本发明属于生物医学领域，具体涉及一种hpvl1重组微环dna的卵黄抗体及其在预防/治疗hpv感染的应用。
背景技术：
宫颈癌占女性妇科恶性肿瘤的第二位，现已成为威胁女性健康的重要疾患，中国每年死于宫颈癌的人数将近5万，宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，研究发现引起宫颈癌的关键是hpv的感染。hpv属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是球形、双链环状dna病毒。hpv主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。hpv的感染有宿主特异性和组织特异性，只能感染人类的皮肤和粘膜受损的基底细胞。
hpv经损伤的宫颈粘膜首先感染基底细胞层，病毒以少量游离dna状态潜伏在基底细胞内，以实现免疫逃逸。当基底细胞不断分化、成熟、向粘膜表层迁移，hpv病毒就大量增殖。随着粘膜表层上皮细胞的凋亡，病毒颗粒大量释放到上皮表面，作为新的感染源可进一步加重感染。长期hpv持续感染导致宿主细胞相关基因表达发生变化，可逐渐发展为宫颈癌。
hpv至今已鉴定明确的大约有200多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型hpv(hr-hpv)和低危型hpv(lr-hpv)，其中hr-hpv15种，包括hr-hpv16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌。其中hpv16和hpv18是最主要的流行株。
hpvl1衣壳蛋白是人乳头瘤病毒的主要结构蛋白,是病毒感染细胞和细胞免疫反应攻击病毒的主要靶位，且该蛋白较为保守。因此可以针对l1蛋白开发预防/治疗hpv感染的药物。
卵黄抗体(immunoglobulinofyolk,igy)为通过免疫注射产蛋鸡，由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗。dna核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(igy)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。而目前尚无核酸抗原免疫获得的hpvl1卵黄抗体用于预防宫颈癌的先例。
目前临床上对宫颈粘膜细胞内hpv病毒无有效治疗方法。若能够在病人hpv阳性时使其快速转阴，无疑将在很大程度上降低病人由hpv阳性转为宫颈癌的风险。
因此开发一种核酸抗原免疫获得的hpvl1卵黄抗体以及其在预防/治疗hpv感染中的应用，对于宫颈癌易感者的预防以及hpv阳性患者快速转阴具有重大意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组hpvl1片段，其选择的hpvl1保守性强。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
重组hpv16l1片段，其由以下部分依次连接组成：信号肽序列区、hpv16亚型的l1基因、标签区；所述hpv16亚型的l1基因序列为seqidno:1所示。
hpvl1衣壳蛋白是人乳头瘤病毒的主要结构蛋白,是病毒感染细胞和细胞免疫反应攻击病毒的主要靶位。hpv-16和18菌株的l1蛋白较保守，具有较多相同的抗原表位，并有文献报道免疫hpv-16l1vlp也能交叉保护hpv-18，且l1蛋白比较大。基于以上考虑，本发明的重组hpvl1片段含全长的hpv16l1蛋白基因。
由信号肽序列表达的信号肽诱导l1蛋白分泌至细胞外，从而增强抗原特异性体液免疫应答及细胞免疫应答。
作为优选的方案，上述信号肽序列区为选自组织型纤溶酶原激活物tpa、hsvgds及生长激素的分泌信号肽对应的核苷酸序列中的一种或多种。
进一步优选的，上述信号肽序列区为组织型纤溶酶原激活物tpa。进一步，其核苷酸序列如seqidno:2所示。
作为优选的方案，上述标签区为his标签，标签区的核苷酸序列如seqidno:3所示。
作为优选的方案，上述hpv-l1重组片段末端为终止密码子。
综上，作为最优选，本发明的hpv-l1重组微环dna的hpv-l1重组片段的核苷酸序列如seqidno:4所示。
本发明的目的之二在于提供一种核酸抗原，其为包含hpv-l1的重组微环dna，微环dna作为hpv-l1重组片段的载体具有稳定、安全的优点。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种hpv-l1重组微环dna，其连接有目的一的hpv-l1重组片段。
微环dna是亲本质粒(parentalplasmid，pp)体内位点特异性重组的产物。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中间的dna序列切断，亲本质粒被分成2个超螺旋分子，即具有复制功能的小质粒(miniplasmid，mp)和携带真核表达框的微环(minicircle，mc)dna。
微环dna是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性，可在体内长期表达高水平的转基因产物。mc在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与共价键密闭环状dna(cccdna)相同，使mc成为安全、高效的理想载体。
与传统质粒和病毒载体比较，微环dna在动物细胞内表达外源基因具有一系列独特的优势：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)去除了传统质粒中的抑制信号，表达外源基因较传统质粒稳定，高效。
因此本发明的重组微环dna具有安全、稳定、高效、产业化生产成本低的优点。
本发明的重组微环dna的制备方法,包括以下步骤：
1)设计两端加bglii和sali酶切位点的hpv-l1重组片段，并合成，得目的基因；
2)将上述目的基因片段和zy781载体用bglii和sali同时双酶切，胶回收后按常规方法将目的片段克隆至载体zy781的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本质粒(pp)；
3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌zycy10p3s2t，过夜培养，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
4)将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/mlkana的tb培养液中，37℃，250rpm过夜培养；
5)取过夜培养的菌液与minicleinductionmix按等体积混合，于32℃，250rpm反应5h-8h。反应完结束后，离心，提取质粒，即为重组微环dna质粒。其结构见附图1。
本发明的目的之三在于提供一种重组微环dna作为核酸抗原制备的卵黄抗体，其抗体效价高，特异性强。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的目的二的重组微环dna作为核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡，获得卵黄抗体(igy)。
dna核酸抗原肌肉注射免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(igy)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。
因此本发明的hpvl1的卵黄抗体采用重组微环dna作为核酸抗原免疫获得，具有抗体效价高，特异性强的优点。
本发明的目的之四在于提供一种上述hpvl1的卵黄抗体的制备方法，其制备较为简单，且成本较低。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的hpvl1的卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)目的二的重组微环dna作为抗原，免疫产蛋鸡；
2)取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄；
3)纯化蛋黄中的所述重组微环dna的卵黄抗体。
卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而igy是γ卵黄球蛋白。因此igy的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离igy。
已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以peg、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。
工业上大规模生产igy的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法。
本发明的目的之五在于提供一种上述卵黄抗体在用于制备预防/治疗hpv感染的药物的用途，其制备的药物具有效价高、特异性强，以及抗体能够直接中和hpv病毒，对于未感染hpv病毒的人群起到预防作用，并能够使hpv阳性患者快速达到阳转阴，以防持续感染造成宫颈癌的发生。
本发明的目的之六在于提供一种预防/治疗hpv感染的药物，其包含hpvl1卵黄抗体，具有安全、直接中和细胞内的hpv病毒的优点。
作为优选的方案，上述预防/治疗hpv感染的药物为阴道用药，包括阴道洗剂、阴道凝胶或阴道栓剂等。上述药物可用于易感染hpv女性的预防，以及hpv阳性女性的快速阳转阴。对于宫颈癌的预防有重要意义。
本发明的目的之七在于提供转一种用于预防/治疗hpv感染的组合物，其包含上述卵黄抗体，并能够完成卵黄抗体的跨膜转运，使其直接进入细胞内，中和细胞内的hpv病毒。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种用于预防/治疗hpv感染的组合物，该组合物的活性成分为选自上述的卵黄抗体或制备所述卵黄抗体的重组微环dna免疫的鸡的蛋黄的水溶性成分的一种或多种；所述组合物还包含脂质体。
脂质体(liposome)是由磷脂及其他附加成分形成的一种双分子层小囊泡。由于这种双分子膜层具有生物膜特征,可与细胞融合,将脂质体囊泡中包裹的药物或其他成份导入细胞中。脂质体常作为核酸载体将其导入细胞，目前脂质体作为蛋白载体导蛋白入细胞技术也逐渐得到重视。脂质体可以与细胞膜融合而只将蛋白导入细胞。
本发明通过脂质体方法，实现抗体的跨膜转运，使抗体直接中和细胞内的hpv病毒，解决了目前临床上对宫颈粘膜细胞内hpv病毒无有效治疗方法的难题。同时，卵黄抗体还可中和被侵染局部新释放的病毒，使其丧失通过性接触等途径传染的能力，使患者快速达到阳转阴。
作为优选的方案，上述脂质体为纳米脂质体。
作为优选的方案，上述组合物还包含乳糖。
作为优选的方案，上述组合物包含抗菌剂聚己亚甲基盐酸盐(phmb)。
本发明的目的之八在于提供一种上述组合物在用于制备预防/治疗hpv感染的药物的用途。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
上述组合物在本发明的卵黄抗体的基础上添加脂质体，使脂质体包裹抗体完成跨膜转运进入细胞，可直接中和细胞内的hpv病毒，使患者hpv阳转阴。因此上述组合物用于制备预防/治疗hpv感染的药物，对易感染和已感染女性预防宫颈癌有重要意义。
作为优选的方案中添加的聚已亚甲基盐酸(phmb)是一种被公认为21世纪最安全高效的广谱抗菌剂，无色无味，抑菌浓度低，广谱低毒，作用速度快，泡沫量低，并且能够在物品/皮肤表面形成一层阳离子持续长时间的抑菌。
本发明的目的之九在于提供一种预防/治疗hpv感染的药物，其包含上述的组合物以及药学可接受的载体。
作为优选的方案，上述药物为阴道用药，包括阴道洗剂、阴道凝胶和阴道栓剂。
本发明的有益效果在于：1)本发明提供的hpvl1重组微环dna包含hpv16的l1基因片段以及信号肽序列，可作为核酸抗原引起机体免疫反应。2)dna核酸抗原免疫产蛋鸡所获得的卵黄抗体(igy)的生物活性远超一般技术(皮下注射蛋白抗原)制备的卵黄抗体，抗体效价更高，特异性更强。3)本发明的卵黄抗体可用于制备预防/治疗hpv感染的药物，阴道用药对hpv阳性患者输入高活性抗hpv抗体。4)结合纳米脂质体的方法，本发明的卵黄抗体跨膜进入细胞，直接中和细胞内的hpv病毒，使患者快速达到阳转阴。因此本发明的卵黄抗体对于预防宫颈癌有重要意义。
附图说明
图1为hpvl1重组微环dna结构示意图。
具体实施方式
以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1卵黄抗体的制备
1.重组微环dna的制备
1)设计两端加bglii和sali酶切位点的hpv-l1重组片段，并合成，得目的基因；
2)将上述目的基因片段和zy781载体用bglii和sali同时双酶切，胶回收后按常规方法将目的片段克隆至载体zy781的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本质粒(pp)；
3)用上述亲本质粒转化大肠杆菌zycy10p3s2t，过夜培养，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；
4)将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/mlkana的tb培养液中，37℃，250rpm过夜培养；
5)取过夜培养的菌液与minicleinductionmix按等体积混合，于32℃，250rpm反应5h-8h。反应完结束后，离心，提取质粒，即为重组微环dna质粒。其结构见附图1。
其中minicleinductionmix：向100mllb中加入1mnaoh4ml和20％阿拉伯糖200μl，混合后经0.22μm滤膜过滤。
2.卵黄抗体的制备
1)上述重组微环dna作为核酸抗原，免疫产蛋鸡：首次免疫,将抗原与等体积弗氏完全佐剂混合乳化,免疫方式为鸡翅根处肌肉注射；初次免疫三周后进行第二次免疫,抗原与等体积的弗氏不完全佐剂混合,剂量与第一次相同；二周后,进行第三次免疫,方法与第二次免疫相同；三次免疫后，每2个月强化免疫1次，使抗体维持在一个较高的水平。
2)取免疫后的产蛋鸡的鸡蛋，获得蛋黄：免疫1周后，收集鸡蛋并做好标记；把鸡蛋的蛋清去除得到卵黄后在双蒸水中漂洗，再将卵黄膜剥去，尽量得到纯卵黄液。
3)纯化蛋黄中的所述重组微环dna的卵黄抗体：取1体积蛋黄液加9倍体积的蒸馏水，用hcl调节ph至5.0；4℃放置过夜，所得上清液即为鸡卵黄的水溶性部分(wsf)，igy便包含在wsf中；采用硫酸铵沉淀法，其具体步骤如下：
①50％饱和硫酸铵溶液配制：取固体硫酸铵21.9g溶于100ml蒸馏水中即成。
②将50％饱和硫酸铵溶液缓慢加入到wsf中，使硫酸铵溶液与wsf的体积比为3：1，混合后室温过夜，使igy沉淀在这种高盐的条件下。
③次日，将混合溶液于4℃下8000r/min离心20min,弃上清，保留沉淀，igy抗体就在其中。
④用0.1mol/l的pbs溶液将所得沉淀溶解，于截流分子量为10kd
的透析袋中，4℃蒸馏水中透析过夜，中间换液2～3次。
⑤收集透析过夜的igy抗体，即为本发明的hpvl1卵黄抗体。
实施例2预防/治疗hpv感染的凝胶及其效果评价
1.成分：hpvl1鸡卵黄抗体(含纳米脂质体)、phmb、乳糖、甘油、蒸馏水。
使用阴道凝胶剂型对患者输入高活性抗hpv抗体，通过纳米脂质体方法，实现抗体的跨膜转运，使抗体直接中和细胞内的hpv病毒，解决了目前临床上对宫颈粘膜细胞内hpv病毒无有效治疗方法的难题。同时，卵黄抗体还可中和被侵染局部新释放的病毒，使其丧失通过性接触等途径传染的能力。
ph为5.0，呈弱酸性，阴道内环境同样偏酸性，避免对阴道内环境稳态的破坏。
除阴道凝胶外，本发明的鸡卵黄抗体还可用于制备阴道洗液或阴道栓剂。
2.临床试验报告
①试验对象：选择hpv阳性患者72例，年龄23-58岁。纳入标准包括：一过性感染、持续或反复感染患者，包括部分轻度细胞学改变(cinⅱ级以下)的患者，剔除cinⅲ以上、罹患宫颈癌以及宫颈癌术后患者。
②试验过程
单位：山东省荣成市人民医院
标本采集：在患者非月经期取样，取样前避免阴道内用药；使用获得药监局认证的专用一次性宫颈细胞取样系统进行取样，切忌使用棉拭子取样；检测所需样本为宫颈脱落细胞而非宫颈分泌物，取样前一定要求使用棉拭子将宫颈分泌物擦拭干净，尽量避免样本中含过多的血液及黏液；按照厂家提供一次性宫颈细胞取样系统说明书进行取样。
治疗周期：使用本发明的凝胶，连续使用3个月，第一个月除月经期及经期前后各3天外，连续使用本产品18天，每天1支；第2、3月隔日使用。停用2个月后复查。
疗效观察指标：采用广东凯普生物科技股份有限公司的检测产品21种hpv分型检测试剂盒(pcr+膜杂交法)对hpv阳性患者治疗前后进行检测，判定hpv阳转阴的情况并记录。
临床试验结果：
表1试验结果
本次临床试验纳入病人72例，其中单一型hpv感染者39例，两型及以上hpv感染者29例(总感染hpv亚型计数为67)。由此，72例感染者所感染hpv总亚型数量为110。
临床试验过程中，所有全转阴病例数量为62例，转阴率为86.1％，所有hpv亚型的转阴率为86.4％。实验结果针对“hpv感染全部亚型的转阴率”作为评价本产品的治疗效果更合理，即86.4％。
由此本发明的卵黄抗体用于制备的预防/治疗hpv感染的药物对于hpv阳性患者阳转阴有明显效果，hpv感染全部亚型的转阴率86.4％。对于阳性患者转阴，避免宫颈癌的发生有重要作用。同样，对于hpv易感者预防hpv感染同样能够发挥作用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>江苏润洁生物科技有限公司
<120>保护性hpv卵黄抗体及其应用
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