本发明属于合成生物学领域，涉及了一种无细胞系统合成蛋白质的方法。
背景描述
蛋白质的合成是几乎所有生物体内都会涉及的一种生物过程，它是开发生产抗体、疫苗和工业化酶制剂等的基础。随着限制性内切酶和pcr技术的发现，重组dna利用微生物或植物生产蛋白质成为可能。大肠杆菌和酵母被广泛应用于应用于生产胰岛素等药用多肽。
除了利用生物体本身在体内合成蛋白质之外，衍生出了一种利用细胞提取物在体外即无细胞体系中合成蛋白的方法。无细胞蛋白合成体系利用细胞抽提物中的酶和蛋白质因子，以外源dna或mrna为模板，通过补充翻译所需的底物和能量物质，从而实现目标蛋白的体外合成。该方法与体内表达蛋白质的方法相比，无细胞蛋白合成有如下优势：不受胞内复杂环境的影响、可调控性强、对毒性蛋白的耐受力高、产物分离成本低。由于不需考虑细胞本身的繁殖和存活，改变诸如体系ph或离子强度相较于体内更加易行，有利于特殊蛋白质的生产。
被用于制备无细胞蛋白质合成系统所用到的细胞提取液主要有：大肠杆菌、酵母、兔网状红血球和小麦胚芽细胞等。虽然无细胞蛋白质合成系统在多肽合成的速度和准确性上达到了实验室可以接受的水平，但是一般认为基于生物体细胞提取液的无细胞蛋白质合成体系的合成速率和稳定性还不够高，离应用于实际生产蛋白质还有一定的距离。
无细胞蛋白质合成系统的最大潜在应用是代替细胞体系进行蛋白质的工业化生产，而工业化生产的必要条件是其产量和生产速率要满足可以工业化的水平。
技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
目前研究较多的无细胞蛋白合成体系利用细胞抽提物中的酶和蛋白质因子，以外源dna或mrna为模板，通过补充翻译所需的底物和能量物质，从而实现目标蛋白的体外合成。但是一般认为基于生物体细胞提取液的无细胞蛋白质合成体系的合成速率和稳定性还不够高，离应用于实际生产蛋白质还有一定的距离。
为此，本发明的一个目的在于提供一种无细胞蛋白质合成的方法。该方法通过常规的裂解大肠杆菌培养物的方法得到大肠杆菌细胞提取物，通过加入蛋白质溶液促进该无细胞蛋白质合成体系，提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种无细胞蛋白质表达体系增强剂。根据本发明的实施例，所述无细胞蛋白质表达体系增强剂含有t7rna聚合酶t7rnap或其功能等同体；天冬氨酸trna合酶asprs或其功能等同体；半胱氨酸trna合酶cysrs或其功能等同体；起始因子2if2或其功能等同体；起始因子3if3或其功能等同体；延伸因子gef-g或其功能等同体；延伸因子tuef-tu或其功能等同体；延伸因子tsef-ts或其功能等同体；释放因子2rf2或其功能等同体；释放因子3rf3或其功能等同体；以及核糖体循环因子rrf或其功能等同体至少之一；利用根据本发明实施例的无细胞蛋白质表达体系增强剂能够提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。
根据本发明的实施例，上述无细胞蛋白质表达体系增强剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述的无细胞蛋白质表达体系增强剂包括：t7rna聚合酶t7rnap或其功能等同体；起始因子2if2或其功能等同体；起始因子3if3或其功能等同体；延伸因子tuef-tu或其功能等同体；以及核糖体循环因子rrf或其功能等同体。根据本发明的实施例，该五种成份能够显著提高蛋白质合成反应的速率和蛋白产量。
根据本发明的实施例，所述的无细胞蛋白质表达体系增强剂包括：1微摩尔份的t7rna聚合酶t7rnap或其功能等同体；0.05微摩尔份的起始因子2if2或其功能等同体；0.2微摩尔份的起始因子3if3或其功能等同体；0.4微摩尔份的延伸因子tuef-tu或其功能等同体；以及1微摩尔份的核糖体循环因子rrf或其功能等同体。根据本发明的实施例，这五种成份按照上述比例能够达到最优组合，实现最高效合成蛋白的无细胞蛋白质表达体系。
在本发明的第二方面，本发明提出一种无细胞蛋白质表达体系，根据本发明的实施例，该体系包括目标蛋白质编码核酸，所述目标蛋白质编码核酸编码目标蛋白质；基础表达体系，所述基础表达体系适于利用所述目标蛋白质编码核酸表达所述目标蛋白质；上述的无细胞蛋白质表达体系增强剂。
根据本发明的实施例，上述无细胞蛋白质表达体系增强剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述基础表达体系含有大肠杆菌裂解物。所述大肠杆菌的裂解物是通过常规通用方法将大肠杆菌培养物通过超声破碎后得到的上清液。
根据本发明的实施例，所述大肠杆菌裂解物为大肠杆菌bl21(de3)的超声裂解物上清。
根据本发明的实施例，所述基础表达体系包括：大肠杆菌bl21(de3)的超声裂解物上清；腺苷三磷酸(atp)；鸟苷三磷酸(gtp)；尿苷三磷酸(utp)；胞苷三磷酸(ctp)；亚叶酸；大肠杆菌trna混合液；谷氨酸钾；草酸钾；谷氨酸铵；谷氨酸镁；20种必需氨基酸混合物；氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)；辅酶a；亚精胺；腐胺；磷酸烯醇式丙酮酸。
根据本发明的实施例，所述目标蛋白质编码核酸是以质粒的形式提供的。
根据本发明的实施例，所述的无细胞蛋白质表达体系包括：占体系总体积27％的大肠杆菌细胞提取物；1.2mm腺苷三磷酸(atp)；0.86mm鸟苷三磷酸(gtp)；0.86mm尿苷三磷酸(utp)；0.86mm胞苷三磷酸(ctp)；34.0μg/ml亚叶酸；170.0μg/ml大肠杆菌trna混合液；175mm谷氨酸钾；2.7mm草酸钾；10mm谷氨酸铵；12mm谷氨酸镁；20种l型氨基酸各2mm；0.33mm氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)；0.27mm辅酶a；1.5mm亚精胺；1mm腐胺；33.33mm磷酸烯醇式丙酮酸；13.3μg/ml质粒；10μmt7rnap；0.5μmif2；2μmif3；4μmef-tu；以及10μmrrf。以上比例的成份适宜蛋白质的高效表达。
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的无细胞蛋白质表达体系在制备蛋白质中的用途。如前所述，利用本发明实施例的无细胞蛋白质表达体系，能够提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。
附图说明
图1是实施例1中加入不同浓度t7rnap蛋白后无细胞蛋白质合成体系产生egfp的产量结果图。
图2是实施例1中加入不同浓度t7rnap蛋白后无细胞蛋白质合成体系产生egfp生产速率结果图。
图3是实施例2中加入不同浓度的特定蛋白后无细胞蛋白质合成体系产生egfp的产量结果图。
图4是实施例3中加入五种蛋白质后无细胞蛋白质合成体系产生egfp的产量结果图。
图5是实施例3中加入五种蛋白质后无细胞蛋白质合成体系产生egfp的生产速率图。
具体实施方法
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
无细胞蛋白质表达体系增强剂
在本发明的第一方面，本发明提出了一种无细胞蛋白质表达体系增强剂。根据本发明的实施例，所述无细胞蛋白质表达体系增强剂含有t7rna聚合酶t7rnap或其功能等同体；天冬氨酸trna合酶asprs或其功能等同体；半胱氨酸trna合酶cysrs或其功能等同体；起始因子2if2或其功能等同体；起始因子3if3或其功能等同体；延伸因子gef-g或其功能等同体；延伸因子tuef-tu或其功能等同体；延伸因子tsef-ts或其功能等同体；释放因子2rf2或其功能等同体；释放因子3rf3或其功能等同体；以及核糖体循环因子rrf或其功能等同体至少之一；利用根据本发明实施例的无细胞蛋白质表达体系增强剂能够提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。
根据本发明的实施例，上述无细胞蛋白质表达体系增强剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述的无细胞蛋白质表达体系增强剂包括：t7rna聚合酶t7rnap或其功能等同体；起始因子2if2或其功能等同体；起始因子3if3或其功能等同体；延伸因子tuef-tu或其功能等同体；以及核糖体循环因子rrf或其功能等同体。根据本发明的实施例，该五种成份能够显著提高蛋白质合成反应的速率和蛋白产量。
根据本发明的实施例，所述的无细胞蛋白质表达体系增强剂包括：1微摩尔份的t7rna聚合酶t7rnap或其功能等同体；0.05微摩尔份的起始因子2if2或其功能等同体；0.2微摩尔份的起始因子3if3或其功能等同体；0.4微摩尔份的延伸因子tuef-tu或其功能等同体；以及1微摩尔份的核糖体循环因子rrf或其功能等同体。根据本发明的实施例，这五种成份按照上述比例能够达到最优组合，实现最高效合成蛋白的无细胞蛋白质表达体系。
根据本发明的实施例，所述的以上蛋白质以外均由来源于大肠杆菌bl21(de3)基因组上的基因所编码。其编码基因序列为(t7rnap:m38308.1、asprs：np_416380、cysrs：np_415059、if2：np_417637、if3：np_416233、ef-g：np_417799、ef-tu：np_417798和np_418407、ef-ts：np_414712、rf2：np_417367、rf3：np_418792、rrf：np_414714)。
无细胞蛋白质表达体系
在本发明的第二方面，本发明提出一种无细胞蛋白质表达体系，根据本发明的实施例，该体系包括目标蛋白质编码核酸，所述目标蛋白质编码核酸编码目标蛋白质；基础表达体系，所述基础表达体系适于利用所述目标蛋白质编码核酸表达所述目标蛋白质；上述的无细胞蛋白质表达体系增强剂。
根据本发明的实施例，上述无细胞蛋白质表达体系增强剂还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述基础表达体系含有大肠杆菌裂解物。所述大肠杆菌的裂解物是通过常规通用方法将大肠杆菌培养物通过超声破碎后得到的上清液。
根据本发明的实施例，所述大肠杆菌裂解物为大肠杆菌bl21(de3)的超声裂解物上清。
根据本发明的实施例，所述基础表达体系包括：大肠杆菌bl21(de3)的超声裂解物上清；腺苷三磷酸(atp)；鸟苷三磷酸(gtp)；尿苷三磷酸(utp)；胞苷三磷酸(ctp)；亚叶酸；大肠杆菌trna混合液；谷氨酸钾；草酸钾；谷氨酸铵；谷氨酸镁；20种必需氨基酸混合物；氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)；辅酶a；亚精胺；腐胺；磷酸烯醇式丙酮酸。其中，腺苷三磷酸(atp)；鸟苷三磷酸(gtp)；尿苷三磷酸(utp)；胞苷三磷酸(ctp)的作用为提供合成信使rna所需的原料；大肠杆菌trna混合液的作用为提供20种氨酰trna合成的所需的原料；20种必需氨基酸混合物的作用为提供多肽合成的原来；谷氨酸镁等盐溶液的作用为提供氨酰trna合成酶的金属离子及根离子；氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、辅酶a、亚精胺、腐铵、磷酸烯醇式丙酮酸的作用为提供多肽合成所需的能量。这些基础表达体系是为了维持蛋白表达的通用体系，提供了蛋白质合成所需要的能量物质和底物，通过加入大肠杆菌细胞裂解物上清和模版dna或信使rna可以实现蛋白质的体外合成。
需要说明的是，上述大肠杆菌bl21(de3)的超声裂解物上清制备方法为通用方法，使用如下方法：用1l的2×ytpg培养基(16g蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠，7gk2hpo4，3gkh2po4，18g葡萄糖，ph＝7.2)培养大肠杆菌bl21(de3)，37℃、220r/min培养至od600值为0.6-0.8，加1mmol/l的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷诱导，培养至od600＝4时收菌，5000r/min，15min。buffera(10mmtrisbase，14mm醋酸镁，60mm谷氨酸钾，2mmdtt，ph＝8.2)洗涤菌体3次，称细胞湿重，保存于-80℃冰箱。用1mlbuffera重悬1g菌体，超声破菌，12000r/min，4℃，10min离心，取上清液作为大肠杆菌裂解物。
根据本发明的实施例，所述目标蛋白质编码核酸是以质粒的形式提供的。
根据本发明的实施例，所述的无细胞蛋白质表达体系包括：占体系总体积27％的大肠杆菌细胞提取物；1.2mm腺苷三磷酸(atp)；0.86mm鸟苷三磷酸(gtp)；0.86mm尿苷三磷酸(utp)；0.86mm胞苷三磷酸(ctp)；34.0μg/ml亚叶酸；170.0μg/ml大肠杆菌trna混合液；175mm谷氨酸钾；2.7mm草酸钾；10mm谷氨酸铵；12mm谷氨酸镁；20种l型氨基酸各2mm；0.33mm氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)；0.27mm辅酶a；1.5mm亚精胺；1mm腐胺；33.33mm磷酸烯醇式丙酮酸；13.3μg/ml质粒；10μmt7rnap；0.5μmif2；2μmif3；4μmef-tu；以及10μmrrf。以上比例的成份适宜蛋白质的高效表达。
根据本发明的实施例，通过在上述大肠杆菌无细胞蛋白质合成体系中额外加入终浓度为0.1-10μm的t7rnap、asprs、cysrs、if2、if3、ef-g、ef-tu、ef-ts、rf2、rf3或rrf中的任意一种蛋白质溶液的滴定实验发现增加上述任意一种蛋白对无细胞蛋白合成体系的绿色荧光蛋白(egfp)的生产有促进作用，其中加入t7rnap的效果尤为明显。
用途
在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的无细胞蛋白质表达体系在制备蛋白质中的用途。发明人经过实验证实，本申请所述的的无细胞蛋白质表达体系，能够提高无细胞蛋白质合成体系的蛋白产量；同时提升了蛋白质合成反应的速率。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
作为通过加入含有一种特定蛋白质的溶液提升无细胞蛋白质合成系统效率的实施例，使用大肠杆菌细胞提取物，实施了无细胞蛋白质合成。
大肠杆菌细胞提取物是根据上述在具体实施方法中的方案制备的。
而为了合成大肠杆菌无细胞蛋白质合成反应中编码蛋白质的mrna，利用了在原核表达系统中具有通用性的质粒pet28a(+)。作为编码目的蛋白的遗传基因，使用改造过的绿色荧光蛋白质(gfp)的遗传基因(egfp)，按照常规分子克隆方法插入到上述质粒中。编码t7rna聚合酶的遗传基因也按照常规分子克隆方法插入到上述质粒中，在大肠杆菌bl21(de3)中表达后，使用亲和层析获得纯化的t7rna聚合酶蛋白质，并测定其浓度。
然后，大肠杆菌细胞提取物占无细胞蛋白质合成系统体积的27％，系统中其他组分的最终浓度为：1.2mm腺苷三磷酸(atp)、0.86mm鸟苷三磷酸(gtp)、0.86mm尿苷三磷酸(utp)、0.86mm胞苷三磷酸(ctp)、34.0μg/ml亚叶酸、170.0μg/ml大肠杆菌trna混合液、175mm谷氨酸钾、2.7mm草酸钾、10mm谷氨酸铵、12mm谷氨酸镁、20种l型氨基酸各2mm、0.33mm氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)、0.27mm辅酶a、1.5mm亚精胺、1mm腐胺、33.33mm磷酸烯醇式丙酮酸、13.3μg/ml重组质粒和终浓度为0.5-25μm的t7rnap蛋白。在37℃反应4小时后，测定上述200μl蛋白质反应合成液在激发波长485nm，吸收波长535nm时的荧光强度，所合成的egfp的量通过酶标仪来进行测量计算。
作为对照，实施了不加入t7rnap蛋白质的无细胞蛋白质合成方法。在该方法中，除了不加入一定浓度的t7rnap蛋白质溶液以外，其他条件均与上述无细胞蛋白质合成方法相同。如图1(对照组：○，加入t7rnap组：●)所示，在加入t7rnap蛋白质溶液后，合成的egfp蛋白量相较于对照组显著提升，其中在加入的t7rnap浓度为10μm时提升幅度最大，合成egfp的量达到现有方法的1.9倍；如图2(对照组：-○-，加入10μmt7rnap组：-▲-)所示，测定反应不同时间长度的样品测定合成egfp蛋白质的量，可以看出加入10μmt7rnap的无细胞蛋白质合成体系合成egfp的速率较不加入蛋白液的对照组要快。
从以上的结果可以看出：(1)加入t7rnap蛋白液的大肠杆菌无细胞蛋白质合成方法，比现有的方法明显提高蛋白质的合成量；(2)其合成速率较现有方法更高。这也判明了采用该方法导致的合成量上升是由于相同反应时间内反应速率的提升所导致的；(3)额外加入t7rnap的终浓度为10μm对无细胞蛋白合成提升的提升最大。
实施例2
作为又一通过额外加入含有一种特定蛋白质溶液来提升无细胞蛋白质合成系统效率的实施例，进行了通过使用含有在实施例1中配制的大肠杆菌细胞提取物以及合成egfp的蛋白质合成溶液，按上述的方法配置无细胞蛋白质合成体系，分别加入终浓度0.5-10μm的asprs、cysrs、if2、if3、ef-g、ef-tu、ef-ts、rf2、rf3、rrf蛋白。在与实施例1相同的条件下进行反应，合成了蛋白质。所合成egfp量进行与实施例1相同的测定，其egfp生成量与加入蛋白的浓度关系如图2所示(其中实线表示对照组的egfp生成量)。
从图3的结果可以看出：(1)加入上述蛋白的大肠杆菌无细胞蛋白质合成方法，在一定浓度时，比现有的方法明显提高蛋白质的合成量；(2)其合成速率较现有方法更高。这也判明了采用该方法导致的合成量上升是由于相同反应时间内反应速率的提升所导致的；(3)额外加入蛋白质溶液对无细胞蛋白质合成系统促进最大的浓度分别为：asprs2μm、cysrs2μm、if20.5μm、if32μm、ef-g2μm、ef-tu4μm、ef-ts4μm、rf20.5μm、rf32μm、rrf10μm。
实施例3
作为通过加入含有多种特定蛋白质的溶液提升无细胞蛋白质合成系统效率的实施例，进行了通过使用含有在实施例1中配制的大肠杆菌细胞提取物以及合成egfp的蛋白质合成溶液，按上述的方法配置无细胞蛋白质合成体系，加入含有终浓度分别为10μm、0.5μm、2μm、4μm、10μm的t7rnap、if2、if3、ef-tu、rrf五种蛋白质的混合溶液。在与实施例1相同的条件下进行反应，合成了蛋白质。所合成egfp量进行与实施例1相同的测定，其结果如图3a所示。
如图4(对照组：□，加入五种蛋白质：■)所示，反应4小时后加入含五种特定蛋白质的溶液的无细胞蛋白合成系统合成egfp的量是未加入蛋白对照组的2.5倍。合成egfp量随时间的变化趋势如图5(对照组：-○-，加入五种蛋白质：-●-)所示，结果表明加入含五种特定的溶液的无细胞蛋白合成系统合成效率明显高于未加入组。
如上所述，证实了(1)在无细胞蛋白质合成方法中加入上述实施例1和2中提到的多种蛋白质可以提高蛋白质的合成量(2)加入本发明所提到的多种蛋白对无细胞蛋白合成系统的效率提升优于只额外加入某一种蛋白质的系统。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。