诸如生物药物或工业相关生物催化剂的重组蛋白最常通过在微生物中进行异源基因表达的方式生产。经常使用大肠杆菌(escherichiacoli)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和丝状真菌并长期将其用于重组蛋白的生产。在过去二十年中，甲基营养型酵母komagataella(pichia)pastoris、komagataella(pichia)phaffii(pp)、komagataellakurtzmanii、ogataea(hansenula)polymorpha(hp)、candidaboidinii(cb)和ogataea(pichia)methanolica(pm)已成为有效的替代生产菌株。这些菌株使高细胞密度的异源蛋白实现高速表达成为可能。在上述四个酵母物种中，p.pastoris(komagataellaphaffii)在此期间最长用于异源蛋白生产。
所有甲基营养型酵母均具有严格调控的强启动子，其参与甲醇利用(mut)基因表达的调控。甲醇利用基因的启动子通常在存在抑制碳源(如葡萄糖)时被抑制，并且在存在甲醇作为碳源时极大地上调。如果抑制碳源被耗竭或在存在非抑制性碳源的条件下，则所述启动子通过解阻遏被活化，因此这种作用的强度在物种之间以及甚至在同一生物体内可能变化极大。例如，与甲醇诱导条件相比，在解阻遏条件下，在p.pastorisgs115(pppaox1)中醇氧化酶-1基因的启动子仅具有2-4％的活性。而与此相反的是，与甲醇诱导条件相比，在解阻遏条件下，在h.polymorpha(phpmox)中直系同源物基因(甲醇氧化酶，mox)的启动子具有高达70％的活性。而且在c.boidinii(醇氧化酶1，aod1)和p.methanolica(甲醇氧化酶1/2，mod1/2)中的直系同源物基因的启动子也具有类似的行为。
出于操作安全性方面的原因，特别是在大规模工业生产中使用具有毒性和可燃性的甲醇诱导表达的不利的，因此强解阻遏启动子构成了有利的替代方案。因此，最近开发了具有不同解阻遏性质的pppaox1变体、替代启动子和新型mut启动子，以使得能够在工业生产规模上实现无甲醇蛋白表达。由于与甲醇诱导的启动子相比，此类启动子的表达速率通常低很多，因而本发明的一个目的是提供重组蛋白在酵母(如p.pastoris)中可诱导的和无甲醇强过表达替代的可能性。
使用komagataella属酵母细胞实现了这一目的，所述细胞包含可通过解阻遏诱导的甲基营养型酵母细胞的直系同源启动子或其变体，其中所述直系同源启动子是甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(fmd)或甲醇氧化酶(mox)启动子；在这一过程中，在甲基营养型酵母细胞中的直系同源启动子能够在解阻遏条件下控制多肽的表达。
使用komagataella(pichia)属酵母细胞也实现了这一目的，所述细胞包含甲基营养型酵母细胞的直系同源甲酸脱氢酶(fmd)启动子和/或甲醇氧化酶(mox)启动子或者这两种启动子的变体，其中在komagataella属酵母细胞中直系同源启动子的原始调控性质被保留。
令人惊讶地发现，在其他甲基营养型酵母细胞中也具有能够在解阻遏条件下控制多肽表达的启动子，其优选地不属于komagataella(pichia)属，能够在解阻遏条件下控制多肽的表达(例如，与非解阻遏条件相比表达增加)，其也具有与在komagataella(pichia)属酵母细胞中相似的性质。
此外，令人惊讶地发现，在komagataella属酵母细胞中和/或在相同酵母细胞中不天然存在的甲基营养型酵母细胞的甲酸脱氢酶(fmd)启动子和/或甲醇氧化酶(mox)启动子在此类细胞中具有特定的性质。在解阻遏条件下和在甲醇诱导的条件下在komagataella细胞中的直系同源fmd和/或mox启动子均显著强于所有天然存在的启动子，其在komagataella中参与甲醇利用基因的表达(“mut启动子”)并且到目前为止已对其进行了检测。因此，在解阻遏条件下直系同源fmd和/或mox启动子显著强于komagataella细胞中天然存在的cat1和gap启动子，例如。直系同源fmd和/或mox启动子甚至令人惊讶地与在甲醇诱导条件下在komagataella中天然存在的aox(aox1和aox2)启动子一样强，且其所使用的筛选条件是在解阻遏条件下，而非在甲醇诱导条件下使用aox启动子。在生物反应器实验中，在控制c源剂量的条件下通常可以加强这种作用。直系同源fmd和/或mox启动子可以代替通常在komagataella中使用的aox启动子。与传统甲醇诱导的表达系统相比，这种方式可以实现基本相同或者甚至更高的蛋白表达收率，但是不需要使用任何甲醇作为诱导剂。令人惊讶的是，在这种酵母细胞(例如，在h.polymorpha中)也显著解阻遏的甲基营养型酵母细胞的甲酸脱氢酶(fmd)启动子(例如，h.polymorpha的)甚至在其他甲基营养型酵母细胞(例如，p.pastoris)中也保留了这种调控性质。而与之相反的是，早期研究表明，在启动子在甲基营养型酵母之间的转移中，外源启动子的调控性质是不能转移的(例如，p.pastorisaox1启动子例如在h.polymorpha中没有与其在p.pastoris中天然存在的一样被严格阻遏；参见例如w.c.raschke等，gene177(1996):163-167和l.rodriguez等，yeast12(1996):815-822)。因此，在该技术领域目前的观点是甲基营养型酵母细胞之间不同类型的调控不会由于启动子序列而产生，而是由于酵母细胞中不同的调控机制产生(参见例如，f.s.hartner等，microb.cellfact5(2006):39-59)。然而，令人惊讶地发现，由于解阻遏产生的甲基营养型酵母细胞(例如，h.polymorph)的甲酸脱氢酶(fmd)启动子的强活性不仅能够转移至其他甲基营养型酵母细胞(例如，komagataellaphaffii)，而且这种替代甚至超过了如aox1基因和cat1基因的强同源启动子的技术性质。
直系同源启动子序列的使用还具有其他技术优势。例如，通过使用其降低了同源重组的可能性，导致表达菌株具有更高的遗传稳定性。
“komagataella属酵母细胞”包括该属的所有酵母细胞，如komagataellakurtzmanii、komaga-taellapastoris、komagataellaphaffii、komagataellapopuli、komagataellapseudopastoris、komagataellaulmi和komagataellasp.11-1192。“komagataella属酵母细胞”当然也包括来自上文所述属的特定菌株的那些，例如，komagataellapastorisgs115、x-33、km71、km71h、cbs7435或nrllyll430、cbs704、bg10、bg11和/或这些菌株的其他衍生物。
如在本申请中所使用的，术语“直系同源”指至少与其他物种相应的核酸和氨基酸分子具有功能同源性的来自不同物种的核酸或氨基酸分子。“直系同源物”来自由于繁殖产生并且也是来自共同祖先的不同生物体。“直系同源物”的序列可能彼此之间显著不同，但是其生物学和/或生化功能通常不受影响(例如，来自komagataellapastoris的aox与来自多形汉逊酵母的mox是直系同源物且反之亦然，来自多形汉逊酵母的fmd与来自komagataellapastoris的fdh1是直系同源物且反之亦然)。
如在本申请中所使用的，术语“启动子”包括至少一个转录起始位点、核酸聚合酶复合物的结合位点和附加核苷酸，以使得这两个元件能够具有功能活性并且可以保持在komagataella属酵母细胞中直系同源启动子启动细胞的原始调控性质。例如，这些附加核苷酸可以形成转录因子结合位点。“可由解阻遏诱导的启动子”是在解阻遏条件下活化的启动(见下文)子，以使得与其可操作地连接的核酸分子被转录，从而使其编码异源或同源多肽。
根据本发明的直系同源启动子，即直系同源fmd和/或mox启动子，优选地包含50至2000个之间、甚至更优选地100至1000个之间、甚至更优选地150至800个之间来自包含启动子和用于编码蛋白/多肽的相应基因区域的起始密码子(5'端上游)之前区域的核苷酸，优选地编码fmd和/或mox的fmd和/或mox基因的区域可以含有1至1000个，优选地1至900个，甚至更优选地1至800个核苷酸。直系同源启动子，优选地直系同源fmd和/或mox启动子，包含编码多肽的基因区域5'端上游的优选地1至1000个、优选地1至900个、甚至更优选地1至800个核苷酸，优选编码fmd和/或mox的fmd和/或mox基因的区域。
本发明直系同源启动子(优选直系同源甲酸脱氢酶(fmd)启动子和/或甲醇氧化酶(mox)启动子)的“变体”，包含与天然存在的直系同源启动子(优选直系同源fmd和/或mox启动子)的一个或多个(例如，2、3、4、5、10、15、20、25、50)核苷酸不同的核酸分子。这种启动子变体与天然存在启动子的相应区域至少80％、优选地至少90％、甚至更优选地至少95％、甚至更优选地至少98％相同。
根据本发明可以使用的直系同源启动子的变体可以包含与天然存在的启动子(优选fmd和/或mox启动子)相比的缺失、取代和插入。启动子的变体还具有能够在解阻遏条件下表达蛋白的性质。优选地使用能够在解阻遏条件下表达将由包含天然存在的直系同源启动子(优选直系同源fmd启动子和/或直系同源mox启动子)的komagataella属酵母细胞表达的蛋白量的至少50％、优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％、甚至更优选地至少100％、甚至更优选地至少120％、甚至更优选地至少150％的变体。
鉴定和生产启动子变体的方法是众所周知的。通常将突变引入启动子，随后进行检测，以显示启动子变体的性质(例如，模型蛋白的表达速率)是否发生变化以及变化如何。
本发明直系同源启动子(优选直系同源甲酸脱氢酶(fmd)启动子和/或甲醇氧化酶(mox)启动子)的“变体”还包括包含上文所定义的天然存在的直系同源启动子或其变体的调控元件的启动子变体(例如，与天然存在的序列具有一个或多个(例如，2、3、4、5、10、15、20、25、50个)核苷酸的差异)以及替代的最小启动子和/或核心启动子。最小启动子和/或核心启动子是启动子的一部分，其仅含有转录所必需的通用启动子元件(tata盒和转录起始)。因此，根据本发明的直系同源启动子变体的调控元件包含起始密码子(5'端上游)上游区域优选地100至1000个之间、甚至更优选地150至800个之间的核苷酸，而不包含转录起始点之前20至100个、优选地25至80个、甚至更优选地30至70个核苷酸。
“同一性”和“相同地”分别指两条或多条核酸和/或氨基酸序列之间的对应程度，其可通过序列之间的对应性确定。“同一性”百分比是来自两条或多条序列中相同区域的百分比，其考虑空位或其他序列特征(即，同一性％指相同位置数/位置总数x100)。用于确定同一性特别优选的方法是国家生物技术信息中心(ncbi)的blast程序(除了其他以外，参见alt-schul等，jmolbiol215(1990):403-410)。blosum62算法优选地使用参数“空位”“存在”：11和“扩展”：1。
如在本申请中所使用的，术语“甲基营养型酵母细胞”包括能够在含有仅具有一个碳原子的物质(例如，甲醇)作为碳源的培养基上生长的酵母细胞。
用于培养根据本发明的酵母细胞的“解阻遏”条件指首先在存在阻遏性碳源(例如，葡萄糖)的条件下培养酵母细胞，直至这种碳源大部分或完全被消耗。在阻遏性碳源(例如，葡萄糖)的浓度降低后，使细胞处于分别相对于阻遏性碳源和葡萄糖解阻遏的条件下。阻遏作用的强度可能取决于碳源的类型。
根据本发明优选的实施方式，直系同源fmd和/或直系同源mox启动子与编码异源或同源多肽的核酸分子可操作地连接。
直系同源启动子可以与编码异源(不来源于komagataella)或同源多肽(来源于komagataella)的核酸分子可操作地连接，并因此能够影响这种多肽的表达和/或对其进行控制。所得到的多肽包含至少5个、优选地至少10个、甚至更优选地至少50个氨基酸残基，因此包含也称为多肽或蛋白的分子。
核酸分子优选地编码多肽，如抗体或其片段、酶、结构蛋白等。
如在本申请中所使用的，“可操作地连接”指编码异源或同源多肽的核酸分子以使得允许在根据本发明的酵母细胞中表达核苷酸序列的方式与启动子连接。因此，当其对编码序列的转录有影响时，称为启动子与编码的核酸序列可操作地连接。
根据本发明的另一个优选的实施方式，异源或同源多肽包含信号肽，特别是分泌信号肽。
为了从酵母细胞分泌重组同源或异源多肽，由核酸分子编码的多肽包含信号肽。
如在本申请中所使用的，术语“信号肽”指与多肽的c-末端或n-末端连接的肽，其控制多肽的分泌。在本发明中使用的信号序列可以是编码氨基酸序列的多核苷酸，该氨基酸序列启动蛋白通过内质网(er)的膜转运。这些信号序列的核酸序列可以对应于原始宿主细胞的天然序列或者可以是密码子优化的。信号序列非限制性的实例包括mf-α(“交配因子α”信号序列)、来自里氏木霉(trichodermareesei)cbh2蛋白的信号序列、来自疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)木聚糖酶a的信号序列、k1杀伤毒素信号、用于转化酶分泌的信号肽、来自乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)杀伤毒素的信号序列、来自pichiaacaciae杀伤毒素的信号序列、来自葡萄汁有孢汉逊酵母(hanseniasporauvarum)杀伤毒素的信号序列以及来自pichia(hansenula)anomala或其变体，例如cereghino等(gene519(2013):311-317)中所述。本发明优选的信号序列是mf-α(“交配因子α”信号序列)。
根据本发明特别优选的实施方式，直系同源fmd启动子和/或直系同源mox启动子来自选自下组的甲基营养型酵母细胞：汉逊酵母(ogataea)属、假丝酵母属、komagataella属和毕赤酵母属。
根据本发明另一个优选的实施方式，甲基营养型酵母细胞选自下组：多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)、甲醇毕赤酵母(pichiamethanolica)、komagataellapastoris、komagataellaphaffii、komagataellapopuli、komagataellapseudopastoris、komagataellaulmi和komagataellasp.11-1192。
直系同源fmd和/或mox启动子和与其可操作地连接的编码异源或同源多肽的任选的核酸分子可以作为在具有自主复制序列(ars)的质粒上的染色体外核酸构建体或作为整合至基因组的载体/表达盒存在于基因组上。
直系同源fmd和/或mox启动子和与其可操作地连接的任选的核酸分子可以在染色体外存在或整合至根据本发明的酵母细胞基因组。
根据本发明特别优选的实施方式，直系同源启动子包含或由核酸序列seqidno.1或seqidno.2或其变体组成。
seqidno.1(fmd启动子)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.2(mox启动子)：
cgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaa
根据本发明特别优选的实施方式，seqno.1的变体包含或由seqidno.27组成。seqidno.27具有下述核酸序列：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgax1tcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcx2acgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaax3agcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccax4ccgggtctctcx5x6x7x8x9x10x11x12x13x14x15x16x17x18cacx19，其中
x1是腺嘌呤或无核苷酸，x2是腺嘌呤或鸟嘌呤，x3是胞嘧啶或胸腺嘧啶，x4是胸腺嘧啶或鸟嘌呤，x5是腺嘌呤或胞嘧啶，x6是鸟嘌呤或胞嘧啶，x7是腺嘌呤或胞嘧啶，x8是鸟嘌呤或胞嘧啶，x9是腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶，x10是鸟嘌呤或胞嘧啶，x11是鸟嘌呤或胞嘧啶，x12是鸟嘌呤或胞嘧啶，x13是鸟嘌呤或胞嘧啶，x14是腺嘌呤或胞嘧啶，x15是腺嘌呤或胞嘧啶，x16是胸腺嘧啶或胞嘧啶，x17是鸟嘌呤或胞嘧啶，x18是鸟嘌呤或胞嘧啶，x19是直系同源启动子(优选地fmd和/或mox启动子)的核心启动子，特别优选地是选自下组的核酸序列：
tataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc(seqidno.28)，
tatataaactggtgataattccttcgttctgagttccatctcatactcaaactatattaaaactacaaca(seqidno.29)，
tataaatacaagacgagtgcgtccttttctagactcacccataaacaaataatcaataaat(seqidno.30)，
tataaatactgcctacttgtcctctattccttcatcaatcacatc(seqidno.31)，
cgatagggcagaaatatataaagtaggaggttgtataccaaatataccaacgcagtacaagcaactcttggtttaaacggaagaaacaattcttcgaacatttacaacaaagaaggtaccgtaacattaataatcggaagggt(seqidno.32)，
gtaatctttcggtcaattgtgatctctcttgtagatatttaataggacggccaaggtagaaaaagatacataactagttagcaaacttcaattgcttaagttacaagtgcaatccatatcttaaagttattacattatttata(seqidno.33)和
cctcctctaggtttatctataaaagctgaagtcgttagaatttttcatttaaagcataatcaaacatctagattcgaatcgataaaaagcagatagaagttattaagattataggttacattctagagtagtataggaaggta(seqidno.34)，特别是seqidno.28、seqidno.29、seqidno.30和seqidno.31，特别是seqidno.28。seqidno.27中的至少一个核苷酸在seqidno.1的相应位置是不同的，从而产生seqidno.1的变体。
令人惊讶的是，在seqidno.1中的至少一个(优选地，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)点突变(插入和/或取代)(见seqidno.27)，使得与由seqidno.1组成或包含其的启动子区相比所得到的启动子变体显示出更好的作用。包含与编码多肽的核酸分子可操作地连接的此类启动子的酵母细胞与携带由seqidno.1组成的启动子的酵母细胞相比至少在培养的前24小时内显示出至少相同或者甚至增加的表达速率。因此，特别优选的是将seqidno.1在其相应的核酸序列seqidno.27中指示的一个或多个位置修饰为x1至x18和x1至x19。
seqidno.27的一个或多个(2、3、4、5、6或7)核苷酸x1、x3、x4、x5、x9、x16和x17的突变使得核酸序列不同于seqidno.1是优选的，因为此类启动子与使用seqidno.1相比在解阻遏条件下培养48小时后也显示出增加的多肽和蛋白表达。
特别优选的是seqidno.27的一个或多个(2、3、4或5)核苷酸x1、x4、x9、x16和x17的突变使得核酸序列不同于seqidno.1，因为此类启动子与使用seqidno.1相比在使用例如甲醇作为碳源培养72小时后也显示出增加的多肽和蛋白表达。
如上所述，seqidno.27的x19可以是在seqidno.1中天然存在的核心启动子(即，
tataaatac-cgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc(seqidno.28))或者替代的核心启动子。特别优选的核心启动子包含或由seqidno.29、seqidno.30和seqidno.31组成。在解阻遏条件下，与由seqidno.1编码的启动子相比，与seqidno.1或seqidno.27组合的所有这些核心启动子(在seqidno.27的位置x19，天然存在的核心启动子被这些替代核心启动子中的一个所取代)显示出显著增强的多肽表达速率。
seqidno.1特别优选的变体是选自下组的核酸序列：
seqidno.35(v1；参见实施例2)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgaatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.36(v2)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcgacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.37(v3)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaatagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.38(v4)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagaggggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.39(v5)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccagccgggtctctcagagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.40(v6)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctccgagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.41(v7)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcacagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.42(v8)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagcgaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
seqidno.43(v9)：
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seqidno.44(v10)：
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seqidno.45(v11)：
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seqidno.46(v12)：
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seqidno.47(v13)：
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seqidno.48(v14)：
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seqidno.49(v15)：
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seqidno.50(v16)：
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seqidno.51(v17)：
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seqidno.52(v18)：
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seqidno.53(v19)：
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seqidno.54(v20)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactatataaactggtgataattccttcgttctgagttccatctcatactcaaactatattaaaactacaaca
seqidno.55(v21)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactataaatacaagacgagtgcgtccttttctagactcacccataaacaaataatcaataaat
seqidno.56(v22)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactataaatactgcctacttgtcctctattccttcatcaatcacatc
在解阻遏条件下显示出表达速率降低的由seqidno.1组成或包含其的fmd启动子的变体包含或由下述序列组成：
seqidno.57(v23)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcaccgatagggcagaaatatataaagtaggaggttgtataccaaatataccaacgcagtacaagcaactcttggtttaaacggaagaaacaattcttcgaacatttacaacaaagaaggtaccgtaacattaataatcggaagggt
seqidno.58(v24)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcacgtaatctttcggtcaattgtgatctctcttgtagatatttaataggacggccaaggtagaaaaagatacataactagttagcaaacttcaattgcttaagttacaagtgcaatccatatcttaaagttattacattatttata
seqidno.59(v25)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcaccctcctctaggtttatctataaaagctgaagtcgttagaatttttcatttaaagcataatcaaacatctagattcgaatcgataaaaagcagatagaagttattaagattataggttacattctagagtagtataggaaggta
根据本发明进一步优选的实施方式，seqidno.1的变体选自下组：seqidno.35、seqidno.37、seqidno.39、seqidno.40、seqidno.44、seqidno.51、seqidno.52、seqidno.54、seqidno.55和seqidno.56。
本发明的另一个方面涉及一种生产异源多肽的方法，所述方法包括培养根据本发明的酵母细胞的步骤。
根据本发明的包含直系同源fmd和/或mox启动子的酵母细胞特别适于过表达同源或异源多肽。由于其优异的性质，使得使用根据本发明的酵母细胞在解阻遏条件下以及甲醇诱导或适宜的替代诱导条件下表达多肽和/或蛋白并且任选地将其从细胞分泌成为可能。
根据本发明优选的实施方式，在培养期间，在解阻遏条件下，异源多肽的表达被诱导或其表达速率增加。
可以通过降低阻遏性碳源(c源：例如，葡萄糖，甘油)的加料速率或通过使用非阻遏性c源(例如，山梨醇)实现启动子解阻遏。阻遏性c源可以通过直接阻遏或通过c源代谢产物的阻遏性质来实现其性质。在极端情况下，阻遏c源的加料速率可接近于零。由其他化合物如脂肪酸、甲醛或甲酸引起的附加诱导作用也是可能的。
为了增加培养期间和/或其表达期间的蛋白收率，优选地在培养期间在解阻遏条件下加入甲醇。
本领域技术人员非常熟悉一般培养条件，如温度、培养基等(参见例如，krainerfw等，microbialcellfactories11(2012):22)。
将在下述附图和实施例的基础上更加详细地定义本发明，但不限于此。
图1显示了在培养的komagataella属酵母细胞中绿色荧光报告蛋白(改良的绿色荧光蛋白(gfp)变体)的荧光强度，其中编码绿色荧光蛋白的核酸与直系同源和内源性启动子可操作地连接。将直系同源启动子(和p.pastoris的内源性启动子，作为对照)与gfp报告基因可操作地连接并作为载体在p.pastoris中转化。在具有96深孔的微量培养板(深孔板(dwp))的基本培养基中将菌株培养60小时，然后使用甲醇诱导。在葡萄糖阻遏条件下(16h)、解阻遏条件下(60h)以及在甲醇诱导后的不同时间点，测量od600(作为生物质的指标)和报告蛋白的荧光。使用od600值对荧光测量结果进行归一化。图中显示了四个转化体的每一个的平均值和标准偏差。
图2显示了蛋白表达随时间变化的测量曲线。在摇瓶中培养从图1中选出的菌株。测量蛋白荧光(图2a；rfu/＝d600的比值；rfu＝相对荧光单位)，以及od600(图2b)和葡萄糖的量(图2c)随时间的变化情况。在测量开始时的葡萄糖浓度为55.5mm(10g/l)。显示了三个转化体的每一个的平均值(mv)和标准偏差。
图3a至3c显示了直系同源hpfmd启动子还能够上调其他报告蛋白的表达，如辣根过氧化物酶(hrp)(图3a)、南极假丝酵母(candidaantarctica)脂肪酶b(calb)(图3b)和木薯(manihotesculenta)羟基腈裂解酶(mehnl)(图3c)。在dwp中，在基本培养基中培养菌株至60h后葡萄糖耗竭，然后另外用甲醇诱导。测量培养基上清中的hrp和calb酶活性。使用消化细胞测量mehnl的活性。显示了四个转化体的每一个的平均值和标准偏差。
图4显示了hpfmd启动子(p_fmd)和所检测的野生序列启动子aox1启动子(p_aox1)的报告蛋白荧光。背景菌株是p.pastorisbg11liku70。在深孔板(dwp)中进行培养。在葡萄糖解阻遏(24和48h)以及甲醇诱导的两个不同时间点(72和96h)，测量报告蛋白荧光和od600。使用含有fmd启动子的菌株作为用于检测不同启动子变体的参照菌株。
实施例：
实施例1：
材料和方法
克隆启动子
采用pcr法扩增和克隆直系同源启动子，随后加入gfp报告基因。为此，使用报告质粒pppt4mutzeomlyi-intarg4-egfp-bmristuffer(t.vogl等，acssynthbiol.2015,doi:10.1021/acssynbio.5b00199；2015年11月22日发表)。
这种质粒基于l.
表a：用于扩增直系同源启动子的引物
分离菌株hp(多形汉逊酵母)dsm70277、cb(博伊丁假丝酵母)dsm70026和pm(甲醇毕赤酵母)dsm2147的基因组dna并将其作为pcr反应的模板。通过ta克隆在载体pppt4mutzeomlyi-intarg4-egfp-bmristuffer(亦可参见us2015/0011407和t.vogl等(acssynthbiol.2015,doi:10.1021/acssynbio.5b00199；2015年11月22日发表))中克隆pcr产物。用于p.pastoris内源性启动子aox1、cat1和gap的对照载体来自us2015/0011407。
含有来自相应启动子下游的hrp(同工酶a2a；l.
表b：用于从不同报告基因上游克隆启动子的引物
因此，将在文献中提及的hrp和calb载体作为pcr模板(us2015/0011407和t.vogl等(acssynthbiol.2015,doi:10.1021/acssynbio.5b00199；2015年11月22日发表))。针对p.pastoris启动子对mehnl序列进行优化并设计为具有对aox1启动子和终止子的悬突的合成双链dna片段(见表b)。将该片段作为pcr的模板。使用了下述序列：
cgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaattccgaaacg
这里的蛋白编码序列是大写的并且起始和终止密码子以粗体表示，而用于重组克隆载体的悬突用小写字母表示，ecori和noti是通常在pppt4载体家族克隆中使用的切割位点，用下划线表示。
还将相同的正向引物(phpfmd-mfalpha-gib)用于hrp和calb基因的pcr扩增，因为这两个基因与mfα信号序列融合。通过使用与aox1终止子和各启动子(对于hpfmd启动子为seq-phphmd-149..126fwd)结合的引物对在载体中克隆的基因进行测序。
菌株、材料、荧光测量和酶测定
根据krainerfw(microbcellfact11(2012):22)的方案，使用底物2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸基)二铵盐(abts)和对硝基苯基丁酸盐(p-npb)确定hrp和calb的酶活性。
对于使用gfp对所有启动子转化的比较，使用cbs7435野生型菌株。将hrp和calb质粒转化进入muts株(l.
7:e39720)，因为其具有更高的蛋白表达(f.w.krainer等，microbcellfact11(2012):22)。对于mehnl活性的测量，根据生产厂商的说明书(thermofisherscientific，y-pertm酵母蛋白提取试剂)通过y-per消化裂解细胞，并使用“扁桃腈氰基酶测定”测量其活性，如r.wiedner等，computstructbiotechnolj10(2014):58-62所述(扁桃腈的终浓度为15mm)。
结果
在p.pastoris中对6个异源启动子基因hpfmd、hpmox、cbfld1、cbaod1、pmmod1和pmmod2进行了检测。在p.pastoris中将这些启动子与甲醇诱导的aox1启动子、组成型gap启动子和解阻遏/甲醇诱导的cat1启动子进行了比较，即利用基因组dnapcr扩增直系同源启动子并在以gfp作为报告基因的载体中对其进行克隆。使用了下述启动子序列：
hpfmd(seqidno.1)：
aatgtatctaaacgcaaactccgagctggaaaaatgttaccggcgatgcgcggacaatttagaggcggcgatcaagaaacacctgctgggcgagcagtctggagcacagtcttcgatgggcccgagatcccaccgcgttcctgggtaccgggacgtgaggcagcgcgacatccatcaaatataccaggcgccaaccgagtctctcggaaaacagcttctggatatcttccgctggcggcgcaacgacgaataatagtccctggaggtgacggaatatatatgtgtggagggtaaatctgacagggtgtagcaaaggtaatattttcctaaaacatgcaatcggctgccccgcaacgggaaaaagaatgactttggcactcttcaccagagtggggtgtcccgctcgtgtgtgcaaataggctcccactggtcaccccggattttgcagaaaaacagcaagttccggggtgtctcactggtgtccgccaataagaggagccggcaggcacggagtctacatcaagctgtctccgatacactcgactaccatccgggtctctcagagaggggaatggcactataaataccgcctccttgcgctctctgccttcatcaatcaaatc
hpmox(seqidno.2)：
cgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaa
cbfld1(seqidno.23)：
ggatcccttcaacagcggagtctcaagcagtggctattatcagtgtatttaattactgatgcattgtattatagtgcatacatagttaataattactctctgttatcattgaaaattttgaaattctcactctcacgcagtgcaaaactttgcctaattgagtaagtggaacgcaatatttaggctacatattttggattcccttaagtatgtaatcaaagatcattcatactgccatcttataatattggagtattattatgttgctatactgttctacctgtttattctattgtatgcgtctaaatctttccatcagtttctatactatctttcgtttgcaatgaaatattactccaattcgcttgtttcaactcgcttgccttctctcttgccttctttttttcttttcattttatcgttgtttaaacggtatataaatatgtaacgttgtcgcttagttttgagaaatcacttttgttgctctcaattctgttttgacatcttaaggttagtcaattgattgaatcaactacactaaatcatatttatctattttttattccacaaaa
cbaod1(seqidno.24)：
ggagtatacgtaaatatataattatatataatcatatatatgaatacaatgcaatgaaagtgaatatgataagattgaaataataacaaacagcgataaatatatctcaaaatggagttacacaacaaataataataaaatataaattataaattataaattataaaagaataaaaaataaaccccactaatttattttattaaaagatagattggtatctttacttaataacaattctgaaactttattcacttaattttatttaacttatttaatttatttttaccccagtttttcagtacaatgcagctccgaaactttatttggctgtgatttggctgtgatttggctgtgatttggcttggcttggctggctggaattgtctcctgcaggaattgctcggggtccggttctcccgctggctggctatttggcgggctggctatttggcgggctggctggctggctgctctgccatctgctgtggccaccccgcatctctggatgcacgccgtgcagctggacgtgcgtctaccctgcagccgtgtgccttatttcccaatctcccaatctctcaatctgccagtcagccaaaacaccggccaggcaggcaggcaggcaggcaggcaggcagtgaagccttcccacgccccactccgcataaacatccccagcagtttccccagcagtttccccagcttttcaatttaataaaatagcctgtttctgtttctgttttatattatacaattttttatcctaataattactctttcgggaattaaataataattatatcatatacccatatcacattttactatatttactatctataaataaattcatattataatattaatttatattcgcttaattaaaatgctcttttccatcatcatcatcatcatcatcatcacgagttttcggttatcaatactcttttcattaatttctagaatttcattatttattttttattgactggaaattttcaatcaattttatttatttttatttatttattttcatattcttagatttaaactttttagatgaccgctattttacttacttacttactgttgttttatattatgataagaattaattttcatatttatgatgatgatgatgtaaatttaacctagtatactattttaaagttatcactatcttttagtgctggcattttttattctattttcatatatgtatatacgtaaattaagtatcatcacgctgcttactgtacgtttaaaatgtggagatggaaatagagatggggatgaagatgaagatgatgagaattataaaccattcattcattaatcaatcaatataacttataaaaaaatttatatttaaatgaattaatttcctttattttaataatatcgttaattcttttaaattctattttattttaattctttctttatcatagttatcatataacaattatataacatagatacacaattattatttcattatcatattattttttaaaatattgattatttttaaaataatatcttaattaattaatttttacgaatatacaaattttaacgacttactttttttaacgaattttaacgaacttttaaaaaaacaaaaaaaaaaaaacaaaattatttttcaata
pmmod1(seqidno.25)：
cgagatggtacatacttaaaagctgccatattgaggaacttcaaagttttatctgtttttagaattaaaagacgattgttgtaacaaaacgttgtgcctacataaactcaaattaatggaaatagcctgttttgaaaaatacaccttcttaagtactgacaaagttttgttaaatgactatcgaacaagccatgaaatagcacatttctgccagtcacttttaacactttcctgcttgctggttgactctcctcatacaaacacccaaaagggaaactttcagtgtggggacacttgacatctcacatgcaccccagattaatttccccagacgatgcggagacaagacaaaacaaccctttgtcctgctcttttctttctcacaccgcgtgggtgtgtgcgcaggcaggcaggcaggcagcgggctgcctgccatctctaatcgctgctcctcccccctggcttcaaataacagcctgctgctatctgtgaccagattgggacacccccctcccctccgaatgatccatcaccttttgtcgtactccgacaatgatccttccctgtcatcttctggcaatcagctccttcaataattaaatcaaataagcataaatagtaaaatcgcatacaaacgtcatgaaaagttttatctctatggccaacggatagtctatctgcttaattccatccactttgggaaccgttctctctttaccccagattctcaaagctaatatctgccccttgtctattgtcctttctccgtgtacaagcggagcttttgcctcccatcctcttgctttgtttcggttatttttttttcttttgaaactcttggtcaaatcaaatcaaacaaaaccaaaccttctattccatcagatcaaccttgttcaacattctataaatcgatataaatataaccttatccctcccttgttttttaccaattaatcaatcttcaaatttcaaatattttctacttgctttattactcagtattaacatttgtttaaaccaactataacttttaactggctttagaagttttatttaacatcagtttcaatttacatctttatttattaacgaaatctttacgaattaactcaatcaaaacttttacgaaaaaaaaatcttactattaatttctcaaa
pmmod2(seqidno.26)：
ggatccactacagtttaccaattgattacgccaatgtgtttatttcaccaagtaattacaaaactgagatttggttatgtcattatgtattttcggcaatggctgtaatttaaactggattagggttaattaacgtttagcctacgaaagcggctagcttttatttctgcttttgttttgagcccgtttctaattccaatctttgcaatttcgttccatcttttaaaattaagtgctcttttctaatctgataaagataagccatcgtagagtaagtaaaacaaaataatgtactgtatattaagcggaaaaacttggaaaagtcgtatgatgttgaaggagcaaagaatgactaatattaggagatttaagcaaacaatgttgaggggaacaggacgattaaccccttatagaggaagcgtctttgatgttcgaagggggaggggtcaaaagcactgagcagtgctaattagtaaccaatttctgtaagcaatgaaacttgttgctattggaaatactattaagtaatacaaggtacagactaatgggggtgagccggtagttcaggctatcttatagacagactattccggattgtctaatcattggtgcacctggttaataattatcagtcaactcttttacggtgctgataggtctttgcgaacttgcccttgtggaatttggttgttaatcaaactgttctgtatttcatgtcatactactattgatattattaatgttacttactcatctggccatttaacaggtttgaagctttaatgctcttaactaacagcaatccatcaccgtcaaccttaacccccctggtgcttgctgtctttatccttcgtatctttttcatgttgcaccgccctgttccttatacggttgttcccccataggctaacttctctgtttccgaccatctctgcaataacaaagaattctatacgcttacactataatcatacaatgactctacatgccattttcactttacttacttgccatcggaagatactgaatcagaaagccatagtaactacataacttcaaaacacaccctttttacagattagttacaattttgtcaatgtttgtttgataacccaaggtggaacgtttccagttagacctgtttaatccaactcactttaccaccccaaaactttcctaccgttagacaaatactggctaaatctgacgaaaacaaccaatcaacaattgaatccactgggaggtatctctaatccactgacaaactttgctaaaacaagaaaaagtgggggcctccgttgcggagaagacgtgcgcaggcttaaaaacacaagagaacacttggaagtaccccagatttttagcttcctactattctgacaccccctattcaagcacgacggtgattgattcattcaattttgctgctccaatgataggataaacccttttggacttcaatcagacctctgtcctccatagcaatataaataccttctagttgccccacttcctctctcctgtactgccccaatgagtgacttattcaagttactttctctcttttcctaacaattaaacaagaagctttattataacattaatatactattttataacaggattgaaattatatttatctatctaaaactaaaattcaaa
含有具有cbaod1、pmmod1和pmmod2启动子的质粒的p.pastoris转化体不具有任何报告蛋白荧光(图1)。cbfld1启动子显示出被葡萄糖阻遏和被甲醇微弱诱导，约为ppaox1启动子的10％。所检测的两种h.polymorpha启动子均令人惊讶地保留了其来自h.polymorpha的天然调控性质，并且其在毕赤酵母中也能够阻遏、解阻遏和甲醇诱导(图1和2)。在解阻遏条件下，hpfmd启动子令人惊讶地超过了组成型ppgap启动子，并且即使不加入额外的碳源，其也达到了甲醇诱导ppaox1启动子的约75％。hpfmd启动子的解阻遏表达是p.pastoris最强内源性mut启动子(ppcat1)报告蛋白荧光的约3.5倍。甲醇诱导后，hpfmd启动子是ppaox1启动子的约2倍。这些小规模的结果(图1)已被在摇瓶中的实验所证实(图2)，其中葡萄糖的测量结果也显示出清楚的解阻遏调控性质。可以通过优化在生物反应器中的加料速率，进一步增强hpfmd启动子的技术优势。
为考察hpfmd报告子意外的强表达是否也能够在gfp以外的其他蛋白中重现，将hpfmd启动子克隆到其他蛋白编码序列的上游：分泌蛋白辣根过氧化物酶(hrp)和假丝酵母脂肪酶b(calb)以及木薯胞内羟基腈裂解酶(木薯，mehnl)(图3a至3c)。
对于摇瓶实验的培养物上清中活性蛋白的最终收率，由hpfmd启动子对所有蛋白的解阻遏表达等于gap启动子的组成型表达，并且明显超过了cat1启动子的解阻遏表达。hpfmd启动子的甲醇诱导酶活性是aox1启动子的2.5倍。
使用4种不同的分泌报告蛋白以及胞内报告蛋白(egfp、hrp、calb、mehnl)也能够观察到hpfmd启动子的强表达。直系同源hpfmd启动子甚至超过了p.pastoris中的内源性启动子。
有趣的是，在直系同源启动子与毕赤酵母中的启动子具有极低的或者无序列同一性。对hpfmd启动子进行blast检索在毕赤酵母基因组中未产生任何明显的命中；对hpfmd启动子与ppfdh1启动子的直接比对也未产生任何明显的相似性(blastn2.2.32+，blast2序列，设置为“某些相似序列(blastn)”；分子类型：核酸)。
这种低序列同一性是启动子的理想性质，因为这些外来序列无法与毕赤酵母基因组中的相同序列重组，因而其不会丢失，例如因与在基因组中已经存在的相似序列发生同源重组事件而丢失。
正如因hpfmd启动子具有高达2.5倍的活性所证明的那样，直系同源启动子可以令人惊讶地称为蛋白表达非常有用的工具。出乎意料的是，hpfmd启动子在p.pastoris中还保留了其来自h.polymorpha的解阻遏调控性质，从而构成了p.pastoris中的最强解阻遏启动子。因此，可以使不含有毒的和高致炎性甲醇有效生产方法成为可能。
实施例2：fmd启动子变体
1.启动子的克隆
将含有具有seqidno.1的fmd启动子的pppt4mutzeomlyi-intarg4-egfp-p_fmd作为用于对启动子变体v01至v22进行pcr扩增的模板。以向fmd启动子序列引入点突变、插入或不同核心启动子的方式设计引物。将启动子变体以两部分扩增，然后与pppt4mutzeomlyi-intarg4-egfp-p_fmd载体的骨架组装，该载体此前已使用限制性核酸内切酶sali切割。为产生启动子变体v23至v25，仅将一部分进行pcr扩增，并将另一部分作为合成dna提供。在这种情况下，将两个dna片段与pppt4mutzeomlyi-intarg4-egfp-p_fmd载体的骨架组装，该载体此前已使用限制性核酸内切酶nhei切割。为了将dna片段与载体骨架组装在一起，使用基于序列同源性的克隆，从而得到了从启动子到报告基因egfp的无间隔转变。
2.p.pastoris的转化和筛选
为了将携带不同启动子变体v01至v25的载体转化进入酵母中，使用了p.pastorisbg11ku70菌株。与野生型菌株相比，该菌株具有两处基因敲除：第一个是ku70基因，其编码参与非同源末端连接机制的蛋白。通过敲除该基因，在p.pastoris中更可能发生同源重组事件。这有利于将载体靶向预定基因座，在该情况下是arg4基因座，以避免基因组中不同整合基因座预料不到的影响。第二个敲除的基因是aox1基因(muts/bg11菌株)。通过使用该敲除菌株，可以实现在甲醇诱导型启动子控制下更高收率的异源蛋白表达(krainerfw等，microb.cellfact.11(2012)p.22)。
根据lin-cereghino等(biotechniques38(2005):44–48)压缩的方案，使用bglii线性化质粒转化p.pastorisbg11ku70。为了获得用于筛选的参照菌株，还对与用于启动子变体相同的载体进行了转化，但是该载体具有seqidnr1所示的未经修饰的fmd启动子和aox1启动子。对约500ng(其为相对较低量的dna)进行转化，以避免多拷贝整合。例如，使用1μg线性化pppt4_s载体通常仅产生单拷贝转化体(voglt等，acssynth.biol.3(2014):188–191)。
对9个构建体筛选出了42个转化体以显示表达情况的均匀性。由于已证明了所有所检测构建体的情况是均匀的，因此在第二轮筛选中每个构建体仅选出16个转化体并在两块不同的深孔板(dwp)上培养。dwp培养改编自weis等报道的方案(weisr等，femsyeastres.5(2004):179–89)。挑取单菌落并将其接种至在96孔dwp中的bmd(250μl)中，培养48h。然后加入bmm2(250μl)首次诱导细胞。在dwp中培养60、72和84小时后，使用bmm10(50μl)将细胞再诱导3次。收集样品并在48、72和96小时后检测。按照如下所示收集样品：将10μl细胞培养物与190μl去离子水在微孔板中混合(nuncmicrowell96-welloptical-bottomplateswithpolymerbase,black；thermofisherscientific)。使用
表c：用于产生fmd启动子变体的引物和合成dna
3.结果
hpfmd启动子(p_fmd)和所检测的野生序列启动子aox1启动子(p_aox1)的报告蛋白荧光结果如图4中所示。
a)fmd启动子变体——点突变和单核苷酸插入
表d：含有点突变和单核苷酸插入的所有启动子变体的相对启动子活性。测量egfp报告蛋白的相对荧光值(rfu)并将这些值归一化至od600。将这些rfu/od600值归一化至母体hpfmd启动子变体序列(wt＝seqidno.1)的rfu/od600值得到相对启动子活性。在dwp中，在bmd1培养基中培养菌株(24和48h)，并且随后使用甲醇诱导(72和96h)。
b)fmd启动子变体——核心启动子交换
表e：含有交换的核心启动子的所有启动子变体的相对启动子活性。测量egfp报告蛋白的相对荧光值(rfu)并将这些值归一化至od600。将这些rfu/od600值归一化至母体hpfmd启动子变体序列(wt＝seqidno.1)的rfu/od600值得到相对启动子活性。在dwp中，在bmd1培养基中培养菌株(24和48h)，并且随后使用甲醇诱导(72和96h)。