采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法与流程

本发明属于中药植物化学领域，具体涉及到一种采用高压制备液相提取纯化丹参酮IIA和二氢丹参酮I单体化合物的制备方法。

背景技术：

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)属唇形科植物，主产于河北、安徽、江苏、四川等地，始载于《神农本草经》，能够起到活血通络、凉血消痈、祛瘀止痛、清心除烦等作用。丹参的化学成分分为脂溶性和水溶性两部分，丹参酮(tanshinone,Tsn)是丹参中脂溶性松香烷型二萜类化合物，又称为总丹参酮，具有广泛的药理作用，受到医药学家的高度关注。脂溶性的丹参酮类化合物具有广泛的药理作用和临床应用。其化学结构特征是具备邻醌或对醌结构，且能够被还原为二酚类衍生物，氧化后又转化为醌，在此过程中起到传递电子的作用；且其体内代谢产物也能够影响机体的多种反应，因此具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量及抗菌、抗炎、神经保护等临床药理作用。

丹参类注射液在生产过程多采用传统的水提醇沉工艺，该制备工艺使得丹参中的脂溶性丹参酮类成分不能被提取而残留于固体药渣中，造成资源的浪费。随着世界人口老龄化的趋势，心血管疾病患者发病率上升，丹参药材的年消耗量呈逐年增长趋势。2012年，我国丹参类注射液市场规模达到近157亿元，2013年全年近190亿元，占据整个中药注射液市场35％以上的份额。然而，丹参类注射液制备生产过程中产生大量的丹参固体废弃物，导致丹参资源性物质利用效率低下，同时造成中药资源的严重浪费和环境污染。因此，丹参药渣中资源性物质的高效利用已成为必然的发展趋势。

丹参酮类成分具有抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量及抗菌、抗氧化、抗炎等多种生物活性和应用价值，尤其是在抗肿瘤活性方面尤为突出。丹参酮IIA具有改善冠状动脉血循环、血管内皮细胞修复、抗动脉粥样硬化(AS)形成、抗心肌肥厚以及防治糖尿病并发症等作用；二氢丹参酮Ⅰ具有显著抑制乙酰胆碱酯酶作用、通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和分化来发挥抗肿瘤作用以及显著的抗菌活性等。

目前纯化丹参酮类化合物的方法主要有醇提水沉、大孔树脂纯化、CO₂超临界萃取、氯仿萃取等，采用中低压制备色谱方法分离提纯丹参脂溶性成分，可大大地缩短分离时间，在不影响分离度的前提下，却可以分离得到更大量的化合物，极大地提高了分离制备效率。

本发明涉及丹参酮类单体化合物，包含丹参酮IIA和二氢丹参酮I，其化学结构式如下：

随着人们对丹参酮ⅡA、二氢丹参酮Ⅰ和隐丹参酮等丹参酮类化合物的生物活性及开发应用研究的深入，对上述丹参酮类单体化合物的纯化制备具有重大科学意义和应用价值。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的是充分利用丹参注射液提取后的药渣，提供一种采用高压制备液相提取纯化丹参酮IIA和二氢丹参酮I单体化合物的制备方法。

技术方案：为了达到以上技术效果，本发明的技术方案如下：

一种采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，包括以下步骤：

步骤A：提取：将丹参药渣粉碎后过筛得到丹参药渣粉末，加入乙醇溶液，进行回流提取2～3次，每次1～2小时，合并提取液并浓缩得到丹参醇提物浸膏；

步骤B：萃取除杂：取步骤A制备得到的丹参醇提物浸膏，加纯水溶解，分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取，反复萃取三次，合并乙酸乙酯部位提取液，减压浓缩，得乙酸乙酯部位浓缩液；

步骤C：中压制备液相纯化：称取步骤B制备得到的乙酸乙酯部位浓缩液加入硅胶搅拌均匀，然后装入中压进样器中，选择石油醚和乙酸乙酯为流动相，设置流动相流速为15～20mL/min，进行中压制备液相纯化；

步骤D：采用UPLC分析步骤C的中压制备液相洗脱物，然后合并丹参酮IIA和二氢丹参酮I部位：

步骤E：高压制备液相纯化：取步骤D合并的丹参酮IIA和二氢丹参酮I部位，浓缩，加入甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤后进高压制备液相纯化，选择甲醇和超纯水为流动相，梯度洗脱，经高压制备液相纯化得丹参酮IIA和二氢丹参酮I。

作为优选方案，以上所述的采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，其特征在于，步骤A加入8-12倍量70-90％体积浓度的乙醇。

作为优选方案，以上所述的采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，其特征在于，步骤A加入8倍量90％体积浓度的乙醇，进行回流提取2次，每次2小时，

作为优选方案，以上所述的采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，步骤C中压制备液相中梯度洗脱程序为：流动相为A相为石油醚-B相为乙酸乙酯，梯度洗脱：0～5min，95％A；5～12.4min，95％～28％A；12.4～15.3min，0％。

作为优选方案，以上所述的采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，步骤D中的UPLC的色谱条件为ACQU-ITY UPLC^RBEH C₁₈色谱柱；柱温30℃；流速0.4mL/min；进样量2μL，流动相:A相为乙腈，B相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱：0～1min，70％A，1～6min，70％～80％A，6～10min，100％A。

作为优选方案，以上所述的采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，步骤E高压制备液相的液相条件：Waters Xbridge OBD C₁₈色谱柱，19mm×150mm，5μm，流动相为A相为甲醇-B相为水，梯度洗脱：0～5min，75％A；5～15min，75％～80％A；15～35min，90％A；35～45min，100％A，检测波长285nm；柱温为室温；流速15mL/min；进样量500μL；质谱条件：ESI离子源，扫描方式为正离子模式；锥孔电压：50V，毛细管电压：3kV，母离子碰撞能量：4V，碎片离子碰撞能量：20-50V；离子源温度：105℃，脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：700L/h，锥孔气流量：50L/h；质量扫描范围：350-600Da，扫描时间：0.3s。

作为优选方案，以上所述的采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，步骤A所述的丹参药渣为丹参类注射液在生产过程中，采用水提提取后的药渣。

有益效果：本发明提供的采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，通过大量实验筛选最佳的纯化步骤，工艺设计合理，尤其是采用中压制备液相和高压制备液相联用，能从丹参药渣中分离纯化得到纯度高的丹参药渣得率高，可充分利用废弃资源，变废为宝，取得了非常好的技术效果。

附图说明

图1为丹参酮高压制备色谱图。

图2为高压制备液相纯化得到的二氢丹参酮Ⅰ的UPLC的色谱图。

图3为高压制备液相纯化得到的丹参酮ⅡA的UPLC色谱图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来详细说明本发明的技术方案，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明的技术方案，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，包括以下步骤：

步骤A：将丹参水提取后药渣，干燥，粉碎后过筛得到丹参粉末，加入8倍量70体积浓度的乙醇溶液，进行回流提取2次，每次2小时，合并提取液并浓缩得到丹参醇提物浸膏。

步骤B:取100g丹参醇提物浸膏，加1000mL纯水溶解，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，反复萃取三次，合并乙酸乙酯部位提取液，减压浓缩，得乙酸乙酯部位浓缩液。

步骤C：称取待分离的乙酸乙酯部位浓缩液加入一倍量的硅胶于研钵中，进行研磨。将样品装入中压进样器中，使其慢慢加入保持样品平面的水平和平整。按照中压制备色谱仪的组装要求将层析柱组装。选择流动相为石油醚和乙酸乙酯。设置流动相流速为20mL/min，梯度洗脱：0～5min，95％A；5～12.4min，95％～28％A；12.4～15.3min，0％。将流动相和收集容器固定于收集架上。准备工作完成之后，点击润柱程序。润柱完成之后，点击层析程序，并用棕色瓶对洗脱液进行收集经洗脱，共收集洗脱液45瓶，每50mL瓶。

步骤D：UPLC分析、分段合并。UPLC的色谱条件为ACQU-ITY UPLC^RBEH C₁₈(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱；柱温30℃；流速0.4mL/min；进样量2μL，流动相:乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～1min，70％A，1～6min，70％～80％A，6～10min，100％A)。UPLC分析后，主要分为六段，合并洗脱液，浓缩。并对5号收集液进行高压制备纯化。对中压制备洗脱液浓缩，减压回收溶剂，适量70％甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤后进高压制备液相。

步骤E：高压制备色谱条件：液相条件：Waters Xbridge OBD C₁₈色谱柱(19mm×150mm，5μm)，流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～5min，75％A；5～15min，75％～80％A；15～35min，90％A；35～45min，100％A；)。检测波长285nm；柱温为室温；流速15mL/min；进样量500μL。质谱条件：ESI离子源，扫描方式为正离子模式；锥孔电压：50V，毛细管电压：3kV，母离子碰撞能量：4V，碎片离子碰撞能量：20-50V；离子源温度：105℃，脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：700L/h，锥孔气流量：50L/h；质量扫描范围：350-600Da，扫描时间：0.3s。经洗脱，收集洗脱液。UPLC分析后，主要分为3段，合并洗脱液，浓缩，如图1所示。第一、三段分别为化合物二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA，含量均在90％以上，经重结晶即可得晶体。取适量晶体1和晶体3，进UPLC进行纯度检测。丹参酮ⅡA纯度为98.8％，如图2所示，二氢丹参酮Ⅰ纯度为98.2％如图3所示。

实施例2

采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，包括以下步骤：

步骤A：将丹参水提取后药渣，干燥，丹参粉碎后过筛得到丹参粉末，加入10倍量80％体积浓度的乙醇溶液，进行回流提取2次，每次2小时，合并提取液并浓缩得到丹参醇提物浸膏。

步骤B：取300g丹参药渣醇提取物浸膏，加3000mL纯水溶解，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，反复萃取3次，合并乙酸乙酯部位提取液，减压浓缩，得乙酸乙酯部位浓缩液。

步骤C：称取待分离的样品乙酸乙酯部位浓缩液加入一倍量的硅胶于研钵中，进行研磨。将样品装入中压进样器中，使其慢慢加入保持样品平面的水平和平整。按照中压制备色谱仪的组装要求将层析柱组装。选择流动相为石油醚和乙酸乙酯。设置流动相流速为20mL/min，梯度洗脱：0～5min，95％A；5～12.4min，95％～28％A；12.4～15.3min，0％。将流动相和收集容器固定于收集架上。准备工作完成之后，点击润柱程序。润柱完成之后，点击层析程序，并用棕色瓶对洗脱液进行收集经洗脱，共收集洗脱液90瓶，每50mL瓶。

步骤D：UPLC分析、分段合并，UPLC的色谱条件为ACQU-ITY UPLCRBEH C₁₈(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱；柱温30℃；流速0.4mL/min；进样量2μL，流动相:乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～1min，70％A，1～6min，70％～80％A，6～10min，100％A)。UPLC分析后，主要分为六段，合并洗脱液，浓缩。并对5号收集液进行高压制备纯化。对中压制备洗脱液浓缩，减压回收溶剂，适量70％甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤后进高压制备液相。

步骤E：高压制备色谱条件：液相条件：Waters Xbridge OBD C₁₈色谱柱(19mm×150mm，5μm)，流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～5min，75％A；5～15min，75％～80％A；15～35min，90％A；35～45min，100％A；)。检测波长285nm；柱温为室温；流速15mL/min；进样量500μL。质谱条件：ESI离子源，扫描方式为正离子模式；锥孔电压：50V，毛细管电压：3kV，母离子碰撞能量：4V，碎片离子碰撞能量：20-50V；离子源温度：105℃，脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：700L/h，锥孔气流量：50L/h；质量扫描范围：350-600Da，扫描时间：0.3s。经洗脱，收集洗脱液。UPLC分析后，主要分为3段，合并洗脱液，浓缩。第一、三段分别为化合物二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA，含量均在90％以上，经重结晶即可得晶体。取适量晶体1和晶体3，进UPLC进行纯度检测。丹参酮ⅡA纯度为98.9％，二氢丹参酮Ⅰ纯度为98.8％。

实施例3

采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，包括以下步骤：

步骤A：将丹参水提取后药渣，干燥，丹参粉碎后过筛得到丹参粉末，加入12倍量90％体积浓度的乙醇溶液，进行回流提取2次，每次2小时，合并提取液并浓缩得到丹参醇提物浸膏。

步骤B：取200g丹参药渣醇提取物浸膏，加2000mL纯水溶解，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，反复萃取三次，合并乙酸乙酯部位提取液，减压浓缩，得乙酸乙酯部位浓缩液。

步骤C：称取待分离的样品乙酸乙酯部位浓缩液加入一倍量的硅胶于研钵中，进行研磨。将样品装入中压进样器中，使其慢慢加入保持样品平面的水平和平整。按照中压制备色谱仪的组装要求将层析柱组装。选择流动相为石油醚和乙酸乙酯。设置流动相流速为20mL/min，石油醚与乙酸乙酯的比例及色谱图见附录。将流动相和收集容器固定于收集架上。准备工作完成之后，点击润柱程序。润柱完成之后，点击层析程序，并用棕色瓶对洗脱液进行收集经洗脱，共收集洗脱液45瓶，每50mL瓶。

步骤D：UPLC分析分段合并，UPLC的色谱条件为ACQU-ITY UPLCRBEH C₁₈(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱；柱温30℃；流速0.4mL/min；进样量2μL，流动相:乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～1min，70％A，1～6min，70％～80％A，6～10min，100％A)。UPLC分析后，主要分为六段，合并洗脱液，浓缩。并对5号收集液进行高压制备纯化。对中压制备洗脱液浓缩，减压回收溶剂，适量70％甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤后进高压制备液相。

步骤E：高压制备色谱条件：液相条件：Waters Xbridge OBD C₁₈色谱柱(19mm×150mm，5μm)，流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～5min，75％A；5～15min，75％～80％A；15～35min，90％A；35～45min，100％A；)。检测波长285nm；柱温为室温；流速15mL/min；进样量500μL。质谱条件：ESI离子源，扫描方式为正离子模式；锥孔电压：50V，毛细管电压：3kV，母离子碰撞能量：4V，碎片离子碰撞能量：20-50V；离子源温度：105℃，脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：700L/h，锥孔气流量：50L/h；质量扫描范围：350-600Da，扫描时间：0.3s。经洗脱，收集洗脱液。UPLC分析后，主要分为3段，合并洗脱液，浓缩。第一、三段分别为化合物二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA，含量均在90％以上，经重结晶即可得晶体。取适量晶体1和晶体3，进UPLC进行纯度检测，丹参酮ⅡA纯度为98.6％，二氢丹参酮Ⅰ纯度为98.1％。