新型甜菊醇糖苷及其制造方法，以及含有该物质的甜味剂组合物与流程
本发明涉及一种新型甜菊醇糖苷及其制造方法，以及含有该物质的甜味剂组合物。本发明进一步涉及含有新型甜菊醇糖苷的饮食品、植物及其萃取物、以及调味剂。
背景技术：
在菊科甜菊(steviarebaudiana)的叶中包含作为二萜的一种的被称作甜菊醇(steviol)的次级代谢产物,由于甜菊醇糖苷呈现砂糖的约300倍的甜味而作为低热量的甜味剂在食品产业中被利用。肥胖作为深刻的社会问题在国际上日益严峻，从增进健康及削减医疗费的观点出发低热量甜味剂的需求也日益增大。目前，人工合成的氨基酸衍生物阿斯巴甜(aspartame)、乙酰磺胺酸钾(acesulfamepotassium)作为人工甜味剂被利用，但像甜菊醇糖苷这样天然存在的低热量甜味剂更为安全，从而期待其容易得到消费者理解(publicacceptance)。
甜菊的主要甜菊醇糖苷，以糖最终修饰为附加了4个糖的被称为瑞鲍迪苷a(rebaudiosidea；reb.a)的糖苷(图1)。作为其前体的甜菊醇3糖糖苷的甜菊苷(stevioside)在量上最多，这两种物质是甜菊的甜味的核心物质。已知甜菊苷在甜菊叶中的含量最多，且呈现砂糖的250～300倍程度的甜味。reb.a是甜味高(砂糖的350～450倍)且味道好的甜菊醇4糖糖苷，这些作为低热量甜味剂受瞩目。除此以外，已知存在被认为是反应中间体的糖苷或糖的种类不同的类似物。例如，reb.a的4个糖苷糖均为葡萄糖，但是已知有在其中13位的葡萄糖的2位上附加了并非葡萄糖而是鼠李糖的瑞鲍迪苷c(reb.c)或在同位置上附加了木糖的瑞鲍迪苷f(reb.f)。
迄今为止由于4个糖苷糖均为葡萄糖的reb.a的味道良好，通过对相比野生型的甜菊植物reb.a的含量更多的甜菊植物进行品种改良等而获取reb.a的尝试正在进行(例如，专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3436317号公报
技术实现要素：
另一方面，在经过品种改良的甜菊品种中，有时会含有微量的至今还未确定其结构的甜菊醇糖苷，该微量的甜菊醇糖苷的存在可能会赋予甜菊萃取物以特征性的风味。此外，迄今为止，虽然针对在reb.a上进一步附加了葡萄糖的甜菊醇糖苷及含有该糖苷的品种的研究不断发展，但是关于大量含有如reb.c这样的含有鼠李糖的甜菊醇糖苷的品种或该品种含有的甜菊醇糖苷，在当前几乎没有研究。
因此，本发明的目的在于确定对味道造成影响的微量的新型甜菊醇糖苷的结构，并把握其味道特性。此外，本发明的进一步的目的在于提供一种新型甜菊醇糖苷及其制造方法，以及含有该物质的甜味剂组合物。
本发明者们为了解决上述课题进行了深入研究，结果成功的确定了对味道造成影响的微量的新型甜菊醇糖苷的结构。本发明为基于上述见识的发明。
根据本发明，可以提供一种对味道造成影响的微量的新型甜菊醇糖苷。进一步根据本发明，可以提供新型甜菊醇糖苷的制造方法，以及含有新型甜菊醇糖苷的甜味剂组合物、饮食品、植物及其萃取物以及调味剂。
附图说明
图1为表示甜菊醇糖苷的结构和名称的图。
图2为表示样本1的m/z1273.5的选择性离子色谱的图。
图3为表示瑞鲍迪苷n和式(1)所示的化合物的ms/ms及ms3碎片化质谱的图。
图4(a)为表示化合物11的1h-nmr频谱(800mhz,pyr-d5)的图，(b)为表示化合物11的13c-nmr频谱(200mhz,pyr-d5)的图。
图5(a)为表示化合物11的1h-1hcosy频谱(800mhz,pyr-d5)的图，(b)为表示化合物11的hsqc频谱(800mhz,pyr-d5)的图。
图6为表示植物体的萃取物中含有的新型甜菊醇糖苷的鉴定步骤的图。
图7为表示通过生物合成得到的样本的m/z1273.5的选择性离子色谱的图。
图8为表示对比新型甜菊醇糖苷和瑞鲍迪苷a的感官评估的结果的图。
图9为表示本发明的调味剂对于reb.a的余味改善效果的评估结果的图表。
图10为表示本发明的调味剂对于reb.d的余味改善效果的评估结果的图表。
图11为表示本发明的调味剂对于砂糖(蔗糖)的甜味增强效果的评估结果的图表。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细的说明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，并非将本发明仅限定于该实施方式的意思。本发明，只要不脱离该主旨，可以用各种各样的方式实施。且，本说明书中引用的所有的文献及公开公报、专利公报其他的专利文献，作为参考纳入本说明书中。
本说明书中，“瑞鲍迪苷”及“reb.”表示相同的意思，皆表示“rebaudioside”。同样的，本说明书中，“杜克苷”表示“dulcoside”。
1.新型甜菊醇糖苷
本发明者们，最先确定了对味道造成影响的微量的新型甜菊醇糖苷的结构。本发明的新型甜菊醇糖苷(以下也称“本发明的糖苷”)是由式(1)所表示的化合物或其衍生物、其盐、或其水合物。
本发明的糖苷，如上所示，在甜菊醇的第19位具有含有3个分子的葡萄糖的糖链，在第13位具有含有2个分子的葡萄糖和1个分子的鼠李糖的糖链。
本发明的糖苷，不仅是式(1)所示的化合物，还可以是其衍生物、其盐或其水合物。本说明书中，所谓“衍生物”是指化合物中的小部分的构造上有变化，从而生成的化合物，例如，指如羟基的一部分被取代为其他的取代基的化合物。因此，作为式(1)所表示的化合物的衍生物，包含将该化合物中含有的羟基的一部分，取代为选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、芳基、氨基、氰基等中的取代基的化合物。本说明书中，所谓“式(1)的化合物的盐”是指式(1)的化合物在生理学上可容许的盐，例如钠盐。此外，关于本说明书，所谓的“式(1)的化合物的水合物”，是指在式(1)的化合物上附加了水分子的化合物。
本发明的糖苷并无特别限定，可以是植物来源的物质、化学合成物或生物合成物。例如，可以从大量含有reb.c的植物体中分离、提纯，也可以由化学合成或生物合成而获得。关于本发明的糖苷的制造方法的细节，稍后会在本说明书中说明。
本发明的糖苷，具有比砂糖(蔗糖)更高的甜味，且具有甜味余味良好的味道，仅在饮食品等中少量含有就可以影响其味道。因此，本发明的糖苷可以作为新型的甜味剂使用。
此外，本发明的其他实施方式中，本发明的新型甜菊醇糖苷为由式(a)所表示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物。
2.含有新型甜菊醇糖苷的甜味剂组合物
根据本发明的一种实施方式，可以提供含有式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物的甜味剂组合物(以下也称“本发明的甜味剂组合物”)。本发明的甜味剂组合物，只要含有式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物即可，并无特别限定，也可以是含有以下物质的组合物，该物质为含有式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物的萃取物。
本发明的甜味剂组合物中含有的本发明的糖苷的量并无特别限定。
或者，本发明的甜味剂组合物，优选含有比野生型的甜菊或甜菊萃取物中存在的量多出至少0.01％的量的本发明的糖苷的组合物。且，如上所述，本发明的糖苷为从大量含有reb.c的品种中初次检出的物质，在野生型的甜菊或其萃取物中完全不含有，或即使含有也是检出界限值以下的量。
本发明的甜味剂组合物，可以进一步含有其他的甜菊醇糖苷。例如，本发明的甜味剂组合物，在本发明的糖苷之外，还可以进一步含有选自瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷c、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷i、瑞鲍迪苷j、瑞鲍迪苷k、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷q、瑞鲍迪苷r、杜克苷a、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的一种以上的甜菊醇糖苷。
含有其他的甜菊醇糖苷时，本发明的糖苷和其他的甜菊醇糖苷的组成比以质量计优选0.01:9.99～6:4。
本发明的甜味剂组合物可以进一步含有一般的甜味剂。作为这样的一般的甜味剂，可列举，果糖，砂糖，果葡糖浆(glucose-fructosesyrup)、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、高果糖浆(highfructosesyrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴特糖精、糖精等人工甜味剂等。尤其，从清爽度、饮用容易度、自然的味道、赋予适度的浓郁味道的观点出发，优选使用天然甜味剂，特别适合使用果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、砂糖。这些甜味剂可以仅使用一种，也可以使用复数种。
3.含有新型甜菊醇糖苷的饮食品
根据本发明的一种实施方式，可提供含有式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物的饮食品(以下也称“本发明的饮食品”)。本发明的饮食品只要含有式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物即可并无特别限定，也可以是含有下述萃取物或甜味剂组合物的饮食品，该萃取物或甜味剂组合物含有式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐或其水合物。这里所谓饮食品，指饮料及食品。因此，在某种实施方式中，本发明提供新型的饮料或食品，此外提供该饮料或食品的制造方法。
本发明的饮食品中含有的本发明的糖苷的量，根据具体的饮食品而不同，大致优选为0.0004％～0.8％，特别优选为0.04％～0.4％。将含量设置在此范围内具有可以控制余味的优点。
本发明的饮食品，可以进一步含有其他的甜菊醇糖苷。例如，本发明的甜味剂组合物，除本发明的糖苷之外，还可以进一步含有选自瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷c、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷i、瑞鲍迪苷j、瑞鲍迪苷k、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷q、瑞鲍迪苷r、杜克苷a、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的一种以上的甜菊醇糖苷。
含有其他的甜菊醇糖苷时，本发明的糖苷和其他的甜菊醇糖苷的组成比以质量计优选0.01:9.99～6:4。
本发明的饮食品可以进一步含有一般的甜味剂。作为这样的一般的甜味剂，可列举，果糖，砂糖，果葡糖浆(glucose-fructosesyrup)、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、高果糖浆(highfructosesyrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴特糖精、糖精等人工甜味剂等。尤其，从清爽度、饮用容易度、自然的味道、赋予适度的浓郁味道的观点出发，优选使用天然甜味剂，特别适合使用果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、砂糖。这些甜味剂可以仅使用一种，也可以使用复数种。
作为本发明的食品的例子，虽非特别限定，作为食品，可列举点心、面包类、面粉、面条类、米饭类、农业或林业加工食品、畜牧业加工品、水产加工品、奶或乳制品、油脂或油脂加工品、调料或其他的食品原材料等。
作为本发明的饮料的例子，虽非特别限定，例如可列举碳酸饮料、非碳酸饮料、酒精饮料、非酒精饮料、咖啡饮料、茶饮料、可可饮料、营养饮料、机能性饮料等。
本发明的饮料，可以经加热杀菌、制成填充在容器中的状态的包装饮料。作为容器并无特别限定，例如可列举pet瓶、铝罐、钢罐、纸盒、冷藏杯、瓶等。进行加热杀菌时，其种类并无特别限定，例如可以利用uht杀菌及高温高圧杀菌等一般的方法来进行。加热杀菌工序的温度并无特别限定，例如为65～130℃，优选为于85～120℃,10～40分钟。其中，只要能得到和上述的条件相同的杀菌值，于适当的温度杀菌数秒，例如5～30秒，也没有问题。
4.含有新型甜菊醇糖苷的植物及其萃取物
根据本发明的一种实施方式，可提供含有新型甜菊醇糖苷的植物体及其萃取物。此外，根据本发明的其他实施方式，可提供含有本发明的植物体或植物体的萃取物的饮食品，优选饮料。本发明的植物体中含有的本发明的糖苷的量虽无特殊限定，优选为0.001％～1.000％，更优选为0.01％～0.80％。
本发明的植物体，优选为相比野生型甜菊品种以高出0.01％以上的含量含有本发明的糖苷的植物体。如上所述，本发明的甜菊醇糖苷，在野生型的甜菊中完全不含有，或即使含有也是检出界限值以下的量。
所谓“相比野生型甜菊品种以高出0.01％以上的含量含有本发明的糖苷”，是指将从野生型甜菊植物体的新鲜叶(非干燥叶)中得到的萃取液的每单位量(例如10ml)中含有的本发明的糖苷的量(浓度)作为基准时，从本发明的植物体的新鲜叶(非干燥叶)中得到的萃取液的每相同单位量(与从上述野生型甜菊植物体的叶中得到的萃取液相同的量)中含有的本发明的糖苷的量(浓度)为高出0.01％以上的含量。在此，本发明的植物体，也可含有相比野生型甜菊品种高出0.02％以上、0.03％以上、0.04％以上、0.05％以上、0.07％以上、0.09％以上、0.10％以上、0.15％以上、0.20％以上、0.40％以上、0.60％以上、0.80％以上、1.00％以上、1.50％以上、2.00％以上、4.00％以上、6.00％以上、8.00％以上、10.00％以上的含量的本发明的糖苷。
此外，所谓“本发明的糖苷在总甜菊醇糖苷中所占的比例在0.01％以上”是指对于从本发明的甜菊植物体的新鲜叶(非干燥叶)中得到的萃取液中存在的总甜菊醇糖苷，本发明的糖苷以0.01％以上的比例存在。在此，所谓总甜菊醇糖苷，不包含未知的甜菊醇糖苷，此外也不包含低于检出界限值的甜菊醇糖苷。总甜菊醇糖苷优选由瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷c、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷i、瑞鲍迪苷j、瑞鲍迪苷k、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷q、瑞鲍迪苷r、杜克苷a、甜叶悬钩子苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷组成。
本发明的糖苷在本发明的植物体中所占的含量如上所示，但从本发明的植物体中得到干燥叶时，相对于该干燥叶的重量，本发明的糖苷也可存在0.01重量％以上、0.02重量％以上、0.03重量％以上、0.04重量％以上、0.05重量％以上、0.07重量％以上、0.10重量％以上、0.15重量％以上、0.20重量％以上、0.30重量％以上、0.50重量％以上、0.60重量％以上、0.80重量％以上、1.00重量％以上、2.00重量％以上、4.00重量％以上、6.00重量％以上、8.00重量％以上、10.00重量％以上的量。
在此所谓本发明的植物体的干燥叶，是指通过将本发明的植物体的新鲜叶进行干燥，使含水量下降至10重量％以下、7重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下、2重量％以下、1重量％以下的叶。本发明的植物体的干燥叶的含水量优选为3～4重量％。
作为本发明的植物体的例子，例如可列举大量含有reb.c的植物体。如上所述，本发明的甜菊醇糖苷，在野生型的甜菊中完全不含有，或即使含有也是检出界限值以下的量。另一方面，本发明者们知晓了本发明的甜菊醇糖苷，在大量含有reb.c的植物体中大量含有。从而，在含有新型甜菊醇糖苷的植物体及其萃取物中，包含上述大量含有reb.c的植物体及其萃取物。
作为上述大量含有reb.c的植物体并无特殊限定，例如可列举相对于野生型甜菊品种以高出20％以上的含量含有瑞鲍迪苷c的高瑞鲍迪苷c含有型非转基因甜菊植物体，且瑞鲍迪苷c在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上的植物体(以下也称“高reb.c植物体”)。
作为上述高reb.c植物体，例如可列举相对于野生型甜菊品种以高出20％以上的含量含有瑞鲍迪苷c的高瑞鲍迪苷c含有型非转基因甜菊植物体，且瑞鲍迪苷c在总甜菊醇糖苷中所占的比例为40％以上的植物体。
高reb.c植物体，是由野生品种的甜菊植物体派生的品种，是产生了使瑞鲍迪苷c变高的基因变异的品种。此外，该基因的变异，虽非特别限定，例如可列举天然条件下产生的、由非转基因的方法产生的、或由转基因而产生的变异。
高reb.c植物体，例如可以根据从该植物体的组织中检出基因多态性而筛选。在此，所谓“筛选”是指，识别高reb.c植物体及其以外的植物体，并选择高reb.c植物体。
高reb.c植物体还可以根据包含下述工序的筛选方法而筛选：确定被检验物质的基因组中序列号11号所示的碱基序列的第60位的碱基序列从野生型的a变异成t的多态性的工序。
本发明的植物体中并非仅包含植物体全体，还包含植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、栅栏薄壁组织、海绵状组织等)或各种形态的植物细胞(例如悬浊培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。
此外，本发明的植物体中，也包含组织培养物或植物培养细胞。是因为通过培养上述组织培养物或植物培养细胞，可以再生植物体。作为本发明的植物体的组织培养物或植物培养细胞的例子，可列举胚、分裂组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织等，但并非限定于此。
本发明的植物体的萃取物，可以通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应来获取。萃取条件等可以参照wo2016/090460中所记载的方法或下述的实施例中所记载的方法。
本发明的植物体的萃取物，优选为相比野生型甜菊品种以高出0.01％以上的含量含有本发明的糖苷，且本发明的糖苷在总甜菊醇糖苷中所占的比例在0.01％以上。在此，所谓“相比野生型甜菊品种以高出0.01％以上的含量含有本发明的糖苷”如上所述。此外，所谓“本发明的糖苷在总甜菊醇糖苷中所占的比例在0.01％以上”如上所述。
5.含有新型甜菊醇糖苷的调味剂
本发明的新型甜菊醇糖苷，虽然在甜菊萃取物中仅含有微量，但被认为是影响该甜菊萃取物的风味的物质。虽然并非被理论所约束，但是认为通过少量添加本发明的甜菊醇糖苷，可以调整饮食品的风味。从而，根据本发明的一种实施方式，提供含有上述式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐、或其水合物的调味剂。
本说明书中，所谓“调味剂”，是指被添加到饮食品中时，可以调整该饮食品的风味的物质。本发明的调味剂，优选在被添加到饮食品中时，调味剂本身的味道并不会被消费者察觉，而可以调整该饮食品自身的风味。例如，本发明的甜菊醇糖苷，相比于以往的甜菊醇糖苷具有甜味的余味良好的特征，因此通过用作调味剂可以调整饮食品的甜味的余味。
本发明的调(增)味剂，优选在上述式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐、或其水合物之外，含有一种以上其他的甜味剂。作为上述甜味剂，可列举选自瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷k及瑞鲍迪苷j中的一种以上甜菊醇糖苷或果糖、砂糖、果葡糖浆(glucose-fructosesyrup)、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、高果糖浆(highfructosesyrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴特糖精、糖精等人工甜味剂等。
在本发明的一种实施方式中，本发明的调味剂是含有上述式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐、或其水合物的改善余味的调味剂。通常市售的饮食品(例如清凉饮料)的brix为至15的程度，但由于现在健康意向的高涨以及砂糖税的导入，正在研究降低饮食品中的砂糖量。且正在尝试当砂糖量降低时，用砂糖以外的甜味剂(例如无热量甜味剂)来补充因砂糖量降低而下降的brix的部分。例如，若将原brix为10的饮食品中的砂糖量减半，由于brix变为5，因此需要添加砂糖以外的甜味剂来确保相当于brix5的甜度。然而，砂糖以外的多数甜味剂都具有和砂糖不同的独特的风味，且作为其中代表性的风味之一，具有甜味的余味不好的特点。由于本发明的甜菊醇糖苷的甜味的余味良好，因此含有本发明的甜菊醇糖苷的调味剂可以作为改善余味的调味剂使用。另外，本说明书中所谓“brix”，为饮食品中的甜度的指标，为将可溶性固体成分浓度换算为20℃下蔗糖溶液的重量百分比浓度的值。从而，以蔗糖水溶液100g中的蔗糖量(g)表示。例如，brix5表示于蔗糖水溶液100g中含有5g蔗糖的溶液的甜度相当的甜度。
本发明的调味剂，优选对于饮食品中含有的砂糖以外的甜味剂，以该甜味剂的质量为基准添加1质量％～15质量％的量。本发明的调味剂的添加量，更优选对于饮食品中含有的其他甜味剂，为以该甜味剂的质量为基准的1.5质量％～12质量％的量，进一步优选为3.5质量％～11质量％的量。添加本发明的调味剂的饮食品中砂糖以外的甜味剂的含量，以brix换算优选5～13，更优选5～12，进一步优选5～7。另外，所谓“砂糖以外的甜味剂的含量以brix换算为5”，是指含有砂糖以外的甜味剂的水溶液的甜味和brix5的甜味相当的含量，例如，砂糖以外的甜味剂的甜度为砂糖的200倍时，“砂糖以外的甜味剂的含量以brix换算为5”的量为在含有砂糖以外的甜味剂的水溶液100g中含有0.025g。在本发明的优选实施方式中，本发的调味剂为对于饮食品中含有的砂糖以外的甜味剂，以该甜味剂的质量为基准添加1质量％～15质量％的量的调味剂，该砂糖以外的甜味剂的含量以brix换算为5.5～12。在本发明的其他优选实施方式中，本发明的调味剂为对于饮食品中含有的砂糖以外的甜味剂，以该甜味剂的质量为基准添加1.5质量％～12质量％的量的调味剂，该砂糖以外的甜味剂的含量以brix换算为5～13。
作为饮食品中含有的其他甜味剂虽并无特殊限定，可列举选自鲍迪苷a、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷k及瑞鲍迪苷j中的一种以上甜菊醇糖苷或果糖、果葡糖浆(glucose-fructosesyrup)、葡萄糖、麦芽糖、高果糖浆(highfructosesyrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴特糖精、糖精等人工甜味剂等。
在本发明的其他实施方式中，本发明的调味剂为含有上述式(1)所示的化合物或其衍生物、其盐、或其水合物的，增强甜味的调味剂。所谓增强甜味的调味剂，是指在添加入含有甜味剂的饮食品中时，可以给该饮食品带来比单纯的加上该调味剂所具有的甜味的甜度更高的甜味的调味剂。例如，当向具有和brix9相当的甜味的饮食品中添加brix0.1相当量的调味剂时，可以将饮食品的甜度调整为超过brix9.1的甜度(例如brix9.2)的调味剂。通过使用上述增强甜味的调味剂，具有可以减少使用的甜味剂的总量、可以降低热量或降低成本的优点。
本发明的增强甜味的调味剂，在作为增强甜味对象的甜味剂的甜度为1～10时，优选以作为增强甜味对象的甜味剂的质量为基准添加0.05质量％～2.0质量％的量，更优选添加0.1质量％～1.5质量％的量，进一步优选添加0.2质量％～1.2质量％的量。
作为甜味增强对象的甜味剂虽并无特殊限定，可列举选自鲍迪苷a、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷k及瑞鲍迪苷j中的一种以上甜菊醇糖苷或果糖、砂糖、果葡糖浆(glucose-fructosesyrup)、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、高果糖浆(highfructosesyrup)、糖醇、低聚糖、蜂蜜、甘蔗榨汁(黑糖蜜)、饴糖、罗汉果末、罗汉果萃取物、甘草末、甘草萃取物、翅果竹芋种子末、翅果竹芋种子提取物等天然甜味剂或乙酰氨基磺酸钾、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴特糖精、糖精等人工甜味剂等。
6.新型甜菊醇糖苷的制造方法
如上所述，本发明的甜菊醇糖苷可以通过(a)从植物体中的分离、提纯、(b)化学合成或(c)生物合成来制造。以下针对各种方法进行说明。
(a)从植物体中的分离、提纯
本发明的植物体由于是含有本发明的新型甜菊醇糖苷的植物体，可以从该植物体中分离、提纯新型甜菊醇糖苷。新型甜菊醇糖苷，因此可以通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应以萃取液的状态萃取。萃取条件等可以参照wo2016/090460中所记载的方法或下述的实施例中所记载的方法。
进一步，对于这样得到的萃取液，可通过利用乙酸乙酯、其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography：hplc)、超高效液相色谱(ultra(high)performanceliquidchromatography：uplc)等公知的方法分离、提纯新型甜菊醇糖苷。
植物体中的新型甜菊醇糖苷的含量可以通过wo2016/090460中所记载的方法或下述的实施例中所记载的方法测定。具体而言，可以将本发明的植物体中的新鲜叶制成样本，通过实施lc-ms/ms来测定。
(b)化学合成
以下针对本发明的甜菊醇糖苷的合成方法进行详细说明。
甜菊醇糖苷具有在作为糖苷配基的甜菊醇上以各种各样的键合方式(键合位置或立体)附加各种糖(葡萄糖、鼠李糖、木糖等)的结构。因此，根据选择的原材料，可以通过各种各样的合成路径获得作为目标的甜菊醇糖苷。然而，根据合成路径的不同，获取目标化合物的时间、收获率等会大幅变化是被本发明的技术领域的技术人员所理解的。
本发明者们此次得知了通过特定的合成路径，可高选择性且高收获率地获取本发明的甜菊醇糖苷的新型制造方法。在本发明的甜菊醇糖苷的合成方法中，进行甜菊醇糖苷的化学合成时，如方案(scheme)1所示，将甜菊醇糖苷分成“甜菊醇配糖体(steviolglycoside)”和“糖半缩醛体”进行合成。
方案1甜菊醇糖苷的新型合成法
甜菊醇配糖体(steviolglycoside)可以通过由已存的天然物衍生(瑞鲍迪苷、杜克苷、甜菊苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷等)来调制。另一方面，糖半缩醛体可以通过已存在的天然物来调制，或通过化学合成调制。本发明者们得知若将甜菊醇配糖体和糖半缩醛体通过光延反应进行缩合，则能以良好的收获率且极高的β选择性获得甜菊醇糖苷。
根据本发明的一种实施方式，可以提供一种方法，其为式(1)所示的化合物的制造方法，该方法包含(a)由下述式(2)所示的瑞鲍迪苷c合成下述式(3)所示的化合物的工序和(b)由吡喃葡萄糖苷衍生物合成下述式(4)所示的化合物的工序，
其中，式(3)中pg各自独立地表示保护基，式(4)中pg各自独立地表示保护基。
根据本发明的一种进一步的实施方式,可以提供一种方法,其为式(1)所示的化合物的制造方法，该方法包含使上述式(3)所示的化合物和上述式(4)所示的化合物在磷化氢试剂及偶氮化合物的存在下反应，获得下述式(5)所示的化合物的工序，
式(5)中pg各自独立地表示保护基。
本说明书中,作为保护基,可列举酰基类保护基、3取代甲硅烷基、缩醛类保护基、醚类保护基等。优选列举3取代甲硅烷基(三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基及叔丁基二甲基甲硅烷基等)或酰基类保护基(乙酰基及苯甲酰基等)。
(a)第1工序(甜菊醇配糖体的合成)
甜菊醇配糖体，例如可以将天然存在的瑞鲍迪苷c(杜克苷b)作为原料，依照下述方案2来获取。
方案2甜菊醇配糖体的合成
首先，将瑞鲍迪苷c溶解到甲醇等溶剂和水中，加入氢氧化钠等强碱，通过于60℃～120℃下回流2个小时以上，葡萄糖分子从瑞鲍迪苷c的第19位脱离得到上述化合物2。此时，也可使用阳离子交换树脂等对反应液进行中和后使溶剂蒸发。
可以将化合物2进一步溶解于吡啶等溶剂中，加入乙酸酐等通过保护化合物2中含有的羟基获得化合物3。
(b)第2工序(3糖半缩醛的合成)
3糖半缩醛，例如可以将市售的吡喃葡萄糖苷衍生物作为原料，依照下述方案3来获取。
方案33糖半缩醛体的合成
首先，通过将4-甲氧苯基β-d-吡喃葡萄糖苷(4)溶解到乙腈等溶剂中，加入苯甲醛二甲缩醛及樟脑磺酸(酸催化剂)，于25℃～80℃下搅拌2小时以上可获得化合物5。其次，通过将化合物5溶解到2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖酰基2,2,2-三氯亚胺乙酸酯(6)、分子筛
通过将化合物7溶解到乙醇等溶剂中，于室温下加入对甲苯磺酸，于60℃～80℃下搅拌2小时以上使反应结束后，用三乙基胺进行中和，将减压浓缩得到的糖浆溶解到吡啶等的溶剂中，添加乙酸酐等获得羟基被保护的化合物8。通过将化合物8溶解到乙腈及水中，加入硝酸铈铵等氧化剂搅拌5分～2小时获得化合物9。
(c)第3工序(式(1)所示的化合物的合成)
式(1)所示的化合物的合成,例如可以使用上述工序1及2得到的化合物3及9，依照下述方案4获得。
首先，将由工序1及2得到的3糖半缩醛体和甜菊醇配糖体通过光延反应使其反应，可以以非常高的收获率(45％以上)，选择性的获取仅β体的化合物10。具体而言，将上述化合物溶解到1，4-二氧杂环乙烷中，于室温下加入三丁基膦或三苯基膦等膦试剂、1,1'-偶氮二(n,n’-二甲基甲酰胺)(tmad)等偶氮化合物，于50℃～80℃下搅拌2小时以上获取β体的化合物10。最后，通过将化合物10的保护基进行脱保护，获得式(1)所示的化合物(化合物11)。
(3)生物合成
本发明的甜菊醇糖苷，可以通过将编码特定的蛋白质的多核苷酸导入来自细菌、植物、昆虫、除人类以外的哺乳动物等的宿主细胞中，以甜菊醇或甜菊醇糖苷、udp-葡萄糖及/或udp-鼠李糖作为底物而生成。作为底物的甜菊醇、甜菊醇糖苷、udp-葡萄糖、udp-鼠李糖可以加入，也可以使其在细胞内生物合成。作为特定的蛋白质的例子，可列举来自甜菊的ugt85c2(氨基酸序列为序列号2)、ugt74g1(氨基酸序列为序列号4)、ugt91d2(氨基酸序列为序列号6)、ugt76g1(氨基酸序列为序列号8)及来自拟南芥的udp-鼠李糖合成酶atrhm2(氨基酸序列为序列号10)，只要是具有同等活性的物质即可并不限定于此。
上述蛋白质，是来自拟南芥或甜菊的酶，可期待其在拟南芥或甜菊等植物细胞外的环境(例如，细胞外、除甜菊以外的宿主细胞内)也具有高活性。此时，可以通过将编码上述蛋白质的多核苷酸(例如，ugt85c2基因为序列号1、ugt74g1基因为序列号3、ugt91d2基因为序列号5、ugt76g1基因为序列号7及atrhm2基因为序列号9)导入来自细菌、真菌类、植物、昆虫、除人类以外的哺乳动物等的宿主细胞中使本发明的蛋白质表达，通过添加作为底物的甜菊醇、甜菊醇糖苷、udp-葡萄糖、udp-鼠李糖生成本发明的化合物。或者，根据宿主的不同，通过使上述蛋白质在宿主细胞内表达，并添加适当的底物来生成本发明的化合物。
根据本发明的一种实施方式，可以提供一种方法，其为制造本发明的新型甜菊醇糖苷的方法，其特征在于使用导入了下述的(a)～(g)中的至少一种的多核苷酸的非人类转化体：
(a)含有序列号1的碱基序列的多核苷酸、含有相对于序列号1的碱基序列具有90％以上的一致性的碱基序列的多核苷酸或编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上的一致性且具有在甜菊醇糖苷的13位的羟基上附加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；(b)含有序列号3的碱基序列的多核苷酸、含有相对于序列号3的碱基序列具有90％以上的一致性的碱基序列的多核苷酸或编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上的一致性且具有在甜菊醇糖苷的19位的羧酸上附加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(c)含有序列号5的碱基序列的多核苷酸、含有相对于序列号5的碱基序列具有90％以上的一致性的碱基序列的多核苷酸或编码相对于序列号6的氨基酸序列具有90％以上的一致性且具有在与甜菊醇糖苷的13位结合的葡萄糖上由1→2键合的方式附加鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(d)含有序列号7的碱基序列的多核苷酸、含有相对于序列号7的碱基序列具有90％以上的一致性的碱基序列的多核苷酸或编码相对于序列号8的氨基酸序列具有90％以上的一致性且具有在甜菊醇糖苷的13位的葡萄糖的3位上由1→3键合的方式附加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(e)含有序列号5的碱基序列的多核苷酸、含有相对于序列号5的碱基序列具有90％以上的一致性的碱基序列的多核苷酸或编码相对于序列号6的氨基酸序列具有90％以上的一致性且具有在甜菊醇糖苷的19位的葡萄糖上由1→2键合的方式附加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(f)含有序列号7的碱基序列的多核苷酸、含有相对于序列号7的碱基序列具有90％以上的一致性的碱基序列的多核苷酸或编码相对于序列号8的氨基酸序列具有90％以上的一致性且具有在甜菊醇糖苷的19位的葡萄糖上由1→3键合的方式附加葡萄糖的活性的蛋白质的多核苷酸；
(g)含有序列号9的碱基序列的多核苷酸、含有相对于序列号9的碱基序列具有90％以上的一致性的碱基序列的多核苷酸或编码相对于序列号10的氨基酸序列具有90％以上的一致性且具有由udp-葡萄糖生成udp-鼠李糖的活性的蛋白质的多核苷酸。
根据本发明的优选实施方式，可以使用对于上述(a)～(g)中记载的各序列号的碱基序列，独立的具有91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上的序列一致性的多核苷酸。
根据本发明的其他的优选实施方式，可以使用具有对于上述(a)～(g)中记载的各序列号的氨基酸序列，独立的具有91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上的序列一致性的氨基酸序列且具有上述(a)～(g)中记载的特定的活性的蛋白质。
编码上述蛋白质的多核苷酸，优选以插入到适当的表达载体的状态导入宿主中。上述多核苷酸可以各自插入到分别的载体中。
适当的表达载体，通常由含有下述物质而构成：
(i)在宿主细胞内可以转录的启动子；
(ii)与该启动子结合的本发明的多核苷酸；及
(iii)和rna分子的转录终止及聚腺苷酸化相关，作为在宿主细胞内发挥作用的信号的构成要素而含有的表达盒。
作为表达载体的制作方法，可列举利用质粒、噬菌体或黏质体的方法，或具有必要的构成要素的dna分子但并无特殊限定。
载体的具体的种类无特殊限定，可在宿主细胞中适当选择可以表达的载体。即，根据宿主细胞的种类，为了确切的使本发明的多核苷酸表达，选择适宜的启动子序列，将在各种质粒中编入了此序列和本发明的多核苷酸的载体作为表达载体使用即可。
本发明的表达载体，依赖于需要导入的宿主的种类含有表达控制区域(例如，启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子，使用惯用的启动子(例如，trc启动子、tac启动子、lac启动子等)，作为酵母菌用启动子，例如可列举甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、ph05启动子、gal1/10启动子等，作为丝状真菌用启动子，例如可列举淀粉酶、trpc等。此外，作为使植物细胞内的目的基因表的的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35srna启动子、rd29a基因启动子、rbcs启动子、将上述花椰菜花叶病毒的35srna启动子的增强子序列附加到来自农杆菌的甘露碱合成酶启动子序列的5’侧的mac-1启动子等。作为动物细胞宿主用启动子，可列举病毒性启动子(例如，sv40初期启动子、sv40后期启动子等)。作为由于外在刺激活化为诱导型启动子的例子，可列举小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)启动子、四环霉素应答性启动子、金属硫蛋白启动子及热休克蛋白启动子等。
表达启动子优选含有至少一种的选择标记。作为上述标记，可以利用营养缺陷型标记(leu2、ura3、his3、trp1、ura5、niad)、耐药性标记(潮霉素、博来霉素)、耐遗传霉素性基因(g418r)、耐铜性基因(cup1)(marinetal.,proc.natl.acad.sci.usa,vol.81,p.337,1984)、耐浅蓝霉素性基因(fas2m、pdr4)(分别为，猪腰淳嗣等，生物化学，vol.64,p.660,1992；hussainetal.,gene,vol.101,p.149,1991)等。
作为宿主细胞的转化方法可以利用通常所用的公知的方法。例如，可以通过电穿孔法(mackenxie,d.a.etal.,appl.environ.microbiol.,vol.66,p.4655-4661,2000)、粒子轰击法(日本特开2005-287403)、原生质球法(proc.natl.acad.sci.usa,vol.75,p.1929,1978)、醋酸锂法(j.bacteriology,vol.153,p.163,1983)、methodsinyeastgenetics,2000edition:acoldspringharborlaboratorycoursemanual等中记载的方法来实施，但并不限定与此。
此外，关于一般的分子生物学的方法，可以参考"sambrook&russell,molecularcloning:alaboratorymanualvol.3,coldspringharborlaboratorypress2001"、"methodsinyeastgenetics、alaboratorymanual(coldspringharborlaboratorypress、coldspringharbor,ny)”等。
通过培养这样得到的非人类转化体，可以使非人类转化体生产甜菊醇糖苷。上述非人类转化体优选酵母菌。此外，非人类转化体的培养优选在含有甜菊醇的培养基中进行。通过对累积的甜菊醇糖苷的萃取、提纯，可以获得本发明的甜菊醇糖苷。
实施例
[新型甜菊醇糖苷的分离]
对从由三得利全球创新中心有限公司(sic)开发的4个体系的新型甜菊植物体(样本1(em3-4)、样本2(em2-27-8)、样本3(em2-27-15)及样本4(em2-11))的叶得到的萃取物进行高效液相色谱法(hplc)-质谱分析(ms)，以d-吡喃葡萄糖基(glc)、l-吡喃鼠李糖基(rha)、吡喃木糖基(xyl)构成糖链的甜菊醇糖苷的分子量为基础，对含有的甜菊醇糖苷进行筛选分析。在此，样本1为具有基因组中序列号11所示的碱基序列的第60位的碱基序列从野生型的a变异成t的多态性的高reb.c植物体。且，通过对高reb.c浓度的表型和序列号11的多态性的相关关系进行统计分析，结果明确了该多态性和高reb.c浓度的表型具有在统计学上的相关关系。
关于测试溶液的调制方法，分别称量进行了冷冻干燥处理的甜菊干燥叶10.0mg到细颈瓶中，添加水/甲醇(1/1vol/vol)1.0ml作为萃取溶剂，然后在超声波清洗器(asone,as52gtu)中，在25℃的设定温度下施加超声波20分钟，从甜菊叶中得到甜菊醇糖苷的萃取液。为了进一步提供给hplc-ms，用水/甲醇进行10倍稀释，用孔径0.45μm的过滤器(nacalaitesque，cosmonicefilters(溶剂类))进行过滤。
hplc-ms的hplc，作为输液单元lc泵使用nexeralc-30ad(岛津制作所)、作为分离柱使用sm-c18(4.6x250mm)(imtakt公司制)。关于lc流动相的输液，流动相a使用含有0.2％醋酸的超纯水(milliqwater)，流动相b使用甲醇，使二元梯度于流动相b浓度为10％保持恒定0-5分钟，然后用15分钟使流动相b浓度从10％变化至70％，进一步用5分钟使b浓度从70％变化至100％，最后使流动相b浓度在100％保持5分钟然后结束。以流动相的流速为0.4ml/分，注入稀释后经过滤器过滤的甜菊叶萃取液5μl。
ms使用了装置了电喷射离子化(esi)离子源的三重四极杆质谱仪lcms-8030(岛津制作所)。质谱分析测定，在负离子测定模式、选择m/z值并进行测定的选择性离子检测(sim)模式下进行测定。关于选择的m/z值，选择了以d-吡喃葡萄糖基(glc)、l-吡喃鼠李糖基(rha)、吡喃木糖基(xyl)构成糖链的甜菊醇糖苷的分子量为基础计算的m/z值。从而，选择了m/z＝641.2(glc(2)),773.2(glc(2),xyl(1)),787.2(glc(2),rha(1)),803.2(glc(3)),935.3(glc(3),xyl(1)),949.3(glc(3),rha(1)),965.3(glc(4)),1095.4(glc(3),rha(2)),1097.4(glc(4),xyl(1)),1111.4(glc(4),rha(1)),1127.4(glc(5)),1257.5(glc(4),rha(2)),1259.5(glc(5),xyl(1)),1273.5(glc(5),rha(1)),1289.5(glc(6)),1435.6(glc(6),rha(1))。进一步，通过在相同的条件下对可得到的高纯度试剂，瑞鲍迪苷a、b、d、f、m、n、o，甜菊苷，杜克苷a、b进行测定，确认了hplc的负离子m/z值、保留时间。检测出的主要的甜菊醇糖苷的峰面积值(任意单位：arbitraryunit)由表1所示。
[表1]
表1.由hplc-ms的sim测定观测的峰面积值(arbitrayunit)
从甜菊醇糖苷的被修饰的糖链含有5个葡萄糖(glc)和1个鼠李糖(rha)的甜菊醇糖苷(m/z1273.5)的选择性离子色谱中观察到2个谱峰。图1中表示了样本1(em3-4)在m/z1273.5条件下的选择性离子色谱。
图2所示的2个谱峰中，在保留时间(rt)28.23分上的谱峰，与瑞鲍迪苷n的标准品的质量值、保留时间一致。另一方面，至今尚未报告在甜菊醇糖苷中存在和瑞鲍迪苷n具有相同质量的物质。即，可知图2所示的2个谱峰中，rt27.73分的谱峰为未知的物质。在瑞鲍迪苷c的含有率低于瑞鲍迪苷a，且糖链的延长也较其他的样本低的样本4中rt27.73分的峰值在检出界限以下。
[新型甜菊醇糖苷的结构分析]
在本发明中，由瑞鲍迪苷c高含有率品种中检测出的新型甜菊醇糖苷的结构分析通过以下步骤实施。
(i)根据高效液相色谱法(hplc)-高分辨率质谱分析(ms)及ms/ms、3级离子碎片化(ms3碎片化)的碎片化分析的结构推测、
(ii)通过化学反应进行的推测的甜菊醇糖苷标准品的化学合成、
(iii)根据化学合成标准品的hplc-高分辨率ms及ms3碎片化的保留时间和碎片化模式的一致性进行的结构确认
以下针对上述(i)～(iii)的工序分别进行详细的说明。
(i)根据高效液相色谱法(hplc)-高分辨率质谱分析(ms)及ms/ms、3级离子碎片化(ms3碎片化)的碎片化分析的结构推测
关于测试溶液的调制，分别称量进行了冷冻干燥处理的甜菊干燥叶10.0mg到细颈瓶中，添加水/甲醇(1/1vol/vol)1.0ml作为萃取溶剂，然后在超声波清洗器(asone,as52gtu)中，在25℃的设定温度下施加超声波20分钟，从甜菊叶中得到甜菊醇糖苷的萃取液。为了进一步提供给hplc-ms，用水/甲醇进行10倍稀释，用孔径0.45μm的过滤器(nacalaitesque，cosmonicefilters(溶剂类))进行过滤。
高效液相色谱法-电喷射离子化精密质谱分析(hplc-esi-hrms)的机器构成中，关于hplc的机器构成，作为输液单元lc泵使用prominencelc-20ad(岛津制作所)、作为分离柱使用sm-c18(4.6x250mm)(imtakt公司制)。关于lc流动相的输液，作为流动相a使用含有0.2％醋酸的超纯水(milliqwater)，作为流动相b使用甲醇，使二元梯度于流动相b浓度为10％保持恒定0-5分钟，然后用15分钟使流动相b浓度从10％变化至70％，进一步用5分钟使b浓度从70％变化至100％。最后使流动相b浓度在100％保持5分钟然后结束。以流动相的流速为0.4ml/分，注入稀释后经过滤器过滤的甜菊叶萃取液5μl。质谱分析部使用了装置了esi离子源的orbitrapelitems(thermofisherscientific公司制)。质谱分析测定在负离子测定模式下、m/z150-2000的范围、设定分辨率60，000的条件下进行了测定。ms/ms测定选择作为目标的m/z1273.5，并在通过和惰性气体的冲击进行碎片化的cid模式下进行。碎片化所需的能量的照射于作为装置固有的冲击能量标准的35下进行。
为了理解新型甜菊醇糖苷的碎片化模式，对已知其结构的标准品瑞鲍迪苷a及d、m的ms/ms及ms3碎片化模式进行了分析。结果在新型甜菊醇糖苷的ms/ms中得到了在19位上以酯键键合的糖链全部脱离的谱峰的离子强度表现为最强的数据。这个结果明确了糖链在19位的碳原子上以酯键键合，可知糖链的总分子量。
图3中表示了瑞鲍迪苷n和新型甜菊醇糖苷的ms/ms及ms3碎片化质谱图。将具有相同的ms值的瑞鲍迪苷n和新型甜菊醇糖苷的ms/ms质谱进行比较，结果瑞鲍迪苷n在相当于脱离了2个glc和1个rha份的m/z803.37的谱峰为主谱峰。另一方面，从新型甜菊醇糖苷的ms/ms质谱中，在相当于脱离3个glc份的m/z787.38上的谱峰作为主谱峰被检出。为了进一步获取结构信息，取得了ms3质谱，其对由ms/ms获得的主谱峰m/z787.4进行碎片化。其结果是，得到了具有和瑞鲍迪苷c的ms3质谱(949.4→787.4→)同样的谱峰模式的质谱。由此，推断出在13位上键合的糖链与瑞鲍迪苷c相同。此外，考虑到在本样本的甜菊叶中也含有瑞鲍迪苷m，从甜菊叶中的生物合成的潜能，推测出新型甜菊醇糖苷的19位上键合的糖链的结构与瑞鲍迪苷m的结构相同。推测结构由图3表示。
(1)合成路径概要
方案5新型甜菊醇糖苷的合成策略
如方案5所示，在新型甜菊醇糖苷(11)的合成中，通过甜菊醇配糖体(3)与3糖半缩醛体(9)以光延反应进行的缩合，获得新型甜菊醇糖苷(11)的骨架。甜菊醇配糖体(3)的合成中，从arkpharm公司购入的已知的天然物瑞鲍迪苷c(1)，对甜菊醇19位的酯键进行碱性水解后，通过用乙酰(ac)基对糖链的羟基进行保护，得到甜菊醇配糖体(3)。3糖半缩醛体(9)的合成中，通过被适当保护的葡糖糖受体(5)与葡萄糖供体(6)的缩合反应，制作3糖骨架，通过对还原端1位的保护基进行脱保护，得到3糖半缩醛体(9)。使得到的甜菊醇配糖体(3)与3糖半缩醛体(9)通过光延反应进行缩合，结果反应以47％(仅β体)和良好且完全的β选择性进行反应。通过对得到的化合物的保护基进行脱保护，得到新型甜菊醇糖苷(11)。
接下来对各合成工序进行说明。
(2)甜菊醇配糖体的合成
方案6甜菊醇配糖体的合成
如方案6所示，在甜菊醇配糖体(3)的合成中，将从arkpharm公司购入的瑞鲍迪苷c(1)(1.0g,1.05mmol)溶解至甲醇(10ml)和水(10ml)中，于室温下加入4mol/l的氢氧化钠(2.6ml,10.5mmol)，于100℃下回流20小时。通过tlc(三氯甲烷/甲醇/水＝5/4/0.1，rf值＝0.9)确认反应结束后，用阳离子交换树脂dowexmac-3hydrogenform(sigma-aldrich公司)对反应液进行中和(ph7)，将树脂滤除后，将减压浓缩得到的糖浆在真空泵中干燥18小时，得到化合物2(828mg,quant.)
将化合物2(828mg,1.05mmol)溶解至吡啶(20ml)中，于室温下加入醋酸酐(5ml)，在室温下搅拌48小时。通过tlc(乙酸乙酯/己烷＝2/1，rf值＝0.5)确认反应结束后，加入饱和的碳酸氢钠水溶液(5ml)，将减压浓缩反应液得到的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗出液(乙酸乙酯/己烷＝2/1)中得到化合物3(1.1g,92％)。
[化合物3]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ0.81(m,2h),0.83-1.45(complex,19h),1.39-1.91(complex,24h),1.91-2.35(s,30h),3.58(m,1h),3.71-3.81(complex,4h),3.95-4.12(complex,7h),4.34-4.46(complex,3h),4.56-4.66(complex,4h),4.69-4.92(complex,7h),5.05-5.14(complex,5h),5.23-5.38(complex,6h),5.45(s,1h)；13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ15.9,17.3,19.1,20.5,20.7,20.8,20.9,21.1,21.5,21.7,29.1,37.8,38.0,39.5,40.7,41.4,42.2,43.8,48.4,53.8,56.8,61.6,63.0,65.5,66.8,68.0,68.6,69.3,69.6,69.8,70.5,70.9,71.6,71.9,72.4,72.8,73.9,74.9,81.3,87.3,96.6,96.8,99.2,99.4,125.4,128.3,129.1,137.9,151.9,168.9,169.2,169.5,169.6,169.8,170.1,170.2,170.3,170.6,170.9,176.8,183.4
(3)3糖半缩醛体的合成
[化13]
方案73糖半缩醛体的合成
如方案7所示，在3糖半缩醛体(9)的合成中，将从东京化成购入的4-甲氧基苯基β-d-吡喃葡萄糖苷(4)(4.0g,13.9mmol)溶解至乙腈(70ml)中，于室温下加入苯甲醛二甲缩醛(3.1ml，20.9mmol)、樟脑磺酸(323mg，1.39mmol)，于50℃下搅拌18小时。通过tlc(三氯甲烷/甲醇＝10/1，rf值＝0.5)确认反应结束后，用三乙基胺(1ml)进行中和(ph8)，将减压浓缩得到的残渣结晶化(乙醇)，得到化合物5(4.0g、77％)。
[化合物5]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ3.58(m,1h,h-5),3.65(t,1h,h-4),3.78(m,5h,h-2,h-6,ome),3.92(t,1h,h-3),4.38(dd,1h,h-6’),4.92(d,j＝7.6hz,1h,h-1),5.57(s,1h,chph),6.84(dd,4h,omeph),7.49(m,5h,ph)；13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ31.1,55.8,66.7,68.8,73.4,74.6,80.5,102.2,102.5,114.8,118.8,126.4,128.5,129.5,136.9,150.9,155.9
将化合物5(1.0g、2.67mmol)和从东京成化购入的2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃半乳糖酰基2,2,2-三氯亚胺乙酸酯(6)(2.9g,5.88mmol)、分子筛
将化合物7(1.9g,1.84mmol)溶解至乙醇(18ml)中，于室温下加入对甲苯磺酸(35mg,0.184mmol)，于60℃下搅拌5.5小时。通过tlc(醋酸乙酯/己烷＝2/1，rf值＝0.1)确认反应结束后，用三乙基胺(5.0ml)进行中和(ph8)，将减压浓缩得到的糖浆溶解至吡啶(18ml)中，于室温下加入乙酸酐(347μl，3.68mmol)，于室温下搅拌18小时。通过tlc(乙酸乙酯/己烷＝2/1，rf值＝0.7)确认反应结束后，加入甲苯(30ml)反复共沸3次，将减压浓缩得到的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗出液(乙酸乙酯/己烷＝1/1→2/1)中得到化合物8(1.5g,54％,3steps)。
[化合物8]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ1.94-2.17(complex,30h,oac),2.91(m,1h),3.33(m,1h),3.71(m,1h),3.76(m,5h),3.94(t,1h),4.09-4.17(complex,5h),4.31(dd,1h),4.88(m,3h),4.96-5.08(complex,4h),5.18(m,2h),5.26(t,1h),6.84(dd,omeph)；13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ20.6×2,20.7×4,20.8×2,20.9,21.1,55.8,60.3,60.5,61.8,62.6,67.6,68.3,71.4,71.6,71.9,71.0,72.1,72.7,73.1,82.3,98.5,98.7×2,114.9,116.1,150.1,155.4,168.9,169.4×2,169.5,170.2,170.3,170.4,170.5
将化合物8(1.3g,1.26mmol)溶解至乙腈(20ml)、水(5.0ml)中，于0℃下加入硝酸铈铵(1.4g,2.52mmol)，于0℃下搅拌15分钟。通过tlc(乙酸乙酯/己烷＝2/1，rf值＝0.3)确认反应结束后，用醋酸乙酯进行稀释，用水、饱和碳酸氢钠水溶液对有机层进行洗涤，用硫酸镁进行干燥。滤除硫酸镁，将减压浓缩得到的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗出液(乙酸乙酯/己烷＝2/1)中得到化合物9(343mg,29％)。
[化合物9]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ1.95-2.33(complex,55h,oac),3.61(m,6h),3.73(m,1h),3.91-4.31(complex,12h),4.40(m,2h),4.61(d,j＝7.6hz,1h),4.65(d,j＝7.6hz,2h),4.73(d,j＝8.0hz,1h),4.82(d,j＝8.0hz,1h),4.85-4.98(complex,4h),5.01-5.21(complex,9h),5.41(d,j＝3.2hz,1h)；13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ20.8,20.9×3,21.1,21.2,21.5,29.4,29.8,61.6,61.7×2,61.9,62.4,62.5,67.3,67.5,67.9,68.1×2,68.2,68.3,71.6,71.8,71.9×2,71.1,72.2,72.3,72.8,73.0,74.8,77.4,78.3,81.7,82.8,92.2,95.6,98.9,99.5,100.1,101.5,125.4,128.3,129.1,137.9,168.9,169.4,169.5×2,169.9,170.0,170.1×2,170.3×2
(4)化合物11的合成
如方案8所示，在化合物11的合成中，将化合物(9)(343mg，0.371mmol)和化合物(3)(289mg，0.247mmol)溶解至1,4-二氧杂环乙烷(12ml)中，于室温下添加三丁基膦(185μl,0.741mmol)、1,1'-偶氮二(n,n’-二甲基甲酰胺)(tmad)(128mg,0.741mmol)，于60℃下搅拌18小时。通过tlc(甲苯/醋酸乙酯＝1/2，rf值＝0.6)确认反应结束后，用醋酸乙酯进行稀释，用水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水对有机层进行洗涤，用硫酸镁进行干燥。滤除硫酸镁，将减压浓缩得到的糖浆提供给硅胶柱色谱法，从洗出液(甲苯/醋酸乙酯＝1/1)中得到化合物10(240mg,47％)。
[化合物10]
1h-nmr(cdcl3,400mhz)δ0.50-1.05(complex,7h),1.19(d,3h,h-6ofrham),1.23(s,3h),1.35-2.30(complex,80h),3.59(m,1h),3.72(m,5h),3.92-4.11(complex,10h),4.21(dd,1h),4.31(dd,1h),4.42(m,3h),4.60(d,j＝7.6hz,1h),4.71-4.95(complex,9h),5.07(m,6h),5.19(t,1h),5.29(m,4h),5.59(d,j＝7.6hz,1h)；13c-nmr(cdcl3,100mhz)δ16.7,17.4,20.5,20.7×3,20.8,20.9×4,21.1×2,21.6,29.2,39.5,42.5,44.2,53.8,57.4,61.9,66.7,68.0,68.3,68.4,68.5,69.7,71.1,71.5,71.8,71.9,72.0,72.2,72.3,72.4,72.9,73.0,75.0,80.1,86.8,91.3,96.4,96.9,99.2,99.3,99.5,125.4,128.3,129.2,152.8,169.0,169.1,169.3,169.5×2,169.6,170.1×2,170.2×2,170.5,170.6,170.9,174.8
将化合物(10)(220mg,0.106mmol)溶解至甲醇(2.0ml)、thf(2.0ml)中，于室温下加入甲醇钠(0.5minmeoh)(0.2ml,0.106mmol)，于室温下搅拌48小时。通过tlc(三氯甲烷/甲醇/水＝5/4/1，rf值＝0.3)确认反应结束后，将减压浓缩得到的糖浆提供给凝胶过滤层析(gehealthcare,sephadexlh-20,乙醇)，用水进行冷冻干燥后，得到化合物11(135mg,quant.)
[化合物11]
1h-nmr(pyridine-d5,800mhz)δ0.68(m,1h),0.86(m,1h),0.97(m,1h),1.04(m,4h),1.28(m,1h),1.43(m,5h),1.63(s,3h),1.70(s,3h),1.93-2.20(complex,8h),2.40(d,1h),2.84(d,1h),3.64(m,1h),3.82(m,1h),3.94-4.15(complex,13h),4.17-4.35(complex,14h),4.45-4.59(complex,5h),4.88(m,2h),4.99(d,j＝7.2hz,1h),5.07(s,1h),5.14(d,j＝8.0hz,1h),5.32(d,j＝8.0hz,1h),5.65(s,1h),5.72(d,j＝8.0hz,1h),6.20(d,j＝8.0hz,1h),6.48(s,1h)；13c-nmr(pyridine-d5,200mhz)δ17.0,19.1,20.2,20.9,22.3,29.4,37.7,38.5,39.9,40.8,41.9,42.7,43.4,44.7,48.4,49.8,54.1,57.7,61.9,62.4,62.5,62.6,63.6,69.4,69.8×2,71.6,71.7,72.5,72.8,74.1,75.2,75.5,76.0,76.4,77.5,77.6,78.5×2,78.6×2,78.8×2,86.9,88.5,89.8,93.5,98.4,101.9,103.9,104.4,104.8,105.2,154.5,176.1
化合物11
[α]d＝-35.5°(c1.0,meoh)
maldi-tof-msm/zfound[m+na]+1297,c56h90o32calcdfor[m+na]+1297.
(iii)根据化学合成标准品的hplc-高分辨率ms/ms及ms3碎片化的保留时间和碎片化模式的一致性进行的结构确认
在和(i)相同的条件下，通过hplc-高分辨率ms/ms及ms3碎片化对化学合成品(化合物11)和甜菊叶萃取液进行了对比，结果于保留时间28.19分的谱峰，化学合成品和来自甜菊叶萃取液的谱峰一致(图6)。由此结果，确认了从植物体的萃取液中得到的新型甜菊醇糖苷和化合物11具有相同的结构。
[新型甜菊醇糖苷的生物合成]
在酵母菌中由甜菊醇生成了新型甜菊醇糖苷。首先培育了使来自甜菊的4种糖化酶基因ugt85c2、ugt91d2、ugt74g1、ugt76g1和来自拟南芥的udp-鼠李糖合成酶基因atrhm2同时表达的酵母菌。
本实施例中使用的分子生物学的方法，只要没有其他详述，依照了molecularcloning(sambrook等,coldspringharbourlaboratorypress,2001)中所记载的方法。
为了克隆来自甜菊的4种糖化酶基因，合成下述引物集，将由甜菊叶制备的cdna作为模板而进行pcr。
ugt85c2基因扩增用引物集
cacc-ndei-srugt85c2-fw(下划线部为ndei识别部位)：
5’-cacccatatggatgcaatggctacaactgagaa-3’(序列号12)
bglii-srugt85c2-rv(下划线部为bglii识别部位)：
5’-agatctctagtttcttgctagcacggtgattt-3’(序列号13)
ugt91d2基因扩增用引物集
srugt91d2-pet15b-fw
5’-tgccgcgcggcagccatatgtacaacgttacttatcatc-3’(序列号35)
srugt91d2-pet15b-rv
5’-gttagcagccggatccttaactctcatgatcgatggcaa-3’(序列号36)
ugt74g1基因扩增用引物集
cacc-ndei-srugt74g1-fw(下划线部为ndei识别部位)：
5’-cacccatatggcggaacaacaaaagatcaagaaat-3’(序列号14)
bamhi-srugt74g1-rv(下划线部为bamhi识别部位)：
5’-ggatccttaagccttaattagctcacttacaaatt-3’(序列号15)
ugt76g1基因扩增用引物集
cacc-ndei-srugt76g1-fw(下划线部为ndei识别部位)：
5’-cacccatatggaaaataaaacggagacca-3’(序列号16)
bamhi-srugt76g1-rv(下划线部为bamhi识别部位)：
5’-ggatccttacaacgatgaaatgtaagaaacta-3’(序列号17)
关于甜菊叶cdna是利用rneasyplantmini试剂盒(qiagen)从甜菊叶中提出总rna，通过对其中的0.5μg用randomoligo-dt引物进行反转录(rt)反应而获得。
pcr反应液(50μl)由来自甜菊叶的cdna1μl、1×kodplusbuffer(toyobo)、0.2mmdntps、引物各0.4pmol/μl、1mmmgso4、1u耐热性kodpluspolymerase构成。pcr反应于95℃下反应5分钟后，对94℃下0.5分钟、50℃下0.5分钟、68℃下2分钟的反应进行了总计30个循环的扩增。用0.8％琼脂糖凝胶对各pcr产物进行电泳、溴化乙锭染色，结果得到了由各自的模板dna推测的约1.4kb大小的扩增条带。
此pcr产物用制造商所推荐的方法亚克隆到了pentr-topodirectional载体(invitrogen)。利用dnasequencermodel3100(appliedbiosystems)，根据合成寡核苷酸引物的引物步移法确定序列，确认了作为目标的ugt基因，即ugt85c2、ugt91d2、ugt74g1、ugt76g1的全部ugt基因完成了克隆。
酵母菌用表达载体的构建
为了将上述ugt基因及来自拟南芥的udp-鼠李糖合成酶基因atrhm2(jbiolchem2007okaet.al)编入酵母菌表达载体中设计了下述引物集。
srugt85c2集
bgl2-ugt85c2-f(下线部为bglii识别部位)：
5’-acagatctatggatgcaatggctacaactgaga-3’(序列号18)
sal-ugt85c2-r(下线部为sali识别部位)：
5’-tagtcgactagtttcttgctagcacggtgatttc-3’(序列号19)
srugt91d2集
noti-ugt91dil3-f(下线部为noti识别部位)：
5’-aagcggccgcatgtacaacgttacttatcatcaaaattcaaa-3’(序列号20)
pac-ugt91d1l3-r(下线部为paci识别部位)：
5’-cgttaattaactctcatgatcgatggcaacc-3’(序列号21)
srugt74g1集
not-ugt74g1-f(下线部为noti识别部位)：
5’-aagcggccgcatggcggaacaacaaaagatcaag-3’(序列号22)
pac-ugt74g1-r(下线部为paci识别部位)：
5’-cgttaattaagccttaattagctcacttacaaattcg-3’(序列号23)
srugt76g1集
bam-ugt76g1-f(下线部为bamhi识别部位)：
5’-aaggatccatggaaaataaaacggagaccaccg-3’(序列号24)
sal-ugt76g1-r(下线部为sali识别部位)：
5’-gcgtcgacttacaacgatgaaatgtaagaaactagagactctaa-3’(序列号25)
atrhm2集
bam-atrhm2-f(下线部为bamhi识别部位)：
5’-ggatccatggatgatactacgtataagccaaag-3’(序列号26)
xho-atrhm2-r(下线部为xhoi识别部位)：
5’-ctcgagttaggttctcttgtttggttcaaaga-3’(序列号27)
通过将ugt85c2作为模板与srugt85c2集、将ugt91d2作为模板与srugt91d2集、将ugt74g1作为模板与srugt74g1集、将ugt76g1作为模板与srugt76g1集、将atahm2作为模板与atahm2集、组成模板与引物的组合，利用耐热性koddna聚合酶(东洋纺)，通过pcr扩增，在各自的orf的两端附加了限制酶部位。利用zeroblunttopopcrcloningkit(invitrogen)对得到的dna片段进行亚克隆，利用dnasequencermodel3100(appliedbiosystems)，根据合成寡核苷酸引物的引物步移法确定序列，确认了作为目标的ugt基因分别被克隆。
为了使上述基因在酵母菌中表达，利用pesc酵母菌表达系统(stratagene)构建了以下表达载体。
(1)质粒pesc-ura-ugt56的构建
以限制酶bglii和限制酶sali将ugt85c2切出，与以限制酶bamhi和限制酶sali将载体pesc-ura(stratagene)切断的产物进行连接，得到质粒pesc-ura-ugt-5。将以限制酶noti和限制酶paci对ugt91d2进行切断的产物和以限制酶noti和限制酶paci将该质粒pesc-ura-ugt-5切断的产物连接，得到pesc-ura-ugt56。
(2)质粒pesc-his-ugt78的构建
以限制酶bamhi和限制酶sali将ugt76g1切出，与以相同限制酶将载体pesc-his(stratagene)切断的产物进行连接，得到质粒pesc-his-ugt-8。将以限制酶noti和限制酶paci对ugt74g1进行切断的产物和以限制酶noti和限制酶paci将该质粒pesc-his-ugt-8切断的产物连接，得到pesc-his-ugt78。
(3)质粒pesc-trp-atrhm2的构建
以限制酶bamhi和限制酶xhoi将atahm2切出，与以相同限制酶将载体pesc-trp(stratagene)切断的产物进行连接，得到质粒pesc-trp-atahm2。
酵母菌的转化
将saccharomycescerevisiaeyph499株(ura3-52lys2-801amberade2-101ochretrp1-δ63his3-δ200leu2-δ1a)作为宿主，用醋酸锂法，导入了表2的质粒。作为转化株，选择了在sc-trp&ura&his琼脂培养基(每1l中，yeastnitrogenbaasewithoutaminoacids6.7g、葡萄糖20g、氨基酸混合粉-trp&ura&his1.3g、bactoagar20g)中生长的酵母菌。
[表2]
表2
另外氨基酸混合粉-trp&ura&his是将腺嘌呤硫酸盐2.5g、l-精氨酸盐酸盐1.2g、l-天冬氨酸6.0g、l-乙酰谷氨酸6.0g、l-亮氨酸3.6g、l-赖氨酸1.8g、l-蛋氨酸1.2g、l-苯丙氨酸3.0g、l-丝氨酸22.5g、l-苏氨酸12g、l-酪氨酸1.8g、l-缬氨酸9.0g混合调制而成。
导入基因的表达诱导与表达分析
将得到的转化株以下述方式培养。
首先，作为预培养在sc-trp&ura&his液体培养基(去除sc-trp&ura&his琼脂培养基的bactoagar)10ml中，分别接种各转化株，于30℃下震动培养1天。接下来，作为正式培养，将预培养液的1ml接种到10ml的sc-trp&ura&his液体培养基(每1l中，yeastnitrogenbaasewithoutaminoacids6.7g、半乳糖20g、氨基酸混合粉-trp&ura&his1.3g)，于30℃下震动培养2天。
为了确认导入转化株的基因是否进行了表达，从培养液中收集菌体，用rneasyminikit，提取总rna。
取总rna1μg，以superscriptii逆转录酶(thermofisherscientific)、随机六聚体作为引物，合成了cdna。
为了确认导入基因的表达，制作了以下引物。
ugt85c2表达确认用
ugt85c2-r1：
5’-caagtccccaaccaaattccgt-3’(序列号28)
ugt91d2表达确认用
ugt91d1l3-r1：
5’-cacgaacccgtctggcaactc-3’(序列号29)
ugt74g1表达确认用
ugt74g1-r1：
5’-cccgtgtgatttcttccacttgttc-3’(序列号30)
ugt76g1表达确认用
ugt76g1-r1：
5’-caagaacccatctggcaacgg-3’(序列号31)
atahm2表达确认用
atahm2-r1
5’-gctttgtcaccagaatcaccatt-3’(序列号32)
gal10p区域(启动子区域)
pgal10-f3：
5’-gattattaaacttctttgcgtccatcca-3’(序列号33)
gal1p区域(启动子区域)
pgal1-f3：
5’-cctctatactttaacgtcaaggagaaaaaacc-3’(序列号34)
各导入基因的表达通过以下引物的组合，将之前合成的cdna作为模板，利用extaq(takarabio)实施了pcr，通过对该产物进行琼脂糖凝胶电泳进行了确认。
ugt85c2：ugt85c2-r1(序列号28)与pgal1-f3(序列号34)
ugt91d2或ugt91d2l3：ugt91d1l3-r1(序列号29)与pgal10-f3(序列号33)
ugt74g1：ugt74g1-r1(序列号30)与pgal1-f3(序列号34)
ugt76g1：ugt76g1-r1(序列号31)与pgal10-f3(序列号33)
atahm2：atahm2-r1(序列号32)与pgal10-f3(序列号33)
由此，确认了导入的基因在转化株中进行了表达。
新型甜菊醇糖苷的生成
向在正式培养用的液体培养基中，添加每1ml培养基0.5μg或2μg的甜菊醇(chromadexinc.)之外，在与上述实验里相同的条件下进行了培养。培养结束后，通过将培养液离心分离，分离成上清液和菌体。用乙腈对培养上清液进行洗涤后，提供给用水平衡后的sep-pakc18层析柱，用20％乙腈进行洗净后，用80％乙腈进行洗脱，干燥固化后，溶解至少量的80％乙腈中调制成糖苷样本。将该糖苷样本提供给以下的分析。
根据lc-ms的分析
关于根据lc-ms的分析，如关于“新型甜菊醇糖苷的分离”的实施例中所记载的那样进行了分析。
结果如图7所示。在a-5678株中确认了新型甜菊醇糖苷的生成。该结果和上述化学合成中得到的甜菊醇糖苷一致。
新型甜菊醇糖苷的甜度评估
为了评估新型甜菊醇糖苷的甜度，在纯水中添加蔗糖，调制了使brix为从0.5到3间隔0.5的样本。向纯水中添加新型甜菊醇糖苷使其成为415pppm制成样本。
通过选择和添加了新型甜菊醇糖苷的样本拥有同等的甜味强度的蔗糖样本进行评估，接受了甜味剂的感官训练的人员(5名)作为专题小组成员进行了感官评估。其结果明确了添加了新型糖苷的调制样本和brix1的蔗糖样本拥有同等的甜味。因此，明确了本新型甜菊醇糖苷相对于蔗糖拥有24的甜度。
新型甜菊醇糖苷的感官评估
为了评估新型甜菊醇糖苷的味道，向纯水中以图8所示的添加量添加reb.a及新型甜菊醇糖苷，调制了饮料样本。饮料样本，以reb.a：300、新型糖苷：24，将甜度全部调整为蔗糖换算的brix最终为2。
对于得到的饮料样本，以甜味的开端、苦味及甜味的余味的程度为指标进行了官能评估。接受了甜味剂的感官训练的人员(5名)作为专题小组成员进行评估，评估标准如下所示。非常弱(-3)、弱(-2)、稍弱(-1)、一般(0)、稍强(+1)、强(+2)及非常强(+3)。
感官评估的结果，明确了新型甜菊醇糖苷和历来的甜味剂即reb.a相比具有同等的苦味和更短的甜味余味。
含有新型甜菊醇糖苷的改善余味的调味剂的评估
(1)余味改善对象的甜味剂的甜度测定
在对调味剂进行评估之前，测定了余味改善对象的甜味剂的甜度。作为甜味剂使用了reb.a(纯度100％)和reb.d(纯度97％)。将reb.a和reb.d分别溶解至下表所示量的水中制成水溶液。另外准备了用蔗糖(砂糖)制成的brix5～7的标准水溶液，接受了甜味剂的感官训练的人员(6名)作为专题小组成员进行评估，对reb.a水溶液和reb.d水溶液的甜度对应标准水溶液的哪个甜度进行了评估。结果如下所示。
[表3]
表3
由上述结果，以下的试验中以reb.a的甜度倍率为237倍、reb.d的甜度倍率为213倍进行了评估。另外，评估中使用的新型甜菊醇糖苷的甜味倍率如上所述为24倍。
(2)对于reb.a的余味改善效果的评估
使用brix5、7及11的3个水平的水溶液，对本发明的调味剂对于reb.a的余味改善效果进行了评估。首先，以reb.a的甜度为237倍，制成了brix5、7及11的3个水平的水溶液。由本发明的新型甜菊醇糖苷构成的调味剂的添加量以reb.a的添加质量为基准分别设置为1、3.5、5及10质量％的比例。对照样本(cont)仅添加了reb.a，未添加本发明的调味剂。接受了甜味剂的感官训练的人员(7名)作为专题小组成员进行评估，使cont为3分，余味改善的上限为6分，以数值进行了评估。当余味得到改善时，分数变高。得到的评分的平均值如图9的图表所示。
(3)对于reb.d的余味改善效果的评估
使用brix5、7及11的3个水平的水溶液，对本发明的调味剂对于reb.d的余味改善效果进行了评估。首先，以reb.d的甜度为213倍，制成了brix5、7及11的3个水平的水溶液。由本发明的新型甜菊醇糖苷构成的调味剂的添加量以reb.d的添加质量为基准分别设置为1、3.5、5及10质量％的比例。对照样本(cont)仅添加了reb.d，未添加本发明的调味剂。接受了甜味剂的感官训练的人员(7名)作为专题小组成员进行评估，使cont为3分，余味改善的上限为6分，以数值进行了评估。当余味得到改善时，分数变高。得到的评分的平均值如图10的图表所示。
含有新型甜菊醇糖苷的甜味增强调味剂的评估
用brix5及7的2个水平的水溶液，对本发明的调味剂的对于砂糖(蔗糖)的甜味增强效果进行了评估。首先，用砂糖制成brix5及7的2个水平的水溶液。由本发明的新型甜菊醇糖苷构成的调味剂的添加量以砂糖的添加质量为基准，在brix5的水平下设置为0.10、0.44及0.80质量％的比例，在brix7的水平下设置为0.10、0.44及0.57质量％的比例。接受了甜味剂的感官训练的人员(7名)成为专题小组成员进行评估，以甜味强度的倍率进行了评估。结果如图11的图表所示。图表上的纵轴(甜味强度)表示对于砂糖和调味剂的总甜度(调味剂的甜度以甜味倍率24算出)，实际专题小组成员感受的甜味强度的倍率。任意一种试样中都观察到了2～7％程度的甜味增强效果。
序列表
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