用于富集生物分子并且用于从生物样品中去除这些生物分子的方法与流程

已知在无细胞体液中存在所谓的游离循环核酸、外泌体以及在病毒感染的情况下还存在病毒颗粒。所有这些不同的生物分子对于疾病诊断均有重大意义。尤其无细胞核酸以及外泌体在此所起的作用越来越重要。对于所有这些生物分子而言的共性是，它们仅以很小的浓度存在于体液中。这就给它们的诊断用途造成困难。唯一的出路在于处理更大的样品体积，以便最终有足够量的生物分子可供使用。例如血浆、血清或者还有尿液的体液均可考虑作为重要的初始样品。目前只有少数方法允许从大体积的样品中富集或分离生物分子或者随后将所富集的生物分子用于提取核酸。例如使用超离心技术来从生物样品中富集外泌体。此时外泌体聚集在反应容器的底部。这种方法必须与超离心机相关，并且除此之外还费时且不适用于例行诊断。此外还使用超滤技术。该方法也费时并且非常昂贵。替代的方法在于借助免疫板或者借助免疫珠实现外泌体的免疫沉淀。这种富集外泌体的方式也费时，并且因为所使用的反应试剂而易受干扰且昂贵。除此之外，在该技术中只能使用200至500μl的样品。病毒的富集同样可以使用超离心技术。替代的方法在于借助聚乙二醇/氯化钠使病毒颗粒沉淀以及随后的离心(yamamotoetal，virology40(1970)734；morandietal，j.clin.microbiol.36(1998)1543-1538)。在此使用peg和氯化钠的不同混合物，并且将这些反应试剂与生物样品混合。随后将混合物低温培养较长时间，接着通过离心获得病毒(蛋白质)-nacl/peg-沉淀物。这些方法也很麻烦并且需要很多时间。除此之外，继续处理沉淀物以便分离病毒核酸也是有问题的。常常很难使沉淀物重新进入溶液。这显著影响核酸分离的效率和质量。专利文件de19856415c2描述了一种方法，该方法使用已知的nacl/peg沉淀过程来工作，其中随后以本身已知的方式通过键合到硅酸盐型固相来实现核酸的分离。尚不清楚该方法与具有已知问题的充分已知的nacl/peg沉淀方法有多少差别。除此之外，该方法还需要低温培养以及二十分钟的离心。该方法应当可以从最多10ml的样品中分离病毒核酸。应允许处理最多1ml样品的另一种可商购的变体基于在使用特殊洗涤剂的情况下富集病毒核酸。在此利用裂解反应试剂对样品进行的初始培养导致病毒裂解。随后形成“洗涤剂-核酸络合物”。将混合物离心并且随后对所获得的丸状物进行蛋白分解处理，并且进而以本身已知的方式通过结合到硅酸盐型固相来分离核酸(qiaampultrasensvirushandbook)。此处也强调了与重新悬浮丸状物相关的问题。除此之外，该方法也只能处理具有最多1ml体积的样品。为了从大体积的样品中分离循环的无细胞dna，只能将进行提取所需的所有缓冲液成分按比例增大。本领域技术人员已知，这伴随着巨大的反应试剂以及时间耗费。本领域技术人员也很清楚，如果想要将样品中的生物分子增浓或纯化，那么对于不同的生物分子(例如病毒、dna或者亚细胞颗粒)也总是需要不同的方法。专利文件de102008023297b4中公开了一种用于从生物样品中浓缩生物分子并且用于随后提取核酸的全新手段。该方法的基础是使用多糖衍生物来络合样品中所含的生物分子。该多糖衍生物为多糖醛酸的盐。海藻酸的所谓藻酸盐在此特别适用。藻酸盐为褐藻中的形成结构的单元。藻酸盐是一种由1,4连接的α-l-古罗糖醛酸(g)和β-d-甘露糖醛酸(m)组成的多糖。这形成均聚物区域，在其中甘露糖醛酸或者古罗糖醛酸作为嵌段存在。藻酸盐用于食品以及制药和化妆品工业，例如作为食品工业领域中的凝胶剂、作为纺织品的整理剂、用于生产照相纸或者在牙科诊所用于制作牙齿和颌骨印模。该专利文件描述了利用藻酸盐在具有低钙含量的溶液中凝胶化并且形成所谓的水凝胶的能力。凝胶化的原因在于钙离子嵌入到gg嵌段的之字形结构中。然后另一个藻酸盐分子的之字形结构支承于该区域上。从而形成三维结构。与强酸组合也形成凝胶。除此之外，所产生的凝胶结构也能够再次被特异性地破坏。在充分利用藻酸盐凝胶的形成的情况下能够简单且迅速地富集生物分子并且随后进行核酸的分离。该方法的流程如下所述：1.将藻酸盐水溶液与液态生物样品混合2.加入能诱发凝胶形成/丸状物形成的水溶液(例如使用1m氯化钙溶液或者1％的盐酸溶液)3.将样品混合并且在室温下短暂培养4.将样品离心并且去除上清液5.溶解丸状物或者凝胶块并且由此释放生物分子，并且在必要时随后以本身已知的方式和方法直接分离dna或者rna该专利说明书中公开的方法极为高效并且也能快速且简单地将大体积的样品用于富集生物分子。然而所描述的方法有一个大缺点。难以实施过程自动化。原因就在于必须始终借助离心来完成富集步骤。对于已知的方式而言，不容易将离心步骤转化到自动化过程中并且除此之外还显著提高了自动装置的成本耗费。发明目的本发明的基本目的在于克服已知技术方案的缺点。技术实现要素：已经根据本专利权利要求所述的特征实现了这个目的。本发明所述的方法允许(从大体积的样品中)富集生物分子并且随后释放生物分子或者在必要时从中分离核酸(dna和rna)或释放核酸。该方法能够简单且迅速地将所有必要的过程步骤在自动化过程中实现。出人意料的是，该方法能够以十分简单的途径在没有离心步骤的情况下实施。该方法基于这样的已知方法，即将液态生物样品与藻酸盐溶液以及二价或多价阳离子盐(例如钙盐、锌盐或者铝盐)或者酸混合。但是随后并不通过离心步骤来富集生物分子。向样品中加入颗粒，优选加入磁性或者顺磁性颗粒。该颗粒为哪种颗粒在此并不重要。不仅颗粒的大小还有其功能化均具有较低的重要性。因此可以使用纳米颗粒、微米颗粒或者更大的颗粒。磁性颗粒最适合于以简单方式分离颗粒。在这种情况下借助磁体分离颗粒并且去除样品上清液。在去除样品上清液之后，待富集的生物分子(亚细胞颗粒、病毒或者核酸)完全位于由藻酸盐凝胶和磁性或顺磁性颗粒构成的络合物中。由此，在不使用专利说明书de102008023297b4中详述的离心的情况下出人意料地完成了富集。现在可以如下释放经络合的生物分子：加入重新破坏藻酸盐凝胶结构并且从而释放经络合的生物分子的反应试剂。这可以例如借助含有螯合剂(edta)的缓冲溶液但也可以借助加入二水合柠檬酸三钠溶液来实现。在加入这些反应试剂之后，使这些颗粒短暂地重新悬浮并且进行培养。该培养用于溶解藻酸盐凝胶结构以及释放生物分子。随后通过施加磁场来分离磁性或顺磁性颗粒。所产生的上清液含有随后能够被处理或者被分析的生物分子。因此该方法不需要离心步骤，并且可以极其容易地完全自动化执行。这样就能首次实现高效快速地处理大体积样品。本发明所述的方法还显示出另一个优点。在一种特殊的实施方式中，可以如下选择用于进行分离的颗粒，使得这些颗粒能够结合核酸。这意味着这些颗粒一方面用于分离生物分子-藻酸盐络合物并且随后还用来提取高纯度的核酸。如果要从无细胞样品中富集所谓的循环无细胞核酸并且随后将其分离，那么该方法尤其有意义。为此向样品(血清、血浆、尿液等等)加入藻酸盐溶液和含有二价或多价阳离子盐(例如氯化钙或者氯化铝)的水溶液或者弱酸以及顺磁性或者磁性颗粒。这样选择这些颗粒，所得这些颗粒在特定条件下能够结合核酸。这类颗粒是本领域技术人员已知的并且在例行程序中被用于分离核酸。在加入这些成分之后，短暂搅拌混合物，并且在室温下培养几分钟。随后借助磁体分离颗粒并且去除样品上清液。在去除上清液之后，向颗粒(藻酸盐-凝胶-颗粒络合物)加入能够破坏藻酸盐-凝胶络合物的缓冲液。为此使颗粒重新悬浮并且将混合物培养几分钟。在此还可以向缓冲液加入如蛋白分解酶等的其他添加剂。培养可以在室温下进行或者也可以在更高的温度下、优选在50℃至70℃下进行。在释放经络合的无细胞核酸之后，这些核酸与磁性或者顺磁性颗粒结合。这种结合能够通过所加入的缓冲液实现。优选地，通过加入键合缓冲液来提高dna结合的效率。作为缓冲液可以使用本领域技术人员由专利文件de102008023297b4中已知的反应试剂组合。重要的是，第一种缓冲液可以单独或者与附加的键合缓冲液组合地破坏藻酸盐-凝胶结构并且随后结合所释放的dna。除了裂解缓冲液之外，同样可以加入键合缓冲液，该键合缓冲液允许针对待提纯的核酸实现选择性(dna和rna的大小分级或者分离)。其他的提取过程是本领域技术人员所熟知的。洗涤键合到颗粒上的核酸，并且最后通过加入水或者通过加入低盐缓冲液使得核酸从颗粒上脱离。借助本发明所述的方法，也能够由此自动化地进行从富集生物分子开始直至最终提取高纯度核酸的整个过程。不再需要离心步骤。与专利文件de102008023297b4公开的方法相比，这是一个决定性的优点。除此之外，借助本发明所述的方法事实上能够处理任何样品体积，并且因此不限于小体积，并且除此之外还容易自动化。液态初始样品的体积能够任意选择，这允许非常广泛的应用范围。例如能够使用500μl或者也能够使用10ml的样品进行工作。因此存在极大的应用宽度。本发明所述的方法也适合于一般性地从样品中分离核酸。如果待分离的核酸并非作为游离核酸存在，则能够用本身已知的方式裂解样品。由此随后再度对应于本发明所述的方法来分离从样品中释放的核酸。在此也可以在溶解(含有经富集的核酸的)藻酸盐-凝胶结构之后进行“经典的”核酸纯化，或者在借助碱性低盐缓冲液溶解藻酸盐-凝胶结构之后，将所获得的溶液直接用于pcr反应。以下将借助于实施例详细解释本发明，其中这些实施例并不意味着对本发明所述方法的限制。实施例1：从1ml的血浆样品中富集无细胞dna。验证藻酸盐溶液、用于形成藻酸盐凝胶的反应试剂以及可借助磁场分离的颗粒的必要组合用于富集的初始样品是人血浆。血浆样品在应用之前已经再次离心10分钟，以去除在某些情况下仍然存在的细胞。利用上清液继续处理。测试了三种不同的方法。样品1：向样品加入了30μl的0.5％的藻酸盐溶液并且将混合物短暂混合。然后加入了150μl的1摩尔的氯化钙溶液以及50μl的磁性颗粒悬浮液(magsuspension；analytikjenaag)。样品2：向样品加入了30μl的0.5％的藻酸盐溶液并且将混合物短暂混合。然后加入了50μl的磁性颗粒悬浮液(magsuspension；analytikjenaag)。样品3：向样品加入了150μl的1摩尔的氯化钙溶液并且将混合物短暂混合。然后加入了50μl的磁性颗粒悬浮液(magsuspension；analytikjenaag)。然后如下地继续处理样品。将混合物短暂混合并且培养10分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除了上清液并且使用1ml的水清洗了磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除了上清液。向磁性颗粒-藻酸盐凝胶-dan络合物中加入了400μl的缓冲液(4m硫氰酸胍，edta)以及20μl的蛋白酶k(20mg/ml)并且使用移液管使混合物重新悬浮。接着在70℃下培养了15分钟。该步骤用于破坏颗粒-藻酸盐凝胶-dna络合物并且从而释放经络合的dna。接着加入了400μl的键合缓冲液(异丙醇/tritonx-100)并且再次将颗粒混合以及培养2分钟。该步骤用来将dna键合到颗粒上。然后分离了磁性颗粒并且舍弃了上清液。随后使用本领域技术人员已知的醇类清洗缓冲液清洗了颗粒，并且最后将颗粒干燥。在最后的步骤中，通过加入50μl的h2o使得所键合的dna从颗粒上脱离并且转移到新的反应容器中。借助实时pcr验证了无细胞dna的富集以及随后的提取。为此扩增了雌激素受体1的人类特异性靶序列。用于扩增人类特异性靶序列(雌激素受体1)的实时pcr方案。正义链引物(5’-cgccgccaacgcgcaggtcta-3’)反义链引物(5’-agccgaacgccgcagcctca-3’)1探针(5’-famcctcccctacggccccggg-bhq1-3’)反应混合物每个样品：扩增/杂交条件步骤1：变性95℃120“步骤2扩增45次循环95℃4“(测量)65℃45“pcr结果附图1中的结果表明，只有藻酸盐溶液、形成藻酸盐凝胶的反应试剂以及可借助磁场分离的颗粒的组合能够实现dna的富集和随后的提取(黑色曲线)。因此证明第一个步骤已使得游离dna与形成的藻酸盐凝胶络合并且使得所加入的颗粒与该络合物连接。然后通过施加磁场可以分离颗粒-藻酸盐凝胶-dna络合物。因此不需要在专利文件de102008023297b4中所说明的离心。实施例2：从1ml以及5ml的血浆样品中富集无细胞dna以及随后提取dna用于富集的初始样品是人血浆。血浆样品在应用之前已经再次离心10分钟，以去除在某些情况下仍然存在的细胞。利用上清液继续处理。如下地处理了1ml样品。向样品加入了30μl的0.5％的藻酸盐溶液并且将混合物短暂混合。然后加入了150μl的1摩尔的氯化钙溶液以及50μl的磁性颗粒悬浮液(magsuspension；analytikjenaag)。将混合物短暂混合并且培养10分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除了上清液并且使用1ml的水清洗了磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除了上清液。向磁性颗粒-藻酸盐凝胶-dan络合物中加入了400μl的缓冲液(4m硫氰酸胍，edta)以及20μl的蛋白酶k(20mg/ml)并且使用移液管使混合物重新悬浮。接着在70℃下培养了15分钟。该步骤用于破坏颗粒-藻酸盐凝胶-dna络合物并且从而释放经络合的dna。接着加入了400μl的键合缓冲液(异丙醇/tritonx-100)并且再次将颗粒混合以及培养2分钟。该步骤用来将dna键合到颗粒上。然后分离了磁性颗粒并且舍弃了上清液。随后使用本领域技术人员已知的醇类清洗缓冲液清洗了颗粒，并且最后将颗粒干燥。在最后的步骤中，通过加入50μl的h2o使得所键合的dna从颗粒上脱离并且转移到新的反应容器中。如下地处理了5ml样品。将样品转移到了15ml的反应容器中。向样品加入了150μl的0.5％的藻酸盐溶液并且将混合物短暂混合。然后加入了600μl的1摩尔的氯化钙溶液以及100μl的磁性颗粒悬浮液(magsuspension；analytikjenaag)。将混合物短暂混合并且培养10分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除了上清液并且使用5ml的水清洗了磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除了上清液。向磁性颗粒-藻酸盐凝胶-dan络合物中加入了400μl的缓冲液(4m硫氰酸胍，edta)以及20μl的蛋白酶k(20mg/ml)、重新悬浮并且使用移液管将混合物转移到1.5ml的反应容器中。接着在70℃下培养了15分钟。该步骤用于破坏颗粒-藻酸盐凝胶-dna络合物并且从而释放经络合的dna。接着加入了400μl的键合缓冲液(异丙醇/tritonx-100)并且再次将颗粒混合以及培养2分钟。该步骤用来将dna键合到颗粒上。然后分离了磁性颗粒并且舍弃了上清液。随后使用本领域技术人员已知的醇类清洗缓冲液清洗了颗粒，并且最后将颗粒干燥。在最后的步骤中，通过加入50μl的h2o使得所键合的dna从颗粒上脱离并且转移到新的反应容器中。借助实时pcr验证了无细胞dna的富集以及随后的提取。为此扩增了人类特异性靶序列(雌激素受体1)。实时pcr结果扩增人类特异性靶序列(雌激素受体1)的实时pcr方案。方案参见示例1。样品ct值1ml样品(红色曲线)35/34.955ml样品(黑色曲线)32.25/32.30如附图2中的结果所示，从5ml样品中富集并且随后分离的dna多于1ml样品。因此本发明所述的方法也适合于从大体积样品中富集和提取无细胞dna。实施例3：从水溶液(1ml)中富集基因组dna并且在没有进一步提取dna的情况下直接释放基因组dna。本发明所述的方法与专利文件de102008023297b4中的方法的对比用于富集的初始样品是含有基因组dna的水溶液。借助专利文件de102008023297b4中的方法以及借助本发明所述的没有离心步骤的方法进行了富集。针对该专利文件中的方法，使用了商业产品pme游离循环dna提取试剂盒(pmefree-circulatingdnaextractionkit，analytikjenaag)。如下地执行本发明所述的方法。向样品加入了30μl的0.5％的藻酸盐溶液并且将混合物短暂混合。然后加入了150μl的1摩尔的氯化钙溶液以及50μl的磁性颗粒悬浮液(magsuspension；analytikjenaag)。将混合物短暂混合并且培养5分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除了上清液并且使用1ml的水清洗了磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除了上清液。然后破坏了磁性颗粒-藻酸盐凝胶-dna的络合物，以便释放dna。为此向颗粒中加入了50μl的50mm柠檬酸钠溶液，并且使用移液管使混合物重新悬浮。在短暂培养之后，分离了磁性颗粒，并且将上清液转移到新的容器中，并且随后再与50μl的水混合。在琼脂糖凝胶上检查是否在没有离心的情况下也已经富集了基因组dna。如凝胶电泳图所示，使用这两种方法能够从1ml样品中浓缩基因组dna。本发明所述方法的吸引人之处在于其简单性，因为已经不再需要离心步骤。附图3示出借助这两种方法浓缩的dna的凝胶电泳图，其中编号1表示1-dna梯形条带，编号2至5表示利用来自专利文件de102008023297中的方法浓缩的基因组dna，并且编号6至9表示利用本发明所述方法浓缩的基因组dna。实施例4：富集病毒以及随后提取病毒核酸用于富集的初始样品是人血浆。向血浆样品加入了灭活的黄热病毒。为了富集病毒使用了1ml样品。如下地处理了1ml样品。向样品加入了30μl的0.5％的藻酸盐溶液并且将混合物短暂混合。然后加入了150μl的1摩尔的氯化钙溶液以及50μl的磁性颗粒悬浮液(magsuspension；analytikjenaag)。将混合物短暂混合并且培养10分钟。然后借助磁体分离了磁性颗粒。去除了上清液并且使用1ml的水清洗了磁性颗粒。再次分离磁性颗粒之后完全去除了上清液。向磁性颗粒-藻酸盐凝胶-dan络合物中加入了400μl的缓冲液(4m硫氰酸胍，edta)以及20μl的蛋白酶k(20mg/ml)并且使用移液管使混合物重新悬浮。接着在60℃下培养了15分钟。该步骤用来破坏颗粒-藻酸盐凝胶-病毒络合物，并且从而释放经络合的病毒并且用于破坏以释放病毒核酸(病毒rna)。接着加入了400μl的键合缓冲液(硫氰酸胍/异丙醇/tritonx-100)并且再次将颗粒混合以及培养2分钟。该步骤用来将病毒rna键合到颗粒上。然后分离了磁性颗粒并且舍弃了上清液。随后使用本领域技术人员已知的醇类清洗缓冲液清洗了颗粒，并且最后将颗粒干燥。在最后的步骤中，通过加入50μl的h2o使得所键合的dna从颗粒上脱离并且转移到新的反应容器中。借助黄热病毒特异性的实时pcr进行对病毒颗粒富集以及随后的病毒rna提取的验证。实时pcr结果扩增黄热病毒的5’非编码区的实时pcr方案yfallf：(5’-gctaattgaggtgyattggtctgc-3’)yfallr(5’-ctgctaatcgctcaamgaacg-3’)yfallp(5’-fam-atcgagttgctaggcaataaacac-bhq1-3’)反应混合物每个样品：扩增/杂交条件步骤1：变性95℃120sec步骤2扩增45次循环95℃4sec(测量)65℃45secpcr结果样品ct值1ml样品(蓝色)28.8/28.9在图4中示出了还可以富集病毒并且随后提取病毒核酸。当前第1页12