一种通过无细胞蛋白合成系统制备半胱氨酸蛋白酶的方法与流程

本发明涉及蛋白制备领域，具体涉及一种通过无细胞蛋白合成系统制备半胱氨酸蛋白酶的方法。

背景技术：

半胱氨酸蛋白酶最为一个重要的蛋白酶家族，广泛地参与植物各种生理过程，例如，种子萌发、幼苗的发育、胁迫反应、植物组织分化和衰老等过程。植物半胱氨酸蛋白酶主要属于木瓜蛋白酶(C1A，papain-like cydteine proteinases)和豆类蛋白酶家族(C13 the legumains)，而对前者的研究最为详细。木瓜蛋白酶很多都含有10-26个疏水氨基酸组成的定位于内质网的信号肽。在酶前体中有一个35-150个氨基酸组成的结构域，封闭了酶的活性位点，同时该结构域对于蛋白质的正确折叠和定位也至关重要。

半胱氨酸蛋白酶参与了根瘤的发育、根瘤的胁迫反应以及根瘤的衰老调节等，半胱氨酸蛋白酶在根瘤的衰老过程中发挥了重要作用，而在定型根瘤百脉根中没有相关的研究结果。本发明找到了一个来源于百脉根并能调控根瘤衰老的蛋白酶，能够增加固氮酶活，增大根瘤直径，延迟衰老，最终植株生长茂盛。本发明在国内外未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通过无细胞蛋白合成系统制备半胱氨酸蛋白酶的方法，该无细胞蛋白合成表达系统无需制备mRNA且表达量高。

本发明通过以下技术方案实现：一种通过无细胞蛋白合成系统制备半胱氨酸蛋白酶的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：半胱氨酸蛋白酶基因的合成和克隆：

用紫云英的半胱氨酸蛋白酶基因AsNODf32在日本百脉根网站中进行比对分析，找到百脉根中的同源克隆；设计特异的引物从百脉根基因组中扩增半胱氨酸蛋白酶基因，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，以PCR方法分别引入双酶切位点到该序列两端；

步骤(2)：重组质粒的构建：

将PCR扩增得到的基因片段用内切酶双酶切，载体pET28a用同样的内切酶双酶切，回收目的片段，然后用DNA连接酶连接载体和目的片段，将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选重组子得到重组质粒pET28a-AsNODf32；

步骤(3)：配制无细胞蛋白表达体系，所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将步骤(2)中筛选得到的重组质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。

步骤(4)：半胱氨酸蛋白酶沉淀处理：

用质量浓度为0.5％～1.5％的弱去污剂溶液将半胱氨酸蛋白酶沉淀进行重悬沉淀，加入少量还原剂离心震荡至沉淀全部溶解，取上清，加入分散剂至终浓度为0.2％～2％，GSSG至终浓度1～5mM，GSSH至终浓度2～8mM，静置12～18h；取出静置后的蛋白，于TE缓冲液中透析，离心得到上清，即为最终的半胱氨酸蛋白酶溶液。

本发明的有益效果为：采用无细胞高效表达的蛋白后处理的过程，对无细胞大量表达的蛋白沉淀进行先变性后复性的方法，制备出了免疫活性较好的半胱氨酸蛋白酶，克服了普通表达系统的低表达量和需要添加脂质体才有活性的问题；该方法无需制备mRNA且表达量高，同时简化后续纯化步骤。

附图说明

图1为实施例1制备的半胱氨酸蛋白酶的电泳图；

图2为实施例2制备的半胱氨酸蛋白酶的电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。

本发明通过无细胞蛋白合成系统制备半胱氨酸蛋白酶的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：半胱氨酸蛋白酶基因的合成和克隆：

用紫云英的半胱氨酸蛋白酶基因AsNODf32在日本百脉根网站中进行比对分析，找到百脉根中的同源克隆；设计特异的引物从百脉根基因组中扩增半胱氨酸蛋白酶基因，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，以PCR方法分别引入双酶切位点到该序列两端；

步骤(2)：重组质粒的构建：

将PCR扩增得到的基因片段用内切酶双酶切，载体pET28a用同样的内切酶双酶切，回收目的片段，然后用DNA连接酶连接载体和目的片段，将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选重组子得到重组质粒pET28a-AsNODf32；

步骤(3)：配制无细胞蛋白表达体系，所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将步骤(2)中筛选得到的重组质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。

步骤(4)：半胱氨酸蛋白酶沉淀处理：

用质量浓度为0.5％～1.5％的弱去污剂溶液将半胱氨酸蛋白酶沉淀进行重悬沉淀，加入少量还原剂离心震荡至沉淀全部溶解，取上清，加入分散剂至终浓度为0.2％～2％，GSSG至终浓度1～5mM，GSSH至终浓度2～8mM，静置12～18h；取出静置后的蛋白，于TE缓冲液中透析，离心得到上清，即为最终的半胱氨酸蛋白酶溶液。

作为进一步的优选，所述大肠杆菌抽提物是用S30缓冲液从大肠杆菌中提取的S30抽提物；所述S30缓冲液包括如下成分：

作为进一步的优选，沉淀处理中添加的弱去污剂为SKL、Triton X2100、辛烷基葡糖苷、脱氧胆酸盐、SDS、CTAB、吐温20、NP-40等，优选为质量浓度为0.5％的SKL溶液。

作为进一步的优选，还原剂为DTT、DTE、GSH、β-巯基乙醇等，优选为DTT。

实施例1

1.半胱氨酸蛋白酶基因的合成和克隆

用紫云英的半胱氨酸蛋白酶基因AsNODf32在日本百脉根网站中进行比对分析，找到百脉根中的同源克隆；设计特异的引物从百脉根基因组中扩增半胱氨酸蛋白酶基因，其基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，以合成的DNA作为PCR模板，上游引物为5’-GATCGGATCCCTGCCGAAAGCGCCG-3’，下游引物为5’-ATG AAGCTTAATATCACGCACATAT-3’，分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点。PCR反应条件:95℃预变性4min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环，72℃延伸6min。

2.重组质粒的构建

PCR扩增得到的基因片段回收并用内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，载体pET28a同样用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，回收大的片段。然后用T4 DNA连接酶连接载体和目的片段，以其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。利用LB氨苄青霉素卡那霉素平板筛选重组转化子，挑取转化子做菌落PCR，对有目的条带的转化子菌落提取重组质粒用内切酶酶切进一步鉴定，并送上海生工生物技术有限公司进行测序，得到重组质粒pET28a-AsNODf32。

3.配制无细胞蛋白表达体系，所述表达体系包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、33μg/mL T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、占总重量2％的PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、占总重量24％的大肠杆菌抽提物；将重组质粒pET28a-AsNODf32加入无细胞蛋白表达体系中，取300μL表达体系溶液于D-Tube^TM透析管中，并置于50mL离心管中，于30℃孵育过夜，离心，分离上清和沉淀，沉淀层即为半胱氨酸蛋白酶。其中，大肠杆菌抽提物是用S30缓冲液从大肠杆菌中提取的S30抽提物；所述S30缓冲液包括如下成分：

5.沉淀处理

沉淀用PBS重悬，离心，去掉上清，重复该步骤2次。用1mL0.5％SKL溶液重悬沉淀，加DTT到终浓度为5mM，30℃，220r，震荡1h至沉淀全部溶解。离心，取上清。加入20％PEG 4000至终浓度为0.2％，50mM GSSG至终浓度1mM，100mM GSSH至终浓度2mM。离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于TE缓冲液3天。透析期间TE缓冲液更换2次。离心，得到上清。即为最终的半胱氨酸蛋白酶溶液。图1为实施例1制备的半胱氨酸蛋白酶的电泳图。

实施例2

步骤1～4和实施例1步骤1～4相同，其中步骤5中沉淀处理如下：

沉淀用PBS重悬，离心，去掉上清，重复该步骤2次。用1mL1.5％SKL溶液重悬沉淀，加DTT到终浓度为5mM，30℃，220r，震荡1h至沉淀全部溶解。离心，取上清。加入20％PEG 4000至终浓度为2％，50mM GSSG至终浓度5mM，100mM GSSH至终浓度8mM。离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于TE缓冲液3天。透析期间TE缓冲液更换2次。离心，得到上清。即为最终的半胱氨酸蛋白酶溶液。图2为实施例2制备的半胱氨酸蛋白酶的电泳图。

<110> 武汉金开瑞生物工程有限公司

<120> 一种通过无细胞蛋白合成系统制备半胱氨酸蛋白酶的方法

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<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 百脉根

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