一株高效降解2‑羟基吡啶的球形节杆菌菌株HCH‑1及其菌剂制备方法与应用与流程

本发明属于微生物降解吡啶类化合物技术领域，具体涉及一株高效降解2-羟基吡啶的球形节杆菌菌株HCH-1及其菌剂的制备方法与应用。

背景技术：

吡啶类化合物是一种环境中常见的氮杂环污染物，广泛存在于农药、除草剂、杀虫剂和石油类产品中。这类化合物具有潜在的致癌作用，且氮杂环降解难度较大，降解周期长，降解效果差，会对生态系统和人类健康有长期、潜在的影响。

去除环境中吡啶类化合物的方法主要有：物理法、化学法和生物法。其中物理法适用于浓度较高，污染物较为集中的吡啶污染，但是物理法只是将污染物转移，并不能将污染物完全去除，且应用范围较窄；化学法是利用化学手段将环境中污染物转化成其他无毒或者毒害较小的物质，但是化学法处理成本较高，且容易产生二次污染；生物法是利用环境中存在的能够降解吡啶类化合物的微生物，通过富集筛选培养后得到能够以吡啶类化合物为唯一碳源生长的菌株，在实验室条件下进行培养后投加到污染区域，可以实现快速的去除环境中的吡啶类物质，该处理方法具有条件温和、处理成本较低、效果好且不会产生二次污染等优点，已经成为处理各类污染物的研究热点。

应用生物法处理环境中的吡啶类化合物的关键是高效吡啶降解菌株的筛选。微生物在好氧和厌氧条件下都可以降解吡啶类化合物。目前已经筛选到一些吡啶类降解菌株，如降解吡啶的Nocardia sp.、Rhodococcus opacus、Pseudomonas sp.和FlavobacteriumCN3d等，降解2-羟基吡啶和3-羟基吡啶的Achromobacter sp.等。但是这些吡啶类降解菌株在实际应用中面临的问题有：1.大多数吡啶降解菌株对吡啶类化合物的耐受浓度较低（小于1 mg/mL），降解效率在60%左右；2.生长的延迟较长，而且随着底物浓度的提高所需要的延迟期越长，处理周期长；3.已报到的降解2-羟基吡啶的菌株A. crystallopoietes，A. pyridinolis和A. viridescens需要2-羟基吡啶的诱导相关基因才能表达，在实际应用中受到很大的限制。

因此，从环境中筛选降解效率高、耐受底物能力强、适应条件较广、性状稳定的吡啶类降解菌株，对于环境中吡啶类化合物的去除有重要的研究意义。同时将高效降解菌株制备成高浓度菌剂对于缩短处理时间，提高降解效率有重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供了一株高效降解2-羟基吡啶的球形节杆菌菌株HCH-1及其菌剂制备方法与应用。本发明将该菌株HCH-1制备成菌剂应用于环境中2-羟基吡啶污染物的去除。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一株高效降解2-羟基吡啶的球形节杆菌菌株HCH-1，其分类命名为球形节杆菌Arthrobacter globiformils，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC M 2017023。

本发明还提供了所述球形节杆菌菌株HCH-1在降解2-羟基吡啶中的应用。

进一步的，所述菌株HCH-1生长温度为18~42℃，pH为5~9。

进一步的，所述菌株HCH-1降解2-羟基吡啶的浓度为1 mg/mL~8 mg/mL。

本发明还提供了含有所述的高效降解2-羟基吡啶的球形节杆菌菌株HCH-1的菌剂。

进一步的，该菌剂是通过以下方法获得的：将菌株HCH-1接种于LB液体培养基中，在25~30℃条件下振荡培养48~60 h；收集培养的菌液加入终浓度为3%~6%的甘油作为保护剂，-20℃预冷后置于真空冷冻干燥机中冻干成粉末，即为固体菌剂。

本发明还提供了所述的球形节杆菌菌株HCH-1菌剂在降解2-羟基吡啶中的应用。

进一步的，所述菌剂的适应温度为18~42℃，pH为5~9。

进一步的，所述菌剂降解2-羟基吡啶的浓度为1 mg/mL~8 mg/mL。

本发明的优点和有益效果是：本发明所述的球形节杆菌（Arthrobacter globiformils）HCH-1是从辽河口湿地中筛选并经过富集、分离和纯化得到的高效2-羟基吡啶降解菌株，具有性状稳定、培养简单、适用条件较广、能够耐受高浓度的底物和高降解效率等优点。本发明的球形节杆菌（Arthrobacter globiformils）HCH-1能够利用2-羟基吡啶为唯一碳源和能源，不需要诱导，且性能稳定，该菌株可以在LB固体/液体培养基中生长，也可以在2-羟基吡啶浓度从1 mg/mL~8 mg/mL的基础无机盐液体培养基中生长，生长温度为18~42℃，pH为5~9，最适生长温度为30℃，最适pH为7。

本发明利用微生物的降解去除环境中2-羟基吡啶污染物，具有处理条件温和，效率高且不会产生二次污染等优点。

本发明所述的菌株，特异性强，只能降解2-羟基吡啶，不能降解4-羟基吡啶、3-羟基吡啶、2,5-二羟基吡啶、烟酸、2-氨基吡啶、2-甲基吡啶、2-乙基吡啶、吡啶等底物，可用于专一性去除环境中的2-羟基吡啶污染物。

本发明所述的菌株虽然能够降解高浓度的2-羟基吡啶，但是随着2-羟基吡啶浓度的提高，适应时间相应的延长。因此本发明将该菌株制备成菌剂，能够实现在较短时间内快速去除高浓度2-羟基吡啶的效果。本发明所述的菌剂具有活菌数高，菌剂中菌种适应能力强，菌株性能稳定，制备方法简单，成本低等特点，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明分离得到的球形节杆菌菌株 HCH-1在LB固体培养基上的菌落照片。

图2为本发明分离得到的球形节杆菌菌株 HCH-1的扫描电子显微镜照片。

图3为菌株的进化树。

图4为不同浓度下球形节杆菌菌株HCH-1的生长曲线。

图5为不同浓度下球形节杆菌菌株HCH-1的降解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述，但是引用实施例仅用于说明本发明，本发明所保护范围不限于此。

实施例1：球形节杆菌Arthrobacter globiformils HCH-1的分离和纯化

将来源于辽河口石油污染土壤样品约5 g加入到50 mL含有1 mg/mL 2-羟基吡啶的富集培养基中，30℃ 170 rpm恒温振荡培养箱中培养5天后，取5 mL富集培养液接种到新鲜含有2-羟基吡啶的富集培养基中，重复该过程4-5次，将最终得到的富集培养液涂布到LB固体培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养48小时，选取不同形态特征的单菌落接种于含有1 mg/mL的2-羟基吡啶的筛选培养基中，进行验证，选取在2-羟基吡啶筛选培养基中生长较好的菌株，其中一株定名为HCH-1，将其保藏于甘油管和LB固体斜面培养基中。

实施例2：球形节杆菌Arthrobacter globiformils HCH-1的鉴定

1、菌株的形态学及生理生化特征

菌株HCH-1在LB固体平板上的菌落形态如图1所示为白色、半透明、表面湿润、边缘整齐，在以2-羟基吡啶-MSN培养基中培养时，培养基颜色由无色透明先是变成蓝紫色后变成棕黄色，通过对不同时期菌株进行鉴定后发现菌株位于对数期时培养基为蓝紫色，当进入稳定期后培养基变为棕黄色。分别取不同生长阶段（对数期和稳定期）的菌株进行革兰氏染色均呈阳性，在光学显微镜下观察形态均呈球形，扫描电镜结果显示菌株为短杆状，如图2所示，长约为0.5-0.7 μm，直径约为0.4-0.6 μm，呈圆柱形且末端有辐射状花纹。

2、菌株的16S rDNA鉴定：

用基因组提取试剂盒提取菌株HCH-1的基因组，以其为模板，以16S rDNA通用引物27F（5^,-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3^,）和1492R（5^,-ACG GAT ACC TTG TTA CGA CTT -3^,）引物进行扩增16S rDNA序列。

PCR反应体系为：2×pfu PCR mix 12.5微升，上游引物27F 1微升，下游引物1492R 1微升，基因组模板0.5微升，超纯水10微升。PCR程序为：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸10 min，4℃保温。1.5%琼脂糖凝胶电泳结果表明PCR产物条带单一大小约为1.5 kb，经纯化后送至上海生工测序公司测序，测序结果见序列表SEQ ID No:1的核苷酸序列，将测序结果递交到NCBI上进行BLAST序列比对，发现该菌株与节杆菌的序列相似性为99%，如图3所示，因此判断该菌株为节杆菌属。

本发明将筛选到的节杆菌菌株HCH-1进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2017年1月11日，球形节杆菌HCH-1（Arthrobacter globiformis HCH-1）的保藏编号为 CCTCC NO：M 2017023。

实施例3：球形节杆菌Arthrobacter globiformils HCH-1对无机盐培养液中不同浓度2-羟基吡啶的降解

所述菌株HCH-1在降解2-羟基吡啶中的应用时，生长温度为18~42℃，pH为5~9，优选最适生长温度为30℃，最适pH为7。因此本实施例选取温度为30℃、pH为7进行试验。

将所述球形节杆菌菌株HCH-1接种到LB液体培养基中活化48 h作为种子，按照1%的接种量接种到2-羟基吡啶浓度分别为1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL的无机盐培养基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒温震荡摇床中培养，每隔2小时取样，测定菌体生长的OD_600nm的吸收值和2-羟基吡啶的浓度，并计算降解效率。

该菌株在不同初始浓度2-羟基吡啶下的生长曲线和降解曲线参见图4和图5。

实验结果表明，菌株对2-羟基吡啶浓度为1 -8 mg/mL的无机盐培养基中的2-羟基吡啶均具有较强的降解能力，对初始浓度为1 mg/mL的2-羟基吡啶在16小时的降解效率接近100%，初始浓度为2-4 mg/mL的2-羟基吡啶的降解率为94%以上，分别需要42小时和84小时，初始浓度为8 mg/mL的2-羟基吡啶120小时的降解率为89%。同时可以看出，随着底物浓度的提高菌株的适应时间不断延长，因此考虑将菌株制备成粉末状菌剂，一方面便于运输和使用，另一方面可以在短时间内迅速提高菌体浓度，缩短处理时间，提高降解效率。

2-羟基吡啶的检测方法如下：

1）液相色谱检测法：

利用安捷伦高效液相色谱仪（HPLC）监测2-羟基吡啶的浓度变化。色谱柱为：5 mm×4.6 mm×250 mm的Agilent Eclipse XDB-C18反相柱，流动相为：10% 甲醇和90% 1 mM H₂SO₄，进样量为2 μL，柱温 30℃，流速为1 mL/min，检测器为 DAD 检测器，检测波长范围为 200 nm-400 nm。样品处理方法：样品中加入2倍体积甲醇，4℃静置10 min，10 000 r/min离心2 min，取上清液利用 0.22 μm滤膜过滤后上机检测。

2）紫外分光光度计检测法：

根据HPLC检测结果发现2-羟基吡啶在220 nm和290 nm处有特征吸收峰，因此可用紫外可见光扫描200 nm - 400 nm 范围内的吸光值表征2-羟基吡啶浓度变化，研究菌株Arthrobacterglobiformils HCH-1 对2-羟基吡啶的降解情况。

实施例4：菌株HCH-1的固体菌剂的制备

所述球形节杆菌菌株HCH-1的菌剂的制备方法包括以下步骤：将纯化后的菌株HCH-1按照1%的接种量接种到LB液体培养基中，在30℃170 rpm恒温振荡摇床中培养48 h后，5000 r/min离心10min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次后，加入终浓度为3%~6%的甘油作为保护剂，将菌体重悬后置于-20℃冰箱中冷冻至少30 min，预冷后置于真空冷冻干燥机中干燥后得固体粉末状菌剂，每1L上述培养物可获得约100-900 mg固体菌剂，菌剂中有效活菌数≧1×10⁹ cfu/g。

实施例5：高密度菌剂应用效果实验

称取实施例4中制备的固体菌剂1 g投加到含有4 mg/mL的2-羟基吡啶无机盐培养基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒温震荡摇床中培养，每隔6小时取样，测定培养基中2-羟基吡啶的降解情况。在降解12 h时，几乎检测不到培养基中的2-羟基吡啶，降解效率达到100%。

实施例6：高密度菌剂应用效果实验

称取实施例4中制备的固体菌剂1 g投加到含有6 mg/mL的2-羟基吡啶无机盐培养基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒温震荡摇床中培养，每隔6小时取样，测定培养基中2-羟基吡啶的降解情况。在降解18 h时，几乎检测不到培养基中的2-羟基吡啶，降解效率达到100%。

实施例7：高密度菌剂应用效果实验

称取实施例4中制备的固体菌剂1 g投加到含有8 mg/mL的2-羟基吡啶无机盐培养基（50 mL）中，置于30℃170 rpm的恒温震荡摇床中培养，每隔6小时取样，测定培养基中2-羟基吡啶的降解情况。在降解36 h时，几乎检测不到培养基中的2-羟基吡啶，降解效率达到100%。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国海洋大学

<120> 一株高效降解2-羟基吡啶的球形节杆菌菌株HCH-1及其菌剂制备方法与应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1394

<212> DNA

<213> 球形节杆菌

<400> 1

tgcagtcgaa cgatgatccg gtgcttgcac cggggattag tggcgaacgg gtgagtaaca 60

cgtgagtaac ctgcccttga ctctgggata agcctgggaa actgggtcta ataccggata 120

tgactcctca tcgcatggtg gggggtggaa agcttttgcg gttttggatg gactcgcggc 180

ctatcagctt gttggtgagg taatggctta ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga 240

gggtgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct 360

tcgggttgta aacctctttc agtagggaag aagcgaaagt gacggtacct gcagaagaag 420

cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg ttatccggaa 480

ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtct gccgtgaaag tccggggctc 540

aactccggat ctgcggtggg tacgggcaga ctagagtgat gtaggggaga ctggaattcc 600

tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc gatggcgaag gcaggtctct 660

gggcattaac tgacgctgag gagcgaaagc atggggagcg aacaggatta gataccctgg 720

tagtccatgc cgtaaacgtt gggcactagg tgtgggggac attccacgtt ttccgcgccg 780

tagctaacgc attaagtgcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga 840

attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa 900

ccttaccaag gcttgacatg gaccggatcg ccgcagaaat gtggtttctc cttttggggc 960

cggttcacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020

cgcaacgagc gcaaccctcg ttccatgttg ccagcacgtg atggtgggga ctcatgggag 1080

actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gacgacgtca aatcatcatg ccccttatgt 1140

cttgggcttc acgcatgcta caatggccgg tacaaagggt tgcgatactg tgaggtggag 1200

ctaatcccaa aaagccggtc tcagttcgga ttggggtctg caactcgacc ccatgaagtc 1260

ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320

acaccgcccg tcaagtcacg aaagttggta acacccgaag ccggtggcct aaccccttgt 1380

gggaggagcc gtcg 1394