本发明属于组织工程及眼科修复技术领域，具体涉及一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法。
背景技术：
角膜分为5层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。其中，位于最内层的内皮细胞层对于维持角膜透明及其正常的生理功能具有十分重要的意义。内皮细胞为一单层细胞，细胞高约50um，宽约20um。人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells，Hcecs)通过泵功能和屏障功能，调控角膜的透明性。随着年龄增加，角膜内皮细胞的密度逐渐降低，当细胞密度小于500-800个/mm2时则会引起角膜内皮失代偿，导致角膜持续水肿失去透明性。由于成人角膜内皮细胞缺乏增殖能力，角膜内皮细胞受损后只能依赖损伤区周边细胞的扩展和移行进行修复。
目前，人角膜内皮细胞是治疗角膜内皮功能失代偿最理想的种子细胞。而角膜供体匮乏是全球性问题，人们通过体外培养角膜内皮细胞使其增殖以进行角膜内皮细胞移植和组织工程学等研究。常用的培养方法是从供体上撕除后弹力层和角膜内皮层，用酶消化法提取角膜内皮细胞，培养基为基础培养基加各种生长因子。
但体外培养角膜内皮细胞存在以下缺点：经多次传代后不能维持其正常的细胞形态和功能，尚无法应用于临床治疗及相关研究。因此，目前亟需一种合适的培养方法来解决人角膜内皮细胞无法多次传代并保持细胞形态和功能的问题。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种可使角膜内皮细胞多次传代后仍保持正常形态，并促进其功能和特性的方法。本发明首先分离和培养人眼眶脂肪干细胞(orbital adipose-derived stem cell，O-ASC)并提取条件培养基。然后提取原代人角膜内皮细胞，在人角膜内皮细胞基础培养基内加入人眼眶脂肪干细胞条件培养基进行培养。结果显示该方法下体外培养的人角膜内皮细胞可以传10代以上，在保持正常形态的同时还能促进细胞的增殖修复等能力，相比于现有技术中的培养方法，取得了意想不到的技术效果。
本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种促进角膜内皮细胞功能和特性的方法，包括以下步骤：
分离和培养人眼眶脂肪干细胞(O-ASC)并提取条件培养基；
分离和培养原代人角膜内皮细胞；
在培养人角膜内皮细胞的培养基中加入所述条件培养基对人角膜内皮细胞进行培养增殖。
本发明所述的促进角膜内皮细胞功能和特性是指促进多次传代后角膜内皮细胞的增殖分化能力及修复能力，同时保持其多边形态。
人角膜内皮细胞由来源于外胚层的神经嵴(干)细胞发育而来，而人眼眶脂肪干细胞同样为神经嵴来源，并且具有较强的增殖能力和多系分化潜能。我们认为O-ASC能够通过旁分泌等机制即其培养液中的细胞因子对角膜内皮细胞的增殖及功能起到促进作用，因此本发明选用人眼眶脂肪干细胞作为条件培养基的细胞来源。实验结果证实该条件培养基能够有效促进人角膜内皮细胞的增殖能力及修复功能。
所述分离和培养人眼眶脂肪干细胞的方法包括以下步骤：
无菌条件收集人眼眶脂肪组织，PBS冲洗数遍，用乙醇浸泡30s，再采用PBS冲洗数遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，剪碎至颗粒状，加入胶原酶消化液，置于恒温摇床中振荡消化；然后加入同体积含有胎牛血清(FBS)的低糖型DMEM培养基中和，离心；弃去上层脂肪及液体，无菌PBS重悬，离心，弃去上层液体，加入适量DMEM培养基，滤网过滤，混匀后加入无菌培养皿，置于5％CO2、37℃培养箱中培养；48-72小时后首次换液，之后每2-3天换液1次，待细胞融合至80-90％时进行传代培养。
优选的，所述分离和培养人眼眶脂肪干细胞的方法包括以下步骤：
无菌条件收集人眼眶脂肪组织，以下过程均在无菌条件下操作，PBS冲洗3遍，用体积分数为75％乙醇浸泡30s，PBS冲洗3遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，剪碎至1mm3颗粒，加入2倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶消化液(w/v，g/100mL)，置于37℃恒温摇床中慢速振荡消化1h；加入同体积含有10％胎牛血清(FBS)(v/v)的低糖DMEM培养基中和，300×g离心10min；弃去上层脂肪及液体，无菌PBS重悬，300×g离心5min,弃去上层液体，加入适量DMEM培养基，100um滤网过滤，混匀后加入无菌培养皿，置于5％CO2、37℃培养箱中培养；48-72小时后首次换液，之后每2-3天换液1次，待细胞融合至80-90％时进行传代培养实验。
优选的，所述提取条件培养基的方法包括以下步骤：
使用2-10代的O-ASC，待O-ASC生长至50-80％满时，弃去培养基，无菌PBS漂洗一次，加入DMEM培养基继续培养12-24小时后收集细胞培养上清液，收集好的上清液用滤器过滤后，即是人眼眶脂肪干细胞条件培养基，-80℃保存备用。
优选的，分离和培养原代人角膜内皮细胞的方法包括以下步骤：
显微镜下用镊子将角膜内皮细胞层和后弹力层一起撕下，用基础培养基、37℃培养箱中孵育过夜使其稳定；然后离心，弃上清，加入胶原酶消化；吹打多次从后弹力层上分离角膜内皮细胞，离心，弃上清，得到原代人角膜内皮细胞。
具体的，包括以下步骤：显微镜下用镊子将人角膜内皮细胞层和后弹力层一起撕下，用基础培养基37℃培养箱中孵育过夜使其稳定；然后300×g离心5min。弃上清，加入0.1％Ⅰ型胶原酶37℃消化1-2h；吹打多次从后弹力层上分离角膜内皮细胞，400×g离心5min，弃上清，得到人角膜内皮细胞。
人角膜内皮细胞进行培养增殖方法包括以下步骤：用含有所述条件培养基的基础培养基重悬得到的原代人角膜内皮细胞，将细胞悬液接种到培养板中的一孔中，37℃、5％CO2的状态下培养；48h后首次换液，之后隔天换液，当细胞达到融合状态后1:2传代。
具体的，包括以下步骤：
用含有条件培养基的基础培养基重悬细胞，将细胞悬液接种到12孔板中的一孔中，孔中预先包被细胞粘附试剂(FNC coating mix)，37℃、5％CO2的状态下培养；48h后首次换液，之后隔天换液；当细胞100％后1:2传代。
本发明中，1：2传代是指将1瓶细胞瓶内的原代细胞接种到2个细胞瓶内进行传代培养。
实验结果表明，本发明培养的人角膜内皮细胞在传代时无需提前使用细胞粘附试剂包被。
本发明的第二个目的是提供一种采用上述方法得到的人角膜内皮细胞。
人角膜内皮细胞在体内呈现为六角形，采用本发明的方法培养的人角膜内皮细胞用相差显微镜观察细胞呈现类似于六角形的多边形，接近于体内形态，细胞相互之间形成紧密连接呈单层镶嵌样排列。经过试验验证，进行多达13次传代培养后，该方法培养的细胞仍能保持其正常的细胞形态。
本发明的第三个目的是所述人角膜内皮细胞在制备治疗角膜内皮功能失代偿药物中的应用。
治疗方法是将体外培养的人角膜内皮细胞注射至角膜内皮功能失代偿眼的前房。经过动物实验验证，在治疗角膜内皮功能失代偿时，该方法培养的细胞具有优异的修复功能。
本发明的第四个目的是提供一种角膜内皮细胞培养用培养基，包括以下人角膜内皮细胞基础培养基和质量为其10～20％的条件培养基，其中，所述人角膜内皮细胞基础培养基，包含Opti-MEM-I，其中添加了胎牛血清(FBS)、表皮细胞生长因子(EGF)、抗坏血酸、CaCl2、硫酸软骨素和青霉素-链霉素。
经过实验验证，为使得传代培养后的人角膜内皮细胞的综合效果最好，所述人角膜内皮细胞基础培养基，包含Opti-MEM-I，其中，在Opti-MEM-I中，FBS的体积分数为8％(v/v)，EGF浓度为5ng/mL，抗坏血酸的浓度为20ug/mL，CaCl2的浓度为200mg/L，硫酸软骨素的质量体积分数为0.08％(w/v，g/100mL)，青霉素-链霉素混合液的体积分数为1～1.25％(v/v)。
青霉素-链霉素混合液中含青霉素10000u/mL，含链霉素10000ug/mL。
上述技术方案中具有如下有益效果：
本发明首次将体外培养的人眼眶脂肪干细胞中提取的条件培养基应用于培养人角膜内皮细胞，实验证实该条件培养基能促进角膜内皮细胞的增殖及修复能力，为实现人角膜内皮细胞的细胞治疗提供了有效的依据。另外，人眼眶脂肪取材方便，提取培养眼眶脂肪干细胞的过程相对简单，可为培养角膜内皮细胞提供可靠充足的细胞来源。
本发明利用从人眼眶脂肪干细胞提取的条件培养基培养得到的人角膜内皮细胞可以稳定传13代，与现有技术比较，扩增倍数更多。而且多次传代后细胞的贴壁及增殖能力均较强，以往体外培养的人角膜内皮细胞在传代时，需要利用促进细胞粘附的物质(如壳聚糖、FNC Coating Mix等)提前包被培养介质，而实验结果表明，本发明培养的人角膜内皮细胞在传代时无需提前包被，细胞仍有较强的贴壁及增殖能力(传代时以4×104cells/cm2密度接种，24小时的细胞贴壁率已超过50％)。
采用本发明的方法培养人角膜内皮细胞，能够保持人角膜内皮细胞的正常形态。
本发明的方法得到的人角膜内皮细胞，还可以反复冷冻保存。
利用免疫荧光等方法检测传代后的人角膜内皮细胞表达相关标志物，发现Na+/K+ATPase、ZO-1、N-cadherin均有较高的表达。
动物实验结果显示，本发明培养的人角膜内皮细胞能够治疗角膜内皮功能失代偿，具有优异的修复功能。
附图说明
图1是倒置相差显微镜下的O-ASC细胞形态和免疫荧光检测细胞相关标志物；
其中，A、B表示：分离、培养O-ASC，C表示：免疫荧光(波形蛋白，vimentin)。
图2是Hcec原代培养及其标记物检测图；其中，A-C：Hcec原代培养；D：Hcec见细胞衰老及变形(P8)；E-G：细胞免疫荧光检测相关标志物。
图3是划痕实验图(检测细胞增殖能力)。
图4.1～4.2是检测延长传代后Hcec的相关标志物图；其中，图4.1：westernblotting；图4.2：免疫荧光。
图5.1～5.2是应用体外培养的人角膜内皮细胞治疗动物角膜内皮失代偿图。其中，图5.1：治疗兔角膜内皮失代偿；图5.2：治疗猴角膜内皮失代偿。
图6是活体的人角膜内皮细胞图和本发明的体外培养的人角膜内皮细胞图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
PBS是磷酸盐缓冲液的简称，是接近人体生理条件的常规缓冲液。
DMEM培养基为达尔贝科改良伊格尔培养基，包括低糖型和高糖型，为一种常规的基础培养基。
Opti-MEM-I是减血清培养基，它是EMEM基础培养基的改良型，在EMEM基础培养基中添加了HEPES、重碳酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、胰岛素、及转铁蛋白等的培养基。它是一种常规的减血清培养基。
本发明采用的材料和试剂均可通过常规手段得到，例如：低糖型DMEM培养基购自HyClone公司；Ⅰ型胶原酶购自Sigma公司；细胞粘附试剂(FNC coating mix)购自Usbio公司；Opti-MEM-I购自Gibco公司；青霉素-链霉素混合液中含青霉素10000u/mL，含链霉素10000ug/mL，购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1
1、分离、培养人眼眶脂肪间充质干细胞并提取条件培养基：
分离、培养O-ASC：脂肪来自齐鲁医院医学美容科行重睑成形手术的患者。无菌条件收集人眼眶脂肪组织，以下过程均在无菌条件下操作，PBS冲洗3遍，用体积分数为75％乙醇浸泡30s，PBS冲洗3遍，剔除肉眼可见的血管及结缔组织，剪碎至约1mm3颗粒，加入2倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶消化液，置于37℃恒温摇床中慢速振荡消化1h。加入同体积含有10％FBS的低糖DMEM培养基中和，300×g离心10min。弃去上层脂肪及液体，无菌PBS重悬，300×g离心5min，弃去上层液体，加入适量干细胞培养基，100um滤网过滤，混匀后加入无菌培养皿，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。48-72小时后首次换液，之后每2-3天换液1次，待细胞融合至80-90％时进行传代培养等实验。分离和培养得到的O-ASC如图1所示。
提取条件培养基：使用2-10代的O-ASC，待O-ASC生长至50-80％满时，弃去培养基，无菌PBS漂洗一次，加入新鲜干细胞培养基继续培养12-24小时后收集细胞培养上清液，收集好的上清液用0.22um滤器过滤后，即是O-ASC条件培养基，-80℃保存备用。
人角膜内皮细胞基础培养基：包含Opti-MEM-I，并添加了胎牛血清(FBS)、表皮细胞生长因子(EGF)、抗坏血酸、CaCl2、硫酸软骨素和青霉素-链霉素。在Opti-MEM-I中，FBS的体积分数为8％(v/v)，EGF浓度为5ng/mL，抗坏血酸的浓度为20ug/mL，CaCl2的浓度为200mg/L，硫酸软骨素的质量体积分数为0.08％(w/v，g/100mL)，青霉素-链霉素混合液的体积分数为1％(v/v)。
条件培养基加入比例：10-20％。
2.人角膜内皮细胞(Hcec)原代培养
显微镜下用镊子将捐献者的角膜内皮细胞和后弹力层一起撕下，用基础培养基(Opti-MEM-I，8％FBS,5ng/mL EGF，20ug/mL抗坏血酸，200mg/L氯化钙，0.08％硫酸软骨素和1％青霉素-链霉素混合液)37℃培养箱中孵育过夜使其稳定。然后300×g离心5min。弃上清，加入0.1％Ⅰ型胶原酶(w/v，g/100mL)37℃消化1-2h。吹打多次从后弹力层上分离角膜内皮细胞，400×g离心5min。弃上清，用含有条件培养基的基础培养基重悬细胞。将细胞悬液接种到12孔板中的一孔中(预先包被FNC coating mix)，37℃、5％CO2的状态下培养。48h后首次换液，之后隔天换液。当细胞100％后1:2传代。Hcec原代培养及其标记物检测如图2所示。本发明体外培养的Hcec如图6左图所示，观察细胞形态呈类六边形；图6左图为活体Hcec，细胞形态为六边形。
3.Hcec延长传代后功能及相关标志物的检测
延长传代培养：用含有眼眶脂肪干细胞来源条件培养基的基础培养基继续培养Hcec，每3-5天传代一次，能至少传13代并维持细胞多边形态及功能。
划痕实验检测Hcec的增殖能力(体外培养的Hcec 9、11、13、14代)：试验结果如图3所示：9代、11代和13代Hcec在12小时内能够完全修复划痕，而14代Hcec12小时内未能完全修复划痕。结果说明14代之前的Hcec有较强的增殖能力。
相关标志物的检测：
N-Cadherin是细胞与细胞之间的一种紧密连接蛋白，在发育中的角膜内皮细胞内有表达。
ZO-1是角膜内皮细胞与细胞之间的紧密连接蛋白，分布在正常角膜内皮细胞紧密连接处，为角膜内皮屏障功能的重要组成。
Na+/K+ATPase存在于正常角膜内皮细胞胞浆及胞膜处，是角膜内皮细胞发挥泵功能必不可少的一种功能蛋白。
免疫荧光检测N-Cadherin、ZO-1和Na+/K+ATPase，试验结果如图4.2所示：多次传代后的Hcec均表达N-Cadherin、ZO-1和Na+/K+ATPase。
Western blotting检测(第5、9、11，9、11、13代细胞，对应图4.1中P5、P9、P11及P9、P11、P3)，试验结果如图4.1所示：多次传代后的Hcec均表达ZO-1、Na+/K+ATPase。
4.动物实验证实延长传代后Hcec的修复能力
(1)建立新西兰大白兔、恒河猴角膜内皮功能不全模型：手术刮除内皮细胞层。
(2)Hcec移植实验：前房注射体外培养的第11代Hcec，术后定期行裂隙灯、前节OCT等检查角膜变化，术后角膜行组织学等检查。
动物实验结果如图5所示(图5.1为新西兰大白兔，图5.2为恒河猴，上、中为裂隙灯图像，下为前节OCT图像)：制作角膜内皮失代偿动物模型然后进行Hcec的前房注射并进行观察。
结果显示：如图5.1所示，经过7天的治疗，Hcec前房注射后新西兰大白兔的角膜水肿及混浊逐渐减轻至透明，增厚的角膜逐渐变薄至基本正常。
如图5.2所示，经过7天的治疗，Hcec前房注射后恒河猴的角膜水肿及混浊逐渐减轻至透明，增厚的角膜逐渐变薄至基本正常。
结论：用本发明的方法培养的Hcec能够使角膜内皮失代偿的动物角膜恢复透明，充分证明了其细胞治疗作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。