一种利用三维细胞培养系统促进脐带血造血干细胞快速稳定增殖的细胞培养方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用三维细胞培养系统促进脐带血造血干细胞快速稳定增殖的细胞培养方法

背景技术：

造血干细胞移植是临床上治疗严重创伤、恶性血液性疾病、重症再生障碍性贫血、免疫缺陷综合征、地中海贫血等疾病的有效手段。自20世纪80年代末，世界首例脐血造血干细胞移植成功治疗地中海贫血患者及全世界范围内脐血库的逐步建立、完善以来，脐血以其独特而不可替代的优势作为外周血造血干细胞移植和骨髓移植的良好补充，现已越来越多地用于多种血液系统疾病的治疗。目前世界范围内已有超过上万例的儿童和成人患者接受了UCBT。然而在临床实践中，脐血移植也遇到了障碍。由于脐血造血干细胞的绝对数量较少，脐血移植常常只能用于儿童和低体重成人患者，难以满足成人移植的需要。另外，脐血移植后中性粒细胞和血小板的恢复也较骨髓及动员的外周血慢。从而限制了其在临床上的应用。

为了扩大脐血移植的范围和加快移植后的中性粒细胞和血小板的恢复，就需要对脐血造血干/祖细胞进行体外扩增，通过体外扩增方法产生足够的移植给成人的祖细胞，并且脐血造血细胞体外扩增后的细胞中应含有具有长期重建造血活性的造血干细胞和早期造血祖细胞。目前常规的体外扩增造血干祖细胞的方法多为二维培养，是将造血干祖细胞单个悬浮培养，依赖于较高剂量多种细胞因子的联合作用培养，或者将造血干细胞与外源性细胞因子与脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、AGM区细胞等与造血相关的饲养层细胞混合培养，但此体外扩增方法有明显的局限性，①细胞仅能在水平线形成单层，难以接近体内三维环境。②二维环境培养的细胞在细胞与细胞的接触，细胞与底物的相互作用均与生理条件下三维空间体系有异。③摄取营养的限制及细胞代谢的变化导致细胞活性的限制等。因此，在这样的培养体系里扩增后的细胞无法长期重建造血。

HSC在体内能很好地维持其自我更新与多向分化的潜能，依赖于体内微环境，包括细胞因子和造血生长因子，与支持细胞类型和细胞外基质分子的相互作用，三维空间构型等。本研究发明将造血干细胞与外源性细胞因子和饲养层细胞在三维培养体系下进行共培养，可以更充分地模拟体内造血微环境，实验结果表明，此体系培养结果显示出强大的体外扩增能力，并且具有维持HSC自我更新和多向分化的潜能。鉴于此，本发明能够在体外培养过程中快速、稳定的扩增脐血造血干细胞，获得高质量的功能性造血干细胞，对临床而言意义重大。

技术实现要素：

本发明提出一种利用三维细胞培养系统促进脐带血造血干细胞快速稳定增殖的细胞培养方法，解决了临床上现有技术的造血干细胞移植治疗中造血干细胞数量不足的技术瓶颈。

本发明的技术方案是这样实现的：一种利用三维细胞培养系统促进脐带血造血干细胞快速稳定增殖的细胞培养方法，包括以下步骤：

1)提取制备共培时作为基质细胞使用的细胞，并用流式细胞术进行鉴定；2)处理三维培养过程中使用的微载体或其他载体等材料，备用；3)将基质细胞接种到微载体上，在三维培养系统中培养；4)待基质细胞增殖到覆盖微载体表面80％以上后，对细胞进 行处理，破坏有丝分裂，阻止细胞增殖；5)制备均质的造血干细胞培养基；6)从脐带血中分离PBMC，得到PBMC后分选出CD34+细胞，用流式细胞术进行鉴定；7)将分选得到的CD34+细胞与经过处理的基质细胞在三维培养系统中加入均质的造血干细胞培养基进行培养。

所述造血干细胞是由人脐带血中分选所得，脐带血在产妇知情情况下获得。

所述细胞三维培养材料包括微载体、海藻、纳米材料等。

所述细胞共培养的基质细胞包括人的脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、AGM区细胞等或其他相关诱导造血分化的基质细胞。

所述破坏细胞有丝分裂阻止细胞增殖的方法包括丝裂霉素C处理或射线照射。

所述培养基是指添加10％FBS的IMDM中添加的小分子-芳香烃受体拮抗剂StemRegenin-1(SR1)。

所述培养基是指添加10％FBS的IMDM中添加的SCF、TPO、Flt3L等细胞因子。

流式细胞术检测CD34+细胞比例：分别在刚刚分选之后和在扩增培养的过程中，利用流式细胞术检测细胞表面CD34+表达情况及所占比例。结果显示，本发明在培养10天后，CD34+增殖了近20倍，且CD34+细胞的阳性率依然非常高(99％)。

本发明利用三维培养系统，联合共培养的基质细胞，在SR1和各种细胞因子的共同作用下，促进脐带血造血干细胞增殖，建立了快速稳定的增殖脐带血造血干细胞的方法，本发明可获得大量的功能性造血干细胞，为临床上解决造血干细胞移植中细胞不足的瓶颈问题，提供理论技术和技术平台。

附图说明

下面以脐带间充质干细胞作为基质细胞，用CULTISPHER-GL作为三维培养的载体，使用流式分选技术分选CD34+细胞，联合SR1和细胞因子共培养进行说明。

图1是提取培养的基质细胞脐带间充质干细胞的生长状态(P1代，4×)。

图2是脐带间充质干细胞流式细胞术鉴定结果。

图3是经过处理的未接种细胞的微载体(10×)。

图4是接种脐带间充质干细胞后经过丝裂霉素C的微载体(胎盘兰染色，10×)。

图5是流式细胞仪分选示意图。

图6是分选后CD34+细胞检测图。

图7是共培养4天后造血干细胞状态(10×)。

图8是共培养4天后流式细胞术检测CD34+细胞比例。

图9是共培养7天后造血干细胞状态(10×)。

图10是共培养7天后流式细胞术检测CD34+细胞比例。

图11是共培养10天后造血干细胞状态(10×)。

图12是共培养10天后流式细胞术检测CD34+细胞比例。

具体实施方式

下面将结合发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描 述。

一种利用三维细胞培养系统促进脐带血造血干细胞快速稳定增殖的细胞培养方法，包括以下步骤：

1.实施例中的所有材料、试剂等，无特殊说明情况下，均可以从商业途径获得。

2.基质细胞脐带间充质干细胞的提取、培养、扩增和鉴定(新生儿脐带在产妇知情情况下获得，产妇身体健康。)

1)取出脐带，在预先装有75％酒精的小烧杯中快速浸泡30秒至1分钟，取出放在150mm的平皿中，PBS洗涤2次，洗去酒精。

2)将脐带剪成4-5cm小段，PBS清洗2-3遍，去除血管内残留血液。用有齿镊撕开每段脐带，小心剥离除去脐带外皮层和血管(2根动脉1根静脉，静脉如去不掉也可)，然后用镊子将脐带撕成细丝，越细越好。

3)将撕碎的脐带在100ml的小烧杯中用眼科剪剪成碎块，大约1mm³左右，越碎越好。

4)剪碎的脐带均分到2支50ml的离心管中，各加入0.2％的I型胶原酶15ml，将2管反复颠倒混匀。

5)混匀后的2管组织放入CO₂培养箱37℃进行消化过夜，期间取出颠倒混匀几次。

6)I型胶原酶一次消化后(此时2管组织浑浊，有部分稍大的组织块未消化完全，且粘度非常大)，向2管组织中加入0.25％胰酶，使胰酶终浓度达到0.05％，放入CO₂培养箱37℃对未消化完全的组织块进行进一步消化。

7)配制2瓶0.05％的胰酶(400ml PBS加入100ml 0.25％胰酶)各500ml，将经过0.05％胰酶和0.2％I型胶原酶消化过的组织(此时液体已经比较澄清透明，除个别组织块外均已消化完全)直接加入到上述500ml液体中，每管1瓶。反复颠倒混匀，放入37℃培养箱，消化60min。

8)取出2瓶液体，轻轻吹打，至组织块已散，此时液体仍有一定粘度。取一滴，镜下观察细胞分散情况和细胞量。

9)将液体移至50ml离心管中，3000rpm，10min离心，离心后弃上清，将沉淀收集至新50ml离心管中。

10)收集2个500ml瓶中的消化细胞至4个50ml离心管中，加PBS至45ml，吹打均匀，1500rpm，6min离心。

11)收集离心后细胞，重悬至细胞培养基中。将重悬后细胞平均接种至2个150mm培养皿中，每皿加培养基20ml，放入CO₂培养箱37℃培养，3日内不动，每日隔窗观察培养基是否变浑浊(是否污染)即可。

12)接种后第3日，取出细胞显微镜下观察细胞状态，脐带MSC细胞贴壁生长，分布均匀，大多呈长梭形或多边形，有上皮、血细胞的杂细胞，拍照。然后给细胞半换液。

13)待细胞长至铺满培养皿90％时，消化传代。然后取P2代细胞，进行流式细胞术进行鉴定。

3.三维培养细胞支架处理

本实施例中使用的微载体为商业化产品CULTISPHER-GL，处理方法如下：称取微载体0.1g，加入20mlPBS浸泡3-4小时，换新的20mlPBS浸泡过夜，之后121℃，0.1Mpa，高压灭菌20min。灭菌后，去掉PBS加入20ml完全培养基浸泡待用。

4.三维共培养基质细胞接种、处理

取生长状态良好的脐带间充质干细胞，PBS洗涤两次，每瓶加入胰酶2ml，消 化2min，加入5ml完全培养基终止消化，将消化下来的细胞吸入离心管中，1000转离心5分钟，离心后将细胞重悬，细胞计数仪进行细胞计数。取计数后细胞4×10⁶个，重悬至30ml。先将微载体混匀全部加入三维培养瓶中，然后将细胞加入三维培养瓶，混匀后放入培养箱培养，仪器设置为35转/分钟，运转5分钟，停止15分钟，12个循环，之后再加入培养基50ml终体积100ml，仪器设置为50转/分钟，连续运转。细胞终培养密度4×10⁴个/ml。待细胞铺满微载体表面80％以上时，加入终浓度10μg/ml的丝裂霉素C对细胞处理2小时，更换新培养基，继续培养待用。

5.造血干细胞的获得

本实施例中，产妇身体健康，脐带血在产妇知情情况下获得。

1)将所得脐血3000转/分钟离心10分钟，去除血清。

2)用PBS将离心后沉淀稀释至离心前体积的两倍。

3)吸取30ml缓慢加入预先装有15ml Ficoll的50ml离心管中。

4)所有血液加好后，2000转/分钟离心20分钟，离心结束时缓慢降速。

5)吸取第二层的白膜细胞层到离心管中，加入30ml PBS洗涤两次。

6)细胞计数后，按照每10⁶个细胞加入3μl CD34抗体，进行染色，室温染色20分钟。染色后，PBS洗涤2遍，将重悬细胞浓度调整至10⁷/ml，进行分选。分选后细胞流式细胞仪检测细胞纯度。

6.造血干细胞接种、培养

将分选得到的CD34+细胞计数。弃掉三维培养瓶中的培养基，加入造血干细胞培养基50ml，取CD34+细胞1.5×10⁶个，重悬至50ml造血干细胞培养基中，加入到三维培养瓶中共培养，仪器设置为50转/分钟，连续运转。脐血造血干细胞培养基为含10％FBS的IMDM，添加终浓度为1μM小分子-芳香烃受体拮抗剂StemRegenin-1(SR1)，添加SCF100ng/ml，Flt3L 40ng/ml，TPO 2ng/ml，IL-6 20ng/ml。细胞培养过程中，在第4天、第7天、第10天对培养的造血干细胞半换液，而后在细胞混匀后，吸出细胞培养悬液2ml，200目细胞筛筛除微载体，放入6孔板中拍照、计数。另外吸出2ml，200目细胞筛筛除微载体，将含有脐带血造血干细胞的培养基1000转离心5分钟，PBS洗涤一遍，加入CD34抗体，进行染色，4℃染色30分钟，染色结束后PBS再洗涤1遍，加入200μl 2％多聚甲醛固定，流式细胞仪上机检测CD34+细胞百分比。

培养10天后的结果显示，CD34+细胞和低表达的百分比为99％，与刚分选之后检测的CD34+百分率相当；细胞浓度为23.6×10⁴个/ml，为最初培养时细胞浓度的近20倍。