第4序列的互补性决定区l1；序列表中第5序列的互补性决定区l2；以及序列表中第六序列的互补性决定区l3。本发明人试图改善由本发明开发的抗体的hz1e11(参考韩国专利第1453462号)的结构稳定性。抗体的结构稳定性药物商业化发展的重要因素，若结构稳定性不好，则存在质量控制变差，疗效降低，副作用增加的问题。在hz1e11的不同位置的氨基酸残基中，本发明人发现了可以极大地影响稳定性的四个氨基酸残基，并且制备了该氨基酸残基的取代突变体并完成了稳定性改善且生产率和功效类似于亲本抗体的hz1e11的突变体。在本发明人鉴定的4个氨基酸中，2个氨基酸残基位于重链可变区的互补性决定区h2。具体地，序列表中第二序列的互补性决定区h2的第4个氨基酸残基及第5个氨基酸残基为对结构稳定性产生影响的残基。当上述2个氨基酸中的至少一个被其他氨基酸取代时，保持亲本抗体的生产率及功效的同时改善稳定性。根据本发明，作为互补性决定区h2的第4个氨基酸残基的asn可以被任何其他氨基酸取代。根据本发明的一实例，互补性决定区h2的序列表中第二序列的第4个氨基酸残基被ala、gly、cys、ile、leu、met、phe、trp或val取代，更具体地，被ala、gly、ile、leu或val取代，进一步更具体地，被ala或gly取代，最具体地，被ala取代。根据本发明，作为互补性决定区h2的第5个氨基酸残基的gly可以被任何其他氨基酸取代。根据本发明的一实例，互补性决定区h2的序列表中第二序列的第5个氨基酸残基被ala、cys、ile、leu、met、phe、trp或val取代，更具体地，被ala、ile、leu或val取代，进一步更具体地，被ala或val取代，最具体地，被ala取代。本发明所采用的氨基酸取代策略是另一种氨基酸取代原始氨基酸，并且取代氨基酸具有低反应性r-基团，结构小且稳定。根据本发明的一实例，上述取代突变的序列表中第二序列的互补性决定区h2，包含：序列表中第9序列的氨基酸序列；序列表中第10序列的氨基酸序列；或者序列表中第11序列的氨基酸序列。根据本发明的一实例，本发明的突变体抗体除了重链可变区之外，可通过突变轻链可变区来提高稳定性。具体地，本发明的抗体的可变区，包含：序列表中第12序列的氨基酸序列；序列表中第13序列的氨基酸序列；或者序列表中第14序列的氨基酸序列。根据本发明的一实例，本发明提供针对表现出改善的稳定性人表皮生长因子受体2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2)的抗体或其抗原结合片段，上述针对表现出改善的稳定性人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段包括(a)重链可变区，包含：(i)序列表中第一序列的互补性决定区(complementaritydeterminingregion)h1；(ii)序列表中第二序列的互补性决定区h2；以及(iii)序列表中第3序列的氨基酸序列的互补性决定区h3；以及(b)轻链可变区，包含序列表中第8序列，上述序列表中第8序列的第56个氨基酸残基和第57个氨基酸残基中的至少一个被另一个氨基酸取代突变。在本发明人鉴定的4个氨基酸中，2个氨基酸残基位于框架区，而不是轻链可变区的互补性决定区。具体地，序列表中第8序列的第56个氨基酸残基和第57个氨基酸残基为对结构稳定性产生影响的残基。当上述2个氨基酸中的至少一个被其他氨基酸取代时，保持亲本抗体的生产率及功效的同时改善稳定性。根据本发明，作为序列表中第8序列的第56个氨基酸残基的asp可以被任何其他氨基酸取代。根据本发明的一实例，序列表中第8序列的第56个氨基酸残基被ala、gly、cys、ile、leu、met、phe、trp或val取代，更具体地，被ala、gly、ile、leu或val取代，进一步更具体地，被ala或gly取代，最具体地，被ala取代。根据本发明，作为序列表中第8序列的第57个氨基酸残基的gly可以被任何其他氨基酸取代。根据本发明的一实例，序列表中第8序列的第57个氨基酸残基被ala、cys、ile、leu、met、phe、trp或val取代，更具体地，被ala、ile、leu或val取代，进一步更具体地，被ala或val取代，更具体地，被ala取代。根据本发明的一实例，上述取代突变的序列表中第8序列的氨基酸序列，包含：序列表中第12序列的氨基酸序列；序列表中第13序列的氨基酸序列；或者序列表中第14序列的氨基酸序列。本发明的抗体针对各种表达人表皮生长因子受体2的癌细胞具有优秀的杀伤能力或增殖抑制能力。在本说明书中，术语“杀伤”或“增殖抑制”用于提及癌细胞，可互换使用。在本说明书中，术语“抗体(antibody)”是针对人表皮生长因子受体2的特异性抗体，不仅包括完整的抗体形式，而且包括抗体分子的抗原结合片段。完整的抗体是具有2个全长轻链及2个全长重链的结构，各个轻链以二硫键的方式与重链相连接。重链恒定区具有γ、μ、α、δ及ε类型，作为子类具有γ1、γ2、γ3、γ4、α1及α2。轻链的恒定区具有κ及λ类型(cellularandmolecularimmunology，wonsiewicz，m.j.，ed.，chapter45，pp.41-50，w.b.saundersco.philadelphia，pa(1991)；nisonoff，a.，introductiontomolecularimmunology，2nded.，chapter4，pp.45-65，sinauerassociates，inc.，sunderland，ma(1984))。在本说明书中，术语“抗原结合片段”是指具有抗原结合功能的片段，包含fab、f(ab')、f(ab')2及fv等。抗体片段中的fab是具有轻链及重链的可变区和轻链的恒定区及重链的第一个恒定区(ch1)的结构，具有1个抗原结合部位。fab'与fab的不同之处在于它在重链ch1结构域的c-末端具有包含一个以上的半胱氨酸残基的铰链区(hingeregion)。当fab'的铰链区的半胱氨酸残基产生二硫键时形成f(ab')2抗体。fv为仅具有重链可变部位及轻链可变部位的最小抗体片段，产生fv片段的重组技术公开在pct国际专利申请wo88/10649、wo88/106630、wo88/07085、wo88/07086及wo88/09344中。在双链fv(two-chainfv)中，以非共价键的方式重链可变部位与轻链可变部位相连接，在单链fv(single-chainfv)中，一般通过肽接头来以共价键的方式重链的可变区与单链的可变区相连接或者在c-末端中彼此直接连接，从而像双链fv一样能够获得二聚体结构。这种抗体片段可以使用蛋白质水解酶来获得(例如，当用限制的木瓜蛋白酶切割整体抗体时，可以获得fab，当用胃蛋白酶切割时，可以获得f(ab')2片段)，而且可通过基因重组技术来制备。在本发明中，抗体优选为fab形式或完整的抗体形式。并且，重链恒定区可以选自由γ、μ、α、δ或ε中的任何一个同种型。优选地，恒定区为igg1、igg3及igg4，最优选为igg1同种型。轻链恒定区可以为κ或λ形式，优选为κ形式。因此，本发明的优选的抗体为具有κ轻链和γ1重链的fab形式或igg1形式。在本说明书中，术语“重链”均意味着包含可变区结构域vh及3个恒定区结构域ch1、ch2及ch3的全长重链及其的片段，上述可变区结构域vh包含具有能够向抗原赋予特异性的足够的可变区序列的、氨基酸序列。并且，在本说明书中，术语“轻链”均意味着包含可变区结构域vl及恒定区结构域cl的全长轻链及气的片段，上述可变区结构域vl具有能够向抗原赋予特异性的足够的可变区序列的、氨基酸序列。在本说明书中，术语“cdr(complementaritydeterminingregion)”是指免疫球蛋白重链及轻链的高变区(hypervariableregion)的氨基酸序列(kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，4thed.，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nationalinstitutesofhealth(1987))。在重链(cdrh1、cdrh2及cdrh3)及轻链(cdrl1、cdrl2及cdrl3)中分别包含3个cdrs。cdr为抗体与抗原或表位相结合提供主要的接触残基。本发明的抗体包含单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链fvs(scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab')片段、二硫键连接的fvs(sdfv)及抗独特型(抗-id)抗体，而且上述抗体的表位结合片段等，但不仅局限于此。根据本发明的再一实例，本发明提供用于编码上述的本发明的针对人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。在本说明书中，术语“核酸分子”是指在涵盖全面意义上的dna(gdna及cdna)和rna分子，在核酸分子中，核苷酸是核酸分子中的基本组成单元，不仅包括天然核苷酸，还包含糖或碱部分被修饰的类似物(analogue)(scheit，nucleotideanalogs，johnwiley，newyork(1980)；uhlman及peyman，chemicalreviews，90:543-584(1990))。根据本发明的另一实例，本发明提供包含上述的本发明的核酸分子的重组载体。在本说明书中，术语“载体”作为在宿主细胞中表达目的基因的手段，包含质粒载体、粘粒载体、病毒载体、噬菌体载体、腺病毒载体，逆转录病毒载体及如与腺相关病毒载体等的病毒载体。根据本发明的优选实例，在本发明的载体中，用于编码轻链可变区的核酸分子以及用于编码重链可变区的核酸分子与启动子可操作地连接(operativelylinked)。在本说明书中，术语“可操作地连接”是指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录因子结合位点的阵列)和其他核酸序列之间的功能性连接，由此上述调节序列能够调节上述其他核酸序列的转录及/或者解读。本发明的重组载体系统可以通过本发明所属领域所属领域中已知的各种方法构建，其具体方法公开在sambrooketal.，molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress(2001)中，其通过引用并入本文。通常可以将本发明的载体构建为用于克隆的载体或用作表达的载体。另外，可以通过使用原核细胞或真核细胞作为宿主来构建本发明的载体。例如，例如，当本发明的载体是表达载体并且当真核细胞用作宿主时，可以使用来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人异源启动子(例如，人体肌肉肌酸蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子、猿猴空泡病毒40(simianvacuolatingvirus40，sv40)启动子、巨细胞病毒启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsvtk)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mousemammarytumorvirus，mmtv)启动子、人类免疫缺陷病毒长末端重复序列(hivltr)启动子、莫洛尼病毒启动子、埃-巴二氏病毒(epstein-barrvirus，ebv)启动子及呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)启动子)，通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。本发明的载体可以与其他序列融合，以便于纯化由其表达的抗体。融合的序列为例如谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia，usa)、麦芽糖结合蛋白(恩益碧(neb)公司，美国(usa))、flag(ibi公司，美国)及6xhis(六氢胞苷(hexahistidine)；quiagen公司，美国)等。并且，另外，由于本发明的载体表达的蛋白质是抗体，因此可以通过蛋白质a柱等容易地纯化表达的抗体，而无需任何额外的纯化顺序。另一方面，本发明的表达载体包含作为选择标记的本发明所属领域中常用的抗生素抗性基因，例如，具有针对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素及四环素的抗性基因。根据本发明的还有一实例，本发明提供转化成上述重组载体的宿主细胞。能够以稳定的方式连续克隆和表达本发明载体的宿主细胞可以使用于本发明所属领域已知的任何宿主细胞中，例如，上述载体的合适的真核宿主细胞可以选自猴肾细胞(monkeykidneycells，cos7)、鼠科骨髓瘤细胞(ns0细胞)、骨髓瘤细胞(sp2/0)、中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovary，cho)、w138、幼仓鼠肾细胞(babyhamsterkidney，bhk)、狗肾细胞(madin-darbycaninekidney，mdck)、骨髓瘤细胞系、人t淋巴细胞白血病细胞(hut78细胞)及人胚肾细胞(hek-293细胞)，但不仅局限于此。根据本发明的又一实例，本发明提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，上述用于预防或治疗癌症的药物组合物包含：(a)上述的本发明的人表皮生长因子受体2抗体或其抗原结合片段的药学上有效量；以及(b)药学上可接受的载体。并且，根据本发明的又一实例，本发明提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，上述用于预防或治疗癌症的药物组合物包含：本发明的针对人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段；以及包含1mm至200mm的组氨酸的组氨酸缓冲液。根据本发明的一实例，包含在上述组氨酸缓冲液的组氨酸的浓度可以为1mm至200mm，更具体地，可以为1mm至150mm、1mm至100mm、1mm至50mm、1mm至40mm、1mm至30mm、1mm至20mm，最具体地，可以为10mm。并且，根据本发明再一实例，上述组氨酸缓冲液的氢离子浓度指数ph值可以为5至7，更具体地，可以为5至6.5、5.5至6.5，最具体地，可以为6。并且，根据本发明的另一实例，上述组氨酸缓冲液可以包含50mm～300mm的氯化钠(sodiumchloride)，更具体地，可以为10mm～200mm、50mm～200mm、100mm～200mm，最具体地，可以为150mm。根据本发明的一实施例，在本发明的人表皮生长因子受体2抗体或其抗原结合片段中，存储在如上所述的上述组氨酸缓冲液中的情况与存储在磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline，pbs)中的情况时相比，在苛刻的条件下也表现出极好的稳定性。因此，包含本发明的组氨酸缓冲液的用于预防或治疗癌症的药物组合物在提高包含本发明的人表皮生长因子受体2抗体或其抗原结合片段作为活性成分的、药物组合物的稳定性的方面上具有极好的效果。本发明的药物组合物使用上述的本发明的人表皮生长因子受体2抗体或其抗原结合片段作为有效成分，省略对两者共同的描述，以避免由重复描述引起的本说明书的过度复杂。如以下实施例中所证明，当与曲妥珠单抗一起同时注射本发明的人表皮生长因子受体2抗体时，可以通过显著提高的细胞杀伤能力杀死癌细胞(尤其为乳腺癌细胞、更具体为表达人表皮生长因子受体2的乳腺癌细胞)，因此对癌症(尤其为乳腺癌症，更具体为表达人表皮生长因子受体2的乳腺癌)的治疗非常有效。根据本发明的一实例，药物组合物还包含曲妥珠单抗抗体。可以通过本发明的组合物预防或治疗的癌症包含本发明所属领域中公知的各种癌症，例如，乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肝癌、支气管癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌或输尿管癌。具体地，可以通过本发明的组合物预防或治疗的癌症为表达人表皮生长因子受体2的癌症，更具体为表达人表皮生长因子受体2的乳腺癌。包含在本发明的药物组合物的药学上可接受的载体通常用于本发明，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、金合欢树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但不仅局限于此。本发明的药物组合物除了上述成分之外，还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体及制剂详细加载在remington'spharmaceuticalsciences(19thed.，1995)中。本发明的药物组合物可以用本发明的药物组合物可以肠胃外给药，例如，可通过静脉内输注、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、局部给药、鼻内给药、肺内给药及直肠给药来给药。本发明的药物组合物的适当剂量根据诸如制剂方法、给药方法、年龄、体重、性别、病理状况、食物、给药时间、给药途径、排泄率和患者的反应性等因素而变化，通常，熟练的医生可以容易地确定和开出对所需治疗或预防有效的剂量。根据本发明的优选实例，本发明的药物组合物的日剂量为0.0001～100mg/kg。如本文所用，术语“药学有效量”是指足以预防或治疗癌症的量。本发明的药物组合物可以通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂根据本发明所属领域的普通技术人员容易实施的方法制备成单位剂型或者可通过插入于多剂量容器来制备。制剂可以为油或含水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者是赋形剂、粉末、栓剂、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，并且还可以包含分散剂或稳定剂。根据本发明的一实例，本发明的药物组合物还包含曲妥珠单抗抗体。在本说明书中，术语“曲妥珠单抗(trastuzumab)”是指公开在美国专利第5，821，337号中的抗体。根据本发明的再一实例，本发明提供预防或治疗癌症的方法，上述预防或治疗癌症的方法包括向受试者(subject)注射包含上述的本发明的针对人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段作为有效成分的药物组合物的步骤。在本说明书中使用的术语“给药”或“注射”是指将治疗有效量的本发明的组合物注射于受试者(个体)，使得上述组合物在受试者的体内形成相同的量。组合物的“治疗有效量”是指足以为要注射组合物的受试者提供治疗或预防效果的组合物的量，因此包括“预防有效量”。本文所使用的术语“受试者”包括但不限于人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴。具体地，本发明的受试者为人类。本发明的上述预防或治疗癌症的方法为包括本发明的一实例的用于预防或治疗癌症的药物组合物的步骤的方法，因此省略重复内容以避免本说明书中描述的过度复杂性。本发明的上述的针对人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段可以用于诊断，例如用于诊断癌症。因此，根据本发明的另一实例，本发明提供包含上述的本发明的针对人表皮生长因子受体2的抗体或其抗原结合片段的、用于癌症诊断的试剂盒。本发明的诊断试剂盒包含上述的本发明的针对人表皮生长因子受体2抗体或其抗原结合片段，并诊断出与本发明的药物组合物相同的疾病，为了避免由反复记载所引起的本说明书的过度复杂，省略对两者的共同描述。上述试剂盒包含抗体，因此基本上以适合于各种免疫测定(immunoassay)或免疫染色(immunostaining)的抗体的方式制备成。上述免疫测定或免疫染色包括放射免疫分析法、放射免疫沉淀法、免疫沉淀法，酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)、捕获elisa方法、抑制或竞争分析、夹心分析法、流式细胞术(flowcytometry)、免疫荧光染色和免疫亲和纯化，但不仅局限于此。上述免疫测定或免疫染色方法记载在enzymeimmunoassay，e.t.maggio，ed.，crcpress，bocaraton，florida，1980；gaastra，w.，enzyme-linkedimmunosorbentassay(elisa)，inmethodsinmolecularbiology，vol.1，walker，j.m.ed.，humanapress，nj，1984；以及edharlowanddavidlane，usingantibodies:alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，1999中，其通过引用并入本文。例如，当根据放射性免疫分析法进行本发明的方法时，可以用放射性同位素(例如，c14、i125、p32及s35)标记的抗体来检测人表皮生长因子受体2蛋白。当通过酶联免疫吸附测定方法实施本发明时，本发明的特定实施例包括：步骤(i)，将需要分析的试料涂敷于固体基质的表面；步骤(ii)，作为第一抗体的人表皮生长因子受体2抗体与上述试料进行反应；步骤(iii)，上述步骤(ii)的产物与酶偶联的第二抗进行反应；以及步骤(iv)，用于测量上述酶的活性。合适的固体基质是烃聚合物(例如，聚苯乙烯和聚丙烯)、玻璃、金属或凝胶、最具体为微量滴定板。结合在上述第二抗体的酶包含用于催化显色反应、荧光反应、红外发光反应的酶，但不仅局限于此，例如，包含碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶和细胞色素p450。当碱性磷酸酶用作结合在上述第二抗体的酶时，作为基质使用如溴氯吲哚基磷酸盐(bcip)、硝基蓝四唑(tetranitrobluetetrazoliumchloride，nbt)、萘酚-as-b1-磷酸盐(naphthol-as-b1-phosphate)和增强化学荧光(enhancedchemifluorescence，ecf)显色反应基质，当使用辣根过氧化物酶时，氯萘酚、氨基乙基咔唑、二氨基联苯胺、d-荧光素、光泽精(双-n-甲基吖啶硝酸盐)、试卤灵苄基醚、鲁米诺、荧光试剂(10-乙酰基-3,7-二羟基苯氧嗪)、羟胺还原酶(p-phenylenediamine-hclandpyrocatechol，hyr)、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2，2-azine-di[3-ethylbenzthiazolinesulfonate]，abts)、邻苯二胺(o-phenylenediamine，opd)及萘酚/派若宁、葡萄糖氧化酶和硝基蓝四氮唑(nitrobluetetrazolium，t-nbt)以及m-pms(phenzainemethosulfate)等的基质。当用捕获elisa方法来实施本发明时，本发明的特定实施例包括：步骤(i)，用人表皮生长因子受体2抗体作为捕获抗体(capturingantibody)涂敷于固体基质的表面；步骤(ii)，使捕获抗体与试料进行反应；步骤(iii)，上述步骤(ii)的产物与结合在产生信号的标记的人表皮生长因子受体2检测抗体(detectingantibody)进行反应；以及步骤(iv)，用于测量源自标记产生的信号。上述检测抗体具有产生可检测信号的标记。上述标记包含化学物质(例如，生物素)、酶(碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，辣根过氧化物酶和细胞色素p450)、放射性物质(例如，c14、i125、p32及s35)，荧光材料(例如，荧光素)、发光材料、化学发光材料(chemiluminescent)及荧光能量共振转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，fret)，但不仅局限于此。各种标记及标记方法记载在edharlowanddavidlane，usingantibodies:alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，1999中。在上述酶联免疫吸附测定方法及捕获elisa方法中，最终酶的活性或信号的测量可根据本发明所属领域中已知的各种方法实施。若使用生物素作为标记，则可以用链霉抗生物素蛋白容易地检测信号，若使用荧光素酶，则可以用荧光素容易地检测到信号。可适用于本发明的试剂盒的试料包含细胞、组织或组织来源的提取物、裂解物(lysate)或纯化水、血液、血浆、血清、淋巴或腹水，但不仅局限于此。本发明的抗体可用于体内成像或体外成像。根据本发明的另一实例，本发明提供包含缀合物的成像用组合物，在上述缀合物中，所述的本发明的抗体和产生连接在上述抗体的可检测信号的标记相连接。产生上述可检测信号的标记包含t1对比材料(例如，gd螯合化合物)、t2对比材料(例如，超晶格材料(例如，磁铁矿、fe3o4、γ-fe2o3、锰铁氧体、钴铁氧体及镍铁氧体))、放射性同位素(例如，11c、15o、13n、p32、s35、44sc、45ti、118i、136la、198tl、200tl、205bi及206bi)、荧光材料(荧光素(fluorescein)、藻红蛋白(phycoerythrin)、罗丹明、丽丝胺(lissamine)以及cy3和cy5)、化学发光部分、磁性颗粒、质量标记或电子致密颗粒，但不仅局限于此。本发明的特征及优点总结如下。(a)在本发明中，通过取代亲本抗体的特定部位上的氨基酸残基来提高抗体的稳定性，从而改善成药性(druggability)。(b)本发明的突变体抗体与作为亲本抗体的hz1e11相比，生产率和功效几乎相同且具有显著提高的稳定性。(c)因此，针对人表皮生长因子受体2-特异性抗体的开发，本发明的突变体抗体显示出降低生产成本、抑制功效降低及减少副作用等的优秀特性。附图说明图1为分析稳定性改善的抗体是否特异性地结合在人表皮生长因子受体2所属的erbb家族蛋白(her1、her2、her3及her4)中的人表皮生长因子受体2的、酶联免疫吸附测定结果的图。hz15e3、曲妥珠单抗、amg-888(参考lic.etal.，discovmed.2013sep；16(87):79-92)用作对照抗体。在图表中anti-her2ab显示曲妥珠单抗；anti-egfrab显示hz15e3；anti-her3ab显示amg-888。另一方面，2ndonly显示阴性对照组。图2为分析开发的抗体和在将曲妥珠单抗单独处理在nci-n87细胞时产生细胞灭亡的癌细胞的比例的结果。在图表中，higg显示人类igg的阴性对照组，tra显示曲妥珠单抗。图3为分析开发的抗体和在将曲妥珠单抗同时使用在nci-n87细胞时产生细胞灭亡的癌细胞的比例的结果。在图表中，higg显示人类igg的阴性对照组，tra显示曲妥珠单抗。具体实施方式以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。本发明所属领域的普通技术人员应该理解，这些实施例仅用于更详细地描述本发明，而且根据本发明的要旨本发明的范围不受这些实施例的限制。实施例实施例1用于提高稳定性的抗体的变型为了提高作为开发的抗体的hz1e11(参考韩国专利第1453462号)的稳定性，而分析了不同位置的氨基酸残基对抗体稳定性的影响。根据分析结果，重链和轻链的四个可变区的氨基酸被鉴定为可影响稳定性的位点。作为亲本抗体的hz1e11的重链及轻链可变部位氨基酸序列如表1所示，利用重叠聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)来按重链区中的kabat编号对应于52a、53的asn(n)及gly(g)和对应于轻链区中的56、57的asp(d)及gly(g)转化成ala(a)。扩增重链及轻链的可变部位和恒定区部位之后，链接这些并克隆。扩增中使用的引物为如表2所示，利用上述的引物及gotaqdna聚合酶(promega公司，cat.no.m3005)在95℃下进行pcr反应30秒钟；在57℃下进行pcr反应30秒钟；在72℃下进行pcr反应60秒钟并反复30次。将扩增的可变区和恒定区的各个pcr产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳后，利用qiaquickgel提取试剂盒(凯杰公司(qiagen)，cat.no.28706)进行纯化。为了连接可变区和恒定区而以相同的量来混合可变区的pcr产物和恒定区的pcr产物之后，利用可变区的正向引物及恒定区的反向引物执行重叠延伸pcr(overlapextensionpcr)来制备基因产物，并以与上述相同的方式进行纯化。在上述重叠延伸pcr中，利用gotaqdna聚合酶(普洛麦格公司(promega)，cat.no.m3005)在94℃下进行反应30秒钟；在57℃下进行反应30秒钟；在72℃下进行反应120秒钟并反复30次。为了确定各个部位对稳定性的影响，包括单独变型的抗体和变更两个部位的氨基酸序列的抗体在内总共确保了8种抗体(表3)。表1表2用于扩增可变区域的引物引物名称序列f_n52aagtagcctacatctccgccgggggcggaagtacr_n52aagtacttccgcccccggcggagatgtaggctacf_g53actacatctccaacgccggcggaagtacgtar_g53atacgtacttccgccggcgttggagatgtagf_d56agcaacgagtctcgctgccggtgtgccttccagar_d56atctggaaggcacaccggcagcgagactcgttgcf_g57acgagtctcgctgacgccgtgccttccagatttr_g57aaaatctggaaggcacggcgtcagcgagactcg表3实施例2:变型的抗体的生产率确认为了确认用于提高稳定性的变型是否对作为亲本抗体的hz1e11的生产率产生影响而进行了生产率分析。根据韩国专利第1453462号中公开的的方法制备了实施例1的突变的抗体的克隆载体。在freestyletm293f(英杰公司(invitrogen)，cat.no.r790-07)动物细胞中，利用聚乙烯亚胺(polyscience公司，cat.no.23966)瞬时转化(transienttransfection)上述克隆的载体，从细胞培养液中利用protein-aceramichyperdf树脂(颇尔公司(pall)，catno.20078-028)来纯化变型的抗体。利用紫外线分析来定量纯化的抗体，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，sds-pag)后，通过考马斯亮蓝染色确认浓度及纯度。根据生产率分析，可确认出仅单独变型重链的hz1e11.10和hz1e11.20与作为亲本抗体的hz1e11相比具有更好的生产率。然而发现仅单独变型轻链的hz1e11.01和hz1e11.02反而降低了生产率。在同时变型轻链和重链的抗体的情况下，作为亲本抗体的hz1e11的生产率呈现稍微低的水平，如以下表4中所示。表4抗体栽培量(ml)生产量(μg)产率(mg/l)hz1e11.10301.41447.1hz1e11.20301.26442.1hz1e11.01300.78426.1hz1e11.02300.75025.0hz1e11.11300.85728.6hz1e11.12300.78326.1hz1e11.21300.64021.3hz1e11.22300.84528.2hz1e11300.99233.1实施例3针对人表皮生长因子受体2的抗体开发作为用于确认针对稳定性改善的人表皮生长因子受体2的抗体是否与作为靶的人表皮生长因子受体2相结合的方法使用了酶联免疫吸附测定方法。为了进行酶联免疫吸附测定，利用动物细胞生产erbb家族蛋白的胞外结构域(extracellulardomain，ecd)部位之后用作抗原。利用hindiii和bamhi限制酶在pcep4载体(invitrogen公司，cat.no.v044-50)克隆ecd的c-末端与人类igg1的铰链及fc部位(ch2-ch3)相连接的形式的dna。接着，在freestyletm293f(invitrogen，cat.no.r790-07)细胞中，利用聚乙烯亚胺(polyscienceinc.，cat.no.23966)瞬时转化上述克隆的载体，从细胞培养液中，利用protein-aceramichyperdf树脂(pall，catno.20078-028)纯化egfr-ecffc、her2-ecdfc、her3-ecdfc融合蛋白。利用蛋白质测定染料(proteinassaydye)(伯乐公司(bio-rad)，cat.no.500-0006)来定量纯化的蛋白并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)后，通过考马斯亮蓝染色确认浓度及纯度。用1μg/ml的浓度在costar96-孔板(康宁公司(corning)，cat.no.3590)上，在室温下固定egfr-ecf-fc、her2-ecd-fc、her3-ecd-fc或chrompurehumanigg(higg，jacksonimmunoresearchlab公司，cat.no.009-000-003)1小时。用tbs-t(0.05％的triton×-100)清洗3次后，用300μl的tbs-t/sm(2％的脱脂乳(skimmilk))在室温下封闭30分钟。在清洗封闭的板3次后，加入稳定性改善的人表皮生长因子受体2抗体并在37℃下结合抗体1小时。在清洗3次后，将第二抗体的抗小鼠igg-hrp(pierce公司，cat.no.31439)用1:5000比例来稀释并加入于tbs-t/sm，在37℃下结合抗体1小时。在清洗3次后，加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb)(surmodics，cat.no.tmbc-1000-01)并在室温下显色5分钟，并追加1n硫酸(sulfuricacid，韩国德山公司(duksan)，cat.no.254)来停止显色。利用victor×3(珀金埃尔默公司(perkinelmer)，cat.no.2030-0030)测量450nm处的吸光度，确认是否特异性地结合在her2-ecd-fc。作为确认酶联免疫吸附测定是否正常执行的对照组使用与egfr相结合的anti-egfrab(hz15e3)、anti-her2ab(曲妥珠单抗)、anti-her3ab(amg-888)。并且确认出为了提高稳定性而变型的8种抗体仅与人表皮生长因子受体2特异性地结合(图1)。实施例4开发的抗体之间的细胞成长抑制功效比较为了提高稳定性而执行用于确认变型的抗体之间的细胞增殖抑制功效的细胞活力测定(cellviabilityassay)。在细胞活力测定中，将过表达人表皮生长因子受体2的代表性胃癌细胞系的nci-n87细胞作为对象，单独或与曲妥珠单抗组合进行。在组合处理的情况下，将开发的抗体和曲妥珠单抗以1:1的比例(重量比)来混合使用。在96-孔板中将nci-n87(美国模式菌种收集中心(atcc)，catno.crl-5822，10000cells/well)以80μl的体积分配到96-孔板中培养24小时并固定。第二天，将40μl的抗体添加在上述培养中的细胞中。对于处理的抗体的最终浓度，每种抗体的最大浓度为20μg/ml，以1:4的比例来依次稀释并在9种浓度上进行。在与曲妥珠单抗组合处理的情况下，开发的抗体和曲妥珠单抗的比例为1:1(例如，在图3中，当剂量为1μg/ml时，注射1μg/ml的tra及1μg/ml的开发的抗体)。在处理抗体后，在追加培养nci-n87细胞4天后，添加cck-8至最终浓度为10％，并在37℃下处理3小时。之后，利用victor×-3测量450nm处的吸光度。将未处理抗体的细胞的吸光度设定为100％，计算出相对的存活率(图2及图3)。稳定性改善的8种人表皮生长因子受体2抗体针对与曲妥珠单抗反应的nci-n87细胞系显示增殖抑制功效。尤其，在开发的抗体中，与作为亲本抗体的hz1e11相同，在与曲妥珠单抗组合处理时，与单独的曲妥珠单抗相比，相对于nci-n87细胞系表现出优异的癌细胞增殖抑制功效(图2及图3)。实施例5根据存储缓冲液的亲本抗体及开发的抗体的稳定性比较本发明人为了确认开发的突变抗体的稳定性而对从cho细胞中获得的亲本抗体hz1e11和突变抗体的hz1e11.10、hz1e11.11，进行了加速试验(acceleratedtest，stresstest)。将上述各个抗体分别存储在pbs缓冲液(137mm的氯化钠(sodiumchloride)、2.7mm的氯化钾(potassiumchloride)、4.3mm的磷酸钠(sodiumphosphate)、1.4mm的钾(potassium)，ph值为7.4)，或者组氨酸缓冲液(10mm的组氨酸(histidine)、150mm的氯化钠(sodiumchloride)、ph值为6.0)。将分别储存在上述各个缓冲液的200μl的每个抗体分配到高性能液体色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)用小瓶(安捷伦公司(agilent)，catno.5188-6591)中，用蓝色螺旋盖(安捷伦公司(agilent)，catno.5182-0717)关闭盖子来制备样品。以1mg/ml的浓度来准备尺寸排除色谱法(sizeexclusionchromatography，sec)样品，以10mg/ml的浓度来准备阳离子交换色谱(cation-exchangechromatography，cex)样品。利用恒温恒湿试验箱(杰奥特公司，catno.th-dg-150)和冰箱(杰奥特公司，catno.clg-150s)，在4±3℃温度下、在25±3℃(湿度为60±5％)温度下、在40±3℃(湿度为75±5％)的温/湿度条件下分别存储上述准备的样品，在储存后第0周、第4周分析了各个样品的稳定性。使用agilent1260infinityhplc设备分析样品，用尺寸排除色谱法(size-exclusionchromatography)确认单体的比例，来确认不同条件下的稳定性，并用阳离子交换色谱法(cation-exchangechromatography)确认主峰(mainpeak)的比率并确认稳定性。具体地，为了分析单体比例，在100mm的磷酸钠(sodiumphosphate)(ph值为6.8)(单碱(monobasic)，fluka公司，catno.17844；二盐基(dibasic)，fluka公司，catno71633)溶液的条件下，将50μl的各抗体蛋白加入于tsk-gelg3000swxl(7.8×300mm)hplc柱(tosoh，partno.8541)后，用0.8ml/min的速度流速倒入20分钟，并在uv280nm处检测蛋白峰。蛋白的聚集体在主峰之前从柱中洗脱，通过比较聚集体的峰面积和主峰面积来计算单体的纯度。为了分析主峰(mainpeak)比例，而将蛋白用10mm的磷酸钠(sodiumphosphate)(ph值为7.0)(单碱(monobasic)，fluka公司，catno.17844；二盐基(dibasic)，fluka公司，catno.71633)缓冲液稀释至1mg/ml并将20μl溶液注入至biomab(np10，pk，4.6×250mm)hplc柱(安捷伦公司(agilent)，catno.5190-2415)之后，将10mm的磷酸钠(sodiumphosphate)(ph值为7.0)(单碱(monobasic)，fluka公司，catno.17844；二盐基(dibasic)，fluka公司，catno.71633)、1m的氯化钠(sodiumchloride)(generay，catno.0241)缓冲液以1ml/min的速度、以0～10％的浓度梯度(gradient)来流动40分钟，同时在紫外线280nm处检测蛋白峰。表5和表6中示出了通过尺寸排阻色谱法和阳离子交换色谱法来分析由pbs组成的缓冲液中的抗体稳定性的结果。并且，表7和表8中示出了通过尺寸排阻色谱法和阳离子交换色谱法来分析由组氨酸组成的缓冲液中的抗体稳定性的结果。表5表6表7表8用尺寸排除色谱法分析的结果，确认出所有3种抗体具有95％以上的单体，用阳离子交换色谱法分析的结果，确认出与作为亲本抗体的hz1e11相比，作为本发明的突变抗体的hz1e11.10和hz1e11.11的主峰含量更高。尤其，在由组氨酸组成的缓冲液的情况下，确认出与由pbs组成的缓冲液相比，突变抗体显示出比亲本抗体更好的稳定性。以上，对本发明的示例性实施例进行了详细的描述，本发明所属领域的普通技术人员应当理解为，这种具体实施例仅是优选实施例，本发明不仅局限于此。因此，本发明的实际范围旨在由发明要求保护范围和其等同物限定。序列表<110>abcclon,inc<120>稳定性改善的特异性地结合在人表皮生长因子受体2的抗体<130>pp170029<150>kr10-2016-0044747<151>2016-04-12<160>14<170>kopatentin2.0<210>1<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11抗体的cdrh1<400>1sertyrthrmetser15<210>2<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11抗体的cdrh2<400>2tyrileserasnglyglyglyserthrtyrtyrproaspthrvallys151015gly<210>3<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11抗体的cdrh3<400>3hisleuglyglythralaserpheasptyr1510<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11抗体的cdrl1<400>4leualaserglnthrileglythrtrpleuala1510<210>5<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11抗体的cdrl2<400>5alathrserleualaasp15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11抗体的cdrl3<400>6glnglnleutyrserthrprotrpthr15<210>7<211>119<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11重链可变区的氨基酸序列<400>7gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530thrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alatyrileserasnglyglyglyserthrtyrtyrproaspthrval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaarghisleuglyglythralaserpheasptyrtrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserser115<210>8<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11轻链可变区的氨基酸序列<400>8aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysleualaserglnthrileglythrtrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrvalalathrserleualaaspglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleutyrserthrprotrp859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>9<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11.10的cdrh2<400>9tyrileseralaglyglyglyserthrtyrtyrproaspthrvallys151015gly<210>10<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11.20的cdrh2<400>10tyrileserasnalaglyglyserthrtyrtyrproaspthrvallys151015gly<210>11<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>hz1e11.10/20的cdrh2<400>11tyrileseralaalaglyglyserthrtyrtyrproaspthrvallys151015gly<210>12<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>hzle11.01轻链可变区的氨基酸序列<400>12aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysleualaserglnthrileglythrtrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrvalalathrserleualaalaglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleutyrserthrprotrp859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>13<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>hzle11.02轻链可变区的氨基酸序列<400>13aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysleualaserglnthrileglythrtrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrvalalathrserleualaaspalavalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleutyrserthrprotrp859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>14<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>hzle11.01/02轻链可变区的氨基酸序列<400>14aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysleualaserglnthrileglythrtrp202530leualatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrvalalathrserleualaalaalavalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnleutyrserthrprotrp859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105当前第1页12