一种猪等孢球虫rRNA基因序列及其获取方法与流程

本发明涉及生物基因工程技术领域，更具体的说，涉及一种猪等孢球虫rRNA基因序列及其获取方法。

背景技术：

猪等孢球虫病是一种由等孢属(Isospora)球虫引起的寄生性原虫病，可引起仔猪严重消化道疾病、腹泻、消瘦、发育受阻甚至死亡，其仔猪发病率可高达50％-75％，死亡率高达75％，呈世界性流行，严重危害养猪业发展。

核糖体RNA(rRNA)是细胞中含量最多的RNA，约占RNA总量的82％，与多种蛋白质结合组成核糖体，是细胞内蛋白质合成的分子机器。rRNA基因序列既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，但同种生物细胞完全一致或极少差异，且在生物进化的漫长经历中几乎保持不变，因此rRNA基因序列的差异被广泛认为是各类生物亲缘关系的“分子尺”。目前尚未见猪等孢球虫(Isospora suis,Is)rRNA基因完整序列的研究报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种猪等孢球虫rRNA基因序列及其获取方法，根据Genbank上Is 18S rRNA基因全序列(U97523.1)及Is ITS1基因序列(LC085519.1)设计引物，以Is基因组DNA(gDNA)为模板，PCR方法扩增获得Is-18S rRNA基因序列；根据所获得Is-18S rRNA及Is-ITS1基因序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物，利用Ge nome walking技术克隆获得Is-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S rRNA基因全长序列，从而为猪等孢球虫新一代检测方法的建立打下基础。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现。

一种猪等孢球虫rRNA基因序列，它包括Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列，所述的基因序列为：

GATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTTAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCTTTTATACGGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAAACAGTTATAGTTTATTTGATGGTCTTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTATGGCTAATACATGCGCACGTGCCTCTTCCTCAGGAAGGGCAGTGTTTATTAGATACAGAACCAACCCACCTTCTGGTGGTCCTCAGGTGATTCATAGTAACCGAACGGATCGCGTTATGGCTTCGGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTACTGTATTGGACTACCGTGGCAGTGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATTCAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAACACTGGAAATTTCATTTCTAGTGATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTTCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCTGGAAGCAGCCAGTCCGCCCTTAGGGGTGTGTACGTGGTGAAATTCCGGCATCCTCCTGGTGGCGCTTCGCACTTAACTGGGTGGAGTGCTTTTCCAGGACTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTGTTGCCTTGAATACTGCAGCATGGAATAATAAGATAGGATTTCGGCCCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACTGAAGTAATGATTAATAGGGACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAAGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGCTCGAAGACGACCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATAGGAAAACGTCATACTTGACTTCTCCTGCACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGAAAGGATTGACAGATTGATAGCCCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATCAGGAACCTCGTGTTCTTGTATCACTTCTTAGAGGGACTTTGCGTGTCTAACGCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCTGCACGCGCGCTACACTGATGCATCCAACGAGTTTATAACCTTGGCCGATAGGTCTAGGTAATCTTGTGAGTATGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCGCAAGTCAGCAGCTTGCGCCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAGTGTTCCGGTGAATTATTCGGACCGTTCTGTGGCGCGTTCGTGCCCGAGATGGAAAGTTTTGTGAACCTTAACACTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACACGTGGCCCTTGAAACATCTTTCAAACCTTTAGCAACTGAATCCCCATATTGATGGTCATAAGGAACAGCCTGCTGAGCGTTCGGGGGAAGCTGTGTTTCCCCGCGCCGCCGGCTGCTTCGAATGGCCGCATAAAGGGCATTAGCCGTTATTGCTGATGTGTTCGCCTACAGGGGACGCTGCAAATTCCTCCCGACATACTCAGACGGCTGAAACAGAATAGGGGTTGTTCTCTTCTCTTCTGTTTGCCCTCTGAGCTATGGAAGGTGAGGAAGCGGTTGTCCGTGTGTGGGGGAGTTTGGACTGCAGCGATGGCTTCCAAGTGCTCTGCTACACACATTCATTGTCTACCGCTTGGTGGTAGGGGCAGTCTGTATCCACTGGGGCCGTCACTCGCATCATGAGAGAGATGTGCTCTGTGGATTTGGACGTCGTCTCGCTTTTCCCACGCGGTAGAGGTGAAGTGTGTTTTTTTTTTTTTTCACTTCGCCTGTTTGGTTCCCCTCTAAGAAACGTGGATGATGGGTTTTTGTCTCATTTCTTTTTCCTGTTTCTCGAGAGGTGGGACGAATGTACGTAGTCTGATTTCATTTAAACTTTCAGCAATGGATGTCTTGGTTCGCGCAACGATGAAGGACGCAGCGAAATGCGAAACGCAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATTAGATTTCTGAACGCAAATGGCGCTGCGGGGACATTCCCTGCAGCATGTCTGTTTCAGTGTCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTCCACGCGCTTCTGGGAGTGTTTCTGGAATATGCGTGTGGCAGTGTGATTGGATGTCTTGGGTGTTAAGAAGCAAGCTACTCGTGCTTCTAGAGAGCCGAACGTCATCAGAAATAGTCACAGCGGCGTGTACGCGATCAAACAGTGTTGAGTTGTATCCCGGACATCTTTGAGATACGGTGGTGGAATGCTATTAATTACATCAGAAGATTTCATTGATGGCGGTGATCTACTCGGAGCACTGGTTGGTTGTAACTGAGTATCGTCAGCTCTTAGCTTATGAGGGGGAGATCGGTAGCGGTACCCTTCATGCTCTTCTCTGCATCTCTCCCGTTTGTGTTCTGTGCGGGGACGCAGGTGGTTGAGGGCTGGGTTGTGCCGGAATTTCCTAATTTTAAGACCTGAAATCAGGCGAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATTATTAAGCGGAGGAGAAGAAAATAACAATGATTCCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGGATTAGCTCAAAGTGGAAATCGGAGGTTCTTGATTGAGCCTTTGACTTGTAGCCTCGAGAGGCGTTACCAGTGGAAGCGCAGGGATAAGTTTCTTGGAAAAGAACATCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCCTTGCTCTGCGTTTCTCGTTCCACGTACGGTACGCTTTTATAGAGTCGCGTTCATCGGGATTTGAGCGCAAAATGTGTGATAAGTTTCACATAAAGCTAATACTGGCGCGAGACCGATAGCAAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGTTCTTTGGAAAGAGAGTTAAAAGTGCCTGAAATTGCTGGAAAGGAAGCGATTGGAACCTGTTTGATTCCGAAGAGTGAGGCTGGTCCGGCATTGATCCCTCTGCTTTATCCCACTCTTTTTACGGATGGGAGGCAGGGGTTGGCACTAGATGTAGGACCTGTGGATCTCTTTGGAGAGGTCAGCATCAGTTACAAAGAAGAGATTCCGGACGAAAAAGGTAGGTTTCCTGTGGACTGCTTTATAGTTTCGCCTGGCGGTTTTCTTTGTGACTGGAGCGTGTTTCCGAATTCGGGCCACACTTTCGAGTACTCGAATTCTGTGATGCTGACTATTATGGTTTCAACCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATATGTGCGAGTATGCGGGTGCCAATCCTGTATGCGTAATGAAAGTGAGAGTAGGGAGGTGCGCGGCGCTGCCGCTCTTCACACCTACGACCGACCACGATCTTAGAGAAAGGTTTGAGTTATAGCATATCTGTTAGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGGGTAGAATGAAGTCAGGGGAAACCCTGATGGAGGTTCGTAGCGATACTGACGTGCAAATCGTTCGTCAAACTTGGGTA。

进一步，所述的Is-HN 18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2及28S rRNA组成，其中1-1804bp为18SrRNA基因，全长1804bp；1805-2204bp为ITS1基因，全长400bp；2205-2542bp为5.8SrRNA基因，全长338bp；2543-2975bp为ITS2基因，全长433bp；2976-3957bp为28S rRNA基因，全长982bp，其中ITS2基因为Is保守基因。

本发明还涉及一种猪等孢球虫rRNA基因序列获取方法，它包括：

步骤一，取分离的猪等孢球虫(Is-HN)卵囊液，提取Is-HN gDNA。

步骤二，以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板，对Is-HN ITS1基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照，配制50μL PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix：25μL；上游引物：5’-AAACATCTTTCAAACCTTTAGCAAC-3,下游引物：5’-ACATCTCTCTCATGATGCGAGTG-3’各0.5μL，终浓度为1μM；gDNA模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，72℃延伸10min，35个循环。取PCR反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pMD18-T载体，再将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞。挑取转化子进行菌落PCR鉴定，再将阳性菌测序。

步骤三，以步骤二扩增获得基因序列为参考设计下游引物：5’–ACAT CTCTCTCATGATGCGAGTG-3’；上游引物以已知序列为参考设计：5’-GATCCTG CCAGTAGTCAT-3’，以2.1步骤所提取Is-HN gDNA为模板，对Is-18S rRNA-ITS1基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μL PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix：25μL；上游引物、下游引物各0.5μL，终浓度为1μM；gDNA模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸3min，72℃延伸10min，35个循环。取PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物的回收、连接转化及测序同步骤二的方法。

步骤四，以步骤三扩增获得基因序列为参考设计Genome walking特异性引物：P1：5’-TTCCTCCCGACATACTCAGACG-3’；P2：5’-GAAGGTGAGGAAG CGGTTGTCC-3’：P3：5’-CACATTCATTGTCTACCGCTTGG-3’，进行Is-HN ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的扩增，取PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物的回收、连接转化及测序同步骤二的方法。

步骤五，以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板，对Is-HN18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S全长基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μL PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix:25μL；以Is 18S rRNA基因全序列(U97523.1)为参考设计扩增上游引物：5’-GATC CTGCCAGTAG TCAT-3’，以2.4扩增所获得基因序列为参考设计下游引物：5’-TACCCAAGTTTG ACGAACGATTT-3’，各0.5μL，终浓度为1μM；gDNA模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸4min，72℃延伸10min，35个循环。取PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物的回收、连接转化及测序同步骤二方法。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1.本发明通过对猪等孢球虫核糖体RNA的生物信息学分析，以临床所分离猪等孢球虫为模型，利用分子生物学方法首次成功扩增获得全长为3957bp的Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列，增进对猪等孢球虫rRNA的认识，从而填补猪等孢球虫此方面的空白；

2.本发明根据已知部分片段设计高效引物，首次利用分段扩增及Geno me walking技术对猪等孢球虫rRNA进行成功扩增，证明该方法适用于寄生虫病原重要未知基因片段的扩增，从而拓展了新一代分子生物学应用领域；

3.本发明所获得的rRNA在各种生物体之间既存在高度保守区域，也包含高度变化区域，同种生物此部分基因序列完全一致或极少差异，且在生物进化的漫长经历中几乎保持不变，因此通过不同种或者同种球虫不同分离株在此部分基因序列的变化比较，可以推断其在进化过程中的亲缘关系，即通过系统发生树的构建做物种鉴定，对于正确认识及区分球虫的生物学特性具有重要意义；

4.本发明对所获得基因序列进行生物信息学分析发现全长为433bp的ITS2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体RNA基因序列，从而为猪等孢球虫的特异性分子检测提供模板，为猪等孢球虫病的有效防控打下基础。

附图说明

图1为本发明Is-HN ITS1基因的PCR扩增结果示意图；

图2为本发明Is-HN 18S rRNA-ITS1基因的PCR扩增结果示意图；

图3为本发明Is-HN ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的PCR扩增结果示意图；

图4为本发明Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的PCR扩增结果示意图；

图5为本发明Is-HN ITS2BLAST结果示意图。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

如图1～图5所示，一种猪等孢球虫rRNA基因序列获取方法，它包括：

步骤一，取分离的猪等孢球虫(Is-HN)卵囊液，提取Is-HN gDNA。

步骤二，以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板，对Is-HN ITS1基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照，配制50μL PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix：25μL；上游引物：5’-AAACATCTTTCAAACCTTTAGCAAC-3,下游引物：5’-ACATCTCTCTCATGATGCGAGTG-3’各0.5μL，终浓度为1μM；gDNA模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，72℃延伸10min，35个循环。取PCR反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收，产物连接至pMD18-T载体，再将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞。挑取转化子进行菌落PCR鉴定，再将阳性菌测序。

步骤三，以步骤二扩增获得基因序列为参考设计下游引物：5’–ACAT CTCTCTCATGATGCGAGTG-3’；上游引物以已知序列为参考设计：5’-GATCCTG CCAGTAGTCAT-3’，以2.1步骤所提取Is-HN gDNA为模板，对Is-18S rRNA-ITS1基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μL PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix：25μL；上游引物、下游引物各0.5μL，终浓度为1μM；gDNA模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸3min，72℃延伸10min，35个循环。取PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物的回收、连接转化及测序同步骤二的方法。

步骤四，以步骤三扩增获得基因序列为参考设计Genome walking特异性引物：P1：5’-TTCCTCCCGACATACTCAGACG-3’；P2：5’-GAAGGTGAGGAAG CGGTTGTCC-3’：P3：5’-CACATTCATTGTCTACCGCTTGG-3’，进行Is-HN ITS 1-5.8S-ITS2-28S基因的扩增，取PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物的回收、连接转化及测序同步骤二的方法。

步骤五，以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板，对Is-HN18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S全长基因进行PCR扩增，同时以ddH2O为模板作为阴性对照。配制50μL PCR反应体系(2×Taq PCR MasterMix:25μL；以Is 18S rRNA基因全序列(U97523.1)为参考设计扩增上游引物：5’-GATC CTGCCAGTAG TCAT-3’，以2.4扩增所获得基因序列为参考设计下游引物：5’-TACCCAAGTTTG ACGAACGATTT-3’，各0.5μL，终浓度为1μM；gDNA模板1μL；添加ddH2O至50μL)；反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸4min，72℃延伸10min，35个循环。取PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性产物的回收、连接转化及测序同步骤二方法。

其中Is-HN ITS1基因的PCR扩增产物经3％琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增获得一条小于500bp的条带，如图1(图中，M.DL 2000Marker；1.阴性对照；2,3.Is-HN ITS1基因PCR产物)，经测序分析，发现Is-HN IT S1基因序列全长为400bp，基因序列为：

AAACATCTTTCAAACCTTTAGCAACTGAATCCCCATATTGATGGTCATAAGGAACAGCCTGCTGAGCGTTCGGGGGAAGCTGTGTTTCCCCGCGCCGCCGGCTGCTTCGAATGGCCGCATAAAGGGCATTAGCCGTTATTGCTGATGTGTTCGCCTACAGGGGACGCTGCCAATTCCTCCCGACATACTCAGACGGCTGAAACAGAATAGGGGTTGTTCTCTTCTCTTCTGTTTGCCCTCTGAGCTATGGAAGGTGAGGAAGCGGTTGTCCGTGTGTGGGGGAGTTCGGACTGCAGCGATGGCTTCCAAGTGCTCTGCTACACACATTCATTGTCTACCGCTTGGTGGTAGGGGCAGTCTGTATCCACTGGGGCCGTCACTCGCATCATGAGAGAGATGT；

其中Is-HN 18S rRNA-ITS1基因的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增获得一条超过2000bp的条带，如图2(图中M.250bp DNA Ladder Marker；1,2.Is-HN 18S rRNA-ITS1基因PCR产物；3.阴性对照)，经测序分析，发现Is-HN 18S rRNA-ITS1基因序列全长为2204bp，基因序列为：

GATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTTAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCTTTTATACGGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAAACAGTTATAGTTTATTTGATGGTCTTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTATGGCTAATACATGCGCACGTGCCTCTTCCTCAGGAAGGGCAGTGTTTATTAGATACAGAACCAACCCACCTTCTGGTGGTCCTCAGGTGATTCATAGTAACCGAACGGATCGCGTTATGGCTTCGGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTACTGTATTGGACTACCGTGGCAGTGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATTCAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAACACTGGAAATTTCATTTCTAGTGATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTTCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCTGGAAGCAGCCAGTCCGCCCTTAGGGGTGTGTACGTGGTGAAATTCCGGCATCCTCCTGGTGGCGCTTCGCACTTAACTGGGTGGAGTGCGTTTCCAGGACTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTGTTGCCTTGAATACTGCAGCATGGAATAATAAGATGGGATTTCGGCCCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACTGAAGTAATGATTAATAGGGACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAAGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGCTCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATAGGAAAACGTCATACTTGACTTCTCCTGCACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGAAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATCAGGAACCTCGTGTTCTTGTATCACTTCTTAGAGGGACTTTGCGTGTCTAACGCAGGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCTGCACGCGCGCTACACTGATGCATCCAACGAGTTTATAACCTTGGCCGATAGGTCTAGGTAATCTTGTGAGTATGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCGCAAGTCAGCAGCTTGCGCCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAGTGTTCCGGTGAATTATTCGGACCGTTTTGTGGCGCGTTCGTGCCCGAGATGGAAAGTTTTGTGAACCTTAACACTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACACGTGGCCCTTGAAACATCTTTCAAACCTTTAGCAACTGAATCCCCATATTGATGGTCATAAGGAACAGCCTGCTGAGCGTTCGGGGGAAGCTGTGTTTCCCCGCGCCGCCGGCTGCTTCGAATGGCCGCATAAAGGGCATTAGCCGTTATTGCTGATGTGTTCGCCTACAGGGGACGCTGCAAATTCCTCCCGACATACTCAGACGGCTGAAACAGAATAGGGGTTGTTCTCTTCTCTTCTGTTTGCCCTCTGAGCTATGGAAGGTGAGGAAGCGGTTGTCCGTGTGTGGGGGAGTTTGGACTGCAGCGATGGCTTCCAAGTGCTCTGCTACACACATTCATTGTCTACCGCTTGGTGGTAGGGGCAGTCTGTATCCACTGGGGCCGTCACTCGCATCATGAGAGAGATGT。

Is-HN ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增获得一条将近2000bp的条带，如图3(图中M.DL 2000Marker；1.1st PCR扩增产物；2.2nd PCR扩增产物；3.3rd PCR扩增产物)，经测序分析，发现Is-HN ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列全长为1980bp，基因序列为：

TTCCTCCCGACATACTCAGACGGCTGAAACAGAATAGGGGTTGTTCTCTTCTCTTCTGTTTGCCCTCTGAGCTATGGAAGGTGAGGAAGCGGTTGTCCGTGTGTGGGGGAGTTTGGACTGCAGCGATGGCTTCCAAGTGCTCTGCTACACACATTCATTGTCTACCGCTTGGTGGTAGGGGCAGTCTGTATCCACTGGGGCCGTCACTCGCATCATGAGAGAGATGTGCTCTGTGGATTTGGACGTCGTCTCGCTTTTCCCACGCGGTAGAGGTGAAGTGTGTTTTTTTTTTTTTTCACTTCGCCTGTTTGGTTCCCCTCTAAGAAACGTGGATGATGGGTTTTTGTCTCATTTCTTTTTCCTGTTTCTCGAGAGGTGGGACGAATGTACGTAGTCTGATTTCATTTAAACTTTCAGCAATGGATGTCTTGGTTCGCGCAACGATGAAGGACGCAGCGAAATGCGAAACGCAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATTAGATTTCTGAACGCAAATGGCGCTGCGGGGACATTCCCTGCAGCATGTCTGTTTCAGTGTCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTCCACGCGCTTCTGGGAGTGTTTCTGGAATATGCGTGTGGCAGTGTGATTGGATGTCTTGGGTGTTAAGAAGCAAGCTACTCGTGCTTCTAGAGAGCCGAACGTCATCAGAAATAGTCACAGCGGCGTGTACGCGATCAAACAGTGTTGAGTTGTATCCCGGACATCTTTGAGATACGGTGGTGGAATGCTATTAATTACATCAGAAGATTTCATTGATGGCGGTGATCTACTCGGAGCACTGGTTGGTTGTAACTGAGTATCGTCAGCTCTTAGCTTATGAGGGGGAGATCGGTAGCGGTACCCTTCATGCTCTTCTCTGCATCTCTCCCGTTTGTGTTCTGTGCGGGGACGCAGGTGGTTGAGGGCTGGGTTGTGCCGGAATTTCCTAATTTTAAGACCTGAAATCAGGCGAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATTATTAAGCGGAGGAGAAGAAAATAACAATGATTCCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGGATTAGCTCAAAGTGGAAATCGGAGGTTCTTGATTGAGCCTTTGACTTGTAGCCTCGAGAGGCGTTACCAGTGGAAGCGCAGGGATAAGTTTCTTGGAAAAGAACATCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCCTTGCTCTGCGTTTCTCGTTCCACGTACGGTACGCTTTTATAGAGTCGCGTTCATCGGGATTTGAGCGCAAAATGTGTGATAAGTTTCACATAAAGCTAATACTGGCGCGAGACCGATAGCAAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGTTCTTTGGAAAGAGAGTTAAAAGTGCCTGAAATTGCTGGAAAGGAAGCGATTGGAACCTGTTTGATTCCGAAGAGTGAGGCTGGTCCGGCATTGATCCCTCTGCTTTATCCCACTCTTTTTACGGATGGGAGGCAGGGGTTGGCACTAGATGTAGGACCTGTGGATCTCTTTGGAGAGGTCAGCATCAGTTACAAAGAAGAGATTCCGGACGAAAAAGGTAGGTTTCCTGTGGACTGCTTTATAGTTTCGCCTGGCGGTTTTCTTTGTGACTGGAGCGTGTTTCCGAATTCGGGCCACACTTTCGAGTACTCGAATTCTGTGATGCTGACTATTATGGTTTCAACCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATATGTGCGAGTATGCGGGTGCCAATCCTGTATGCGTAATGAAAGTGAGAGTAGGGAGGTGCGCGGCGCTGCCGCTCTTCACACCTACGACCGACCACGATCTTAGAGAAAGGTTTGAGTTATAGCATATCTGTTAGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGGGTAGAATGAAGTCAGGGGAAACCCTGATGGAGGTTCGTAGCGATACTGACGTGCAAATCGTTCGTCAAACTTGGGTA。

其中Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S全长基因的PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增获得一条超过2000bp的条带，如图4(图中M.DL 2000Marker；1.阴性对照；2.Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因PCR扩增产物)，经测序分析，发现Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因全长为3957bp，基因序列为：

GATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTTAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCTTTTATACGGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAAACAGTTATAGTTTATTTGATGGTCTTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTATGGCTAATACATGCGCACGTGCCTCTTCCTCAGGAAGGGCAGTGTTTATTAGATACAGAACCAACCCACCTTCTGGTGGTCCTCAGGTGATTCATAGTAACCGAACGGATCGCGTTATGGCTTCGGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTACTGTATTGGACTACCGTGGCAGTGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATTCAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAACACTGGAAATTTCATTTCTAGTGATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTTCAGAGTAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCTGGAAGCAGCCAGTCCGCCCTTAGGGGTGTGTACGTGGTGAAATTCCGGCATCCTCCTGGTGGCGCTTCGCACTTAACTGGGTGGAGTGCTTTTCCAGGACTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTTGTTGCCTTGAATACTGCAGCATGGAATAATAAGATAGGATTTCGGCCCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACTGAAGTAATGATTAATAGGGACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAAGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGCTCGAAGACGACCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATAGGAAAACGTCATACTTGACTTCTCCTGCACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGAAAGGATTGACAGATTGATAGCCCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATCAGGAACCTCGTGTTCTTGTATCACTTCTTAGAGGGACTTTGCGTGTCTAACGCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCTGCACGCGCGCTACACTGATGCATCCAACGAGTTTATAACCTTGGCCGATAGGTCTAGGTAATCTTGTGAGTATGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCGCAAGTCAGCAGCTTGCGCCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAGTGTTCCGGTGAATTATTCGGACCGTTCTGTGGCGCGTTCGTGCCCGAGATGGAAAGTTTTGTGAACCTTAACACTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACACGTGGCCCTTGAAACATCTTTCAAACCTTTAGCAACTGAATCCCCATATTGATGGTCATAAGGAACAGCCTGCTGAGCGTTCGGGGGAAGCTGTGTTTCCCCGCGCCGCCGGCTGCTTCGAATGGCCGCATAAAGGGCATTAGCCGTTATTGCTGATGTGTTCGCCTACAGGGGACGCTGCAAATTCCTCCCGACATACTCAGACGGCTGAAACAGAATAGGGGTTGTTCTCTTCTCTTCTGTTTGCCCTCTGAGCTATGGAAGGTGAGGAAGCGGTTGTCCGTGTGTGGGGGAGTTTGGACTGCAGCGATGGCTTCCAAGTGCTCTGCTACACACATTCATTGTCTACCGCTTGGTGGTAGGGGCAGTCTGTATCCACTGGGGCCGTCACTCGCATCATGAGAGAGATGTGCTCTGTGGATTTGGACGTCGTCTCGCTTTTCCCACGCGGTAGAGGTGAAGTGTGTTTTTTTTTTTTTTCACTTCGCCTGTTTGGTTCCCCTCTAAGAAACGTGGATGATGGGTTTTTGTCTCATTTCTTTTTCCTGTTTCTCGAGAGGTGGGACGAATGTACGTAGTCTGATTTCATTTAAACTTTCAGCAATGGATGTCTTGGTTCGCGCAACGATGAAGGACGCAGCGAAATGCGAAACGCAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATTAGATTTCTGAACGCAAATGGCGCTGCGGGGACATTCCCTGCAGCATGTCTGTTTCAGTGTCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTCCACGCGCTTCTGGGAGTGTTTCTGGAATATGCGTGTGGCAGTGTGATTGGATGTCTTGGGTGTTAAGAAGCAAGCTACTCGTGCTTCTAGAGAGCCGAACGTCATCAGAAATAGTCACAGCGGCGTGTACGCGATCAAACAGTGTTGAGTTGTATCCCGGACATCTTTGAGATACGGTGGTGGAATGCTATTAATTACATCAGAAGATTTCATTGATGGCGGTGATCTACTCGGAGCACTGGTTGGTTGTAACTGAGTATCGTCAGCTCTTAGCTTATGAGGGGGAGATCGGTAGCGGTACCCTTCATGCTCTTCTCTGCATCTCTCCCGTTTGTGTTCTGTGCGGGGACGCAGGTGGTTGAGGGCTGGGTTGTGCCGGAATTTCCTAATTTTAAGACCTGAAATCAGGCGAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATTATTAAGCGGAGGAGAAGAAAATAACAATGATTCCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGGATTAGCTCAAAGTGGAAATCGGAGGTTCTTGATTGAGCCTTTGACTTGTAGCCTCGAGAGGCGTTACCAGTGGAAGCGCAGGGATAAGTTTCTTGGAAAAGAACATCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCCTTGCTCTGCGTTTCTCGTTCCACGTACGGTACGCTTTTATAGAGTCGCGTTCATCGGGATTTGAGCGCAAAATGTGTGATAAGTTTCACATAAAGCTAATACTGGCGCGAGACCGATAGCAAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGTTCTTTGGAAAGAGAGTTAAAAGTGCCTGAAATTGCTGGAAAGGAAGCGATTGGAACCTGTTTGATTCCGAAGAGTGAGGCTGGTCCGGCATTGATCCCTCTGCTTTATCCCACTCTTTTTACGGATGGGAGGCAGGGGTTGGCACTAGATGTAGGACCTGTGGATCTCTTTGGAGAGGTCAGCATCAGTTACAAAGAAGAGATTCCGGACGAAAAAGGTAGGTTTCCTGTGGACTGCTTTATAGTTTCGCCTGGCGGTTTTCTTTGTGACTGGAGCGTGTTTCCGAATTCGGGCCACACTTTCGAGTACTCGAATTCTGTGATGCTGACTATTATGGTTTCAACCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATATGTGCGAGTATGCGGGTGCCAATCCTGTATGCGTAATGAAAGTGAGAGTAGGGAGGTGCGCGGCGCTGCCGCTCTTCACACCTACGACCGACCACGATCTTAGAGAAAGGTTTGAGTTATAGCATATCTGTTAGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGGGTAGAATGAAGTCAGGGGAAACCCTGATGGAGGTTCGTAGCGATACTGACGTGCAAATCGTTCGTCAAACTTGGGTA。

经NCBI BLAST在线比对分析，结果显示：Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列由18S rRNA、ITS1、5.8S rRNA、ITS2及28S rRNA组成，其中1-1804bp为18S rRNA基因，全长1804bp；1805-2204bp为ITS1基因，全长400bp；2205-2542bp为5.8S rRNA基因，全长338bp；2543-2975bp为ITS2基因，全长433bp；2976-3957bp为28S rRNA基因，全长982bp,其中ITS2基因为Is保守基因，如图5。

本发明通过对猪等孢球虫核糖体RNA的生物信息学分析，以本研究室临床分离猪等孢球虫为模型，利用分子生物学方法成功扩增获得全长为3957bp的Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列。对所获得基因序列进行生物信息学分析发现全长为433bp的ITS2基因序列为猪等孢球虫所特有的核糖体RNA基因序列，从而为猪等孢球虫的特异性分子检测提供模板，为猪等孢球虫病的有效防控打下基础。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。