专利名称：特异性抗幽门螺杆菌卵黄抗体、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其应用，特别是涉及一种抗幽门螺杆菌特有抗原的复合卵黄抗体的制备及其在食品、保健食品和医药上的应用。
背景技术：
1982年，Warren和Marshall从一名十二指肠溃疡患者的胃活检组织中分离到一种新的细菌，现称之为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，简称HP)，并提出它就是消化性溃疡的致病因子。经过十四年的研究证实了这个假说。1994年2月，在美国国立卫生研究院(NIH)主持的一次专题会议上，一个独立的专家小组宣布消化性溃疡是一个感染性疾病，建议用抗菌素治疗替代以往的制酸治疗。
幽门螺杆菌感染遍及全球，经济不发达地区感染率高，并随年龄增长而递增。感染持续时间也很长，甚至终生。发展中国家的感染率高于发达国家，中国的感染率约为70％。幽门螺杆菌感染后常导致持续数周至数月的急性胃炎，然后发展为慢性活动性胃炎，它常持续终生。在感染后的数年至数十年里，慢性胃炎可以无症状，也可发展为消化性溃疡、萎缩性胃炎甚至胃癌。研究表明90％以上的十二指肠溃疡，70％以上的胃溃疡是由幽门螺杆菌感染所致，胃癌的发生也与幽门螺杆菌感染有关。
目前幽门螺杆菌感染一般采用抗菌素治疗，常规是三联疗法，疗程不超过14天。但抗菌素治疗存在许多缺点，如疗程长毒副作用大，因耐药的幽门螺杆菌的产生感染易反复。因此，医药界都在寻求更彻底更有效的解决方法，如疫苗和抗体等生物治疗手段。
鸡卵黄免疫球蛋白G抗体是一种7S免疫球蛋白.与哺乳动物IgG略有不同。该蛋白质分子量约为180kDa，含两个亚单位，即67-70kDa的重链和22-30kDa的轻链，又称IgY(Yolk Immlmoglobulin)，存在于免疫后母鸡的卵黄中。实验证明。受免疫刺激后，母鸡产生免疫反应，在输卵管内卵黄成熟期，血液中IgG可被选择性地转移到卵黄中，而且是卵黄中唯一的免疫球蛋白类。
因IgY抗体耐酸、耐热且性能稳定，可经口服用于预防或治疗年幼动物或人类的肠道传染病，如婴儿防病食品，龋齿预防，新生乳猪致死性大肠杆菌感染的预防，以及鱼病治疗等。特别是抗生素或其它药物的使用存在问题时，IgY成为首选。Farrely等用产毒性大肠杆菌免疫制备特异屯Y抗体经口给药预防兔腹泻病。其中阴性对照组在用产毒性大肠杆菌攻击后，72h内全部发生严重腹泻；实验组在攻击前4天开始喂饲卵黄，攻击后未见明显不良反应。实验还表明正常卵黄有部分保护作用4只家兔喂以正常卵黄，其中3只发展为中度腹泻，1只完全正常，不发病。该研究小组还进行了体外实验，表明1，IgY干扰E.coli与提纯的小肠粘膜蛋白结合；2，IgY的此项干扰作用优于鸡血清IgG抗体。Yokoyama等进行了IgY经口服抗感染的保护性试验。4日龄新生小牛经口接种致死性伤寒沙门氏菌，并在同一天开始给予IgY口服，每日3次连服7-10天。结果对照组小牛全部死亡，低剂量IgY组死亡率60％-100％，高剂量组无一死亡，仅出现发热或腹泻，成功地用IgY抗小牛致死性伤寒沙门氏茵感染。Robert用卵黄及其提取物成功地抑制组织细胞培养的轮状病毒生长。在感染动物实验模型中，特异IgY可防止动物发展为轮状病毒性胃肠炎，表明卵黄提取物可作为抗病毒抗体来源，防治婴幼儿轮状病毒腹泻。
用HP免疫产蛋鸡制备IgY的研究也有少量报道，但他们所用抗原为HP全菌抗原或粗提抗原，其结果是特异性差，口服后易于人体肠道正常菌群起反应，引起肠道菌群生态失衡。
发明的内容本发明所要解决的技术问题之一是克服了现有技术中存在的不足，提供了一种含有抗幽门螺杆菌(HP)特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)的鸡蛋。
本发明所要解决的技术问题之二是提供上述含有抗幽门螺杆菌(HP)特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)鸡蛋的生产方法。
本发明所要解决的技术问题之三是克服了现有技术中存在的不足，提供了一种抗HP特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)。
本发明所要解决的技术问题之四是提供上述抗--HPSlgY的生产方法。
本发明所要解决的技术问题之五是提供上述含抗HP特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体的鸡蛋在食品、食品添加剂、医药、保健食品和诊断中的应用。
本发明所要解决的技术问题之六是提供上述抗--HPSlgY在食品、食品添加剂、医药、保健食品和诊断中的应用。
本发明解决上述技术问题之一的技术方案是一种含有抗幽门螺杆菌(HP)特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)的鸡蛋，所述鸡蛋是用HP复合抗原免疫下蛋鸡所产的蛋。它的生产是按如下步骤完成(1)采用基因工程重组方法制备HP特有的蛋白质抗原；(2)免疫产卵母鸡选用10-40周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2-8个，免疫用抗原浓度为100-500μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100-600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所产的鸡蛋。
本发明解决上述技术问题之二的技术方案是含有抗幽门螺杆菌(HP)特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)鸡蛋的生产方法，它的生产方法包括如下步骤(1)采用基因工程重组方法制备HP特有的蛋白质抗原；(2)免疫产卵母鸡选用10-40周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2-8个，免疫用抗原浓度为100-500μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100-600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所产的鸡蛋。
所述HP特有的蛋白质抗原包括尿素酶B亚单位(urease β-subunit，UreB)、热休克蛋白60(heat-shock protein 60，Hsp60)、细胞毒素相关蛋白A(Cytotoxin associated gene A，CagA)、细胞空泡毒素A蛋白(vacuolating cytotoxin A，VacA)。所述HP特有的蛋白质抗原是采用基因工程重组方法获得。
本发明解决上述技术问题之三的技术方案是一种抗HP特有的蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)，所述抗体只与HP或HP特有的抗原起抗原抗体反应，而不与人体肠道的的正常菌群或其抗原起抗原抗体反应。它的制备方法包括如下步骤(1)采用基因工程重组方法制备HP特有的蛋白质抗原；(2)免疫产卵母鸡选用10-40周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2-8个，免疫用抗原浓度为100-500μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100-600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所产的鸡蛋；(4)从免疫鸡蛋黄中分离纯化抗体。
本发明解决上述技术问题之四的技术方案是抗--HPSlgY的生产方法，它的制备方法包括如下步骤(1)采用基因工程方法制备HP特有的蛋白质抗原；(2)免疫产卵母鸡选用10-40周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2-8个，免疫用抗原浓度为100-500μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100-600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所产的鸡蛋；(4)从免疫鸡蛋黄中分离纯化抗体。
本发明所提供的上述含抗HP特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)鸡蛋和抗-HPSlgY抗体可广泛应用于食品、食品添加剂、医药和保健食品中，对防治幽门螺杆菌感染引起的相关疾病具有良好的效果。由于免疫下蛋鸡所用的抗原是采用基因工程重组方法获得的，而且是HP特有的，与现有技术相比，本发明的优点是特异性好，即所述抗体只与HP起抗原抗体反应，从而起到杀灭HP或阻止HP感染的作用，而不会对人体肠道的正常菌群起破坏作用。另外本发明采用母鸡所产鸡卵为载体，安全无毒，易于产业化，成本低。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明的作进一步的说明实施例1抗HP特有的蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)可以通过以下步骤获得(1)采用基因工程方法制备HP特有的蛋白质抗原；(2)免疫产卵母鸡选用10-40周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2-8个，免疫用抗原浓度为100-500μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100-600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所产的鸡蛋；(4)从免疫鸡蛋黄中分离纯化抗体。
实施例2用基因工程重组方法制备HP特有的蛋白质抗原用胃镜从HP感染阳性的胃溃疡患者夹取胃粘膜组织，涂布于HP选择培养布氏琼脂平皿上，37℃微需氧培养5天，收集菌落，常规方法抽提HP的DNA，PCR扩增HP的UreB、Hsp60、CagA、VacA基因，将上述4条基因克隆到大肠杆菌表达质粒中，重组质粒转化大肠杆菌，发酵重组大肠杆菌，用色谱法纯化大肠杆菌中的UreB、Hsp60、CagA、VacA蛋白。
实施例3免疫产卵母鸡选用10周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2个，免疫用抗原浓度为100μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；实施例4免疫产卵母鸡选用40周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为8个，免疫用抗原浓度为500μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；实施例5免疫产卵母鸡选用30周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为4个，免疫用抗原浓度为200μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为400μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；实施例6从免疫鸡蛋中分离蛋黄采集含抗--HPSlgY免疫蛋，分离蛋黄，喷雾干燥得含抗-HPSlgY的蛋黄粉。
实施例7纯化抗体采集含抗--HPSlgY免疫蛋，分离蛋黄并用10倍的水溶解，调节pH值至5.0，4℃放置8小时，沉淀去除脂蛋白后即得到鸡卵黄水溶性部分(WSF)，用浓度为40％的硫酸铵沉淀，沉淀物用适量生理盐水溶解，并在生理盐水中透析24小时，冷冻干燥即得到抗-HPSlgY。
实施例8取实施例1、6、7中任何一种产品进行IgY效价测定采用单向免疫扩散法进行IgY效价测定，IgY效价为1∶512-1∶32768。
实施例9每100克奶粉中加入10克含抗-HPSlgY的蛋黄粉，所得产品可用于婴幼儿和成人预防HP感染，或已感染HP的患者的辅助治疗。
实施例10每100克奶粉中加入1克纯化的抗-HPSlgY冻干粉，所得产品可用于婴幼儿和成人预防HP感染，或已感染HP的患者的辅助治疗。
实施例11每100ml鲜奶中加入1克纯化的抗-HPSlgY冻干粉，所得产品可用于婴幼儿和成人预防HP感染，或已感染HP的患者的辅助治疗。
实施例12抗-HPSlgY冻干粉与猴头菇多糖按1∶5的比例混合，灌装胶囊，可用于保护胃粘膜的保健食品。
实施例13抗-HPSlgY冻干粉加制剂辅料，灌装胶囊，可用于治疗HP感染的药物。
权利要求
1.一种含有抗幽门螺杆菌(HP)特有蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗-HPSlgY)的鸡蛋，其特征是，所述鸡蛋是用HP复合抗原免疫下蛋鸡所产的蛋。
2.根据权利要求1所述的鸡蛋，其特征是，它的生产方法包括如下步骤(1)采用基因工程重组方法制备HP特有的蛋白质抗原；(2)免疫产卵母鸡选用10-40周龄健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2-8个，免疫用抗原浓度为100-500μg/ml，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100-600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所产的鸡蛋。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述HP特有的蛋白质抗原包括尿素酶B亚单位(ureaseβ-subunit，UreB)、热休克蛋白60(heat-shock protein60，Hsp60)、细胞毒素相关蛋白A(Cytotoxin associated gene A，CagA)、细胞空泡毒素A蛋白(vacuolating cytotoxin A，VacA)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述HP特有的蛋白质抗原是采用基因工程重组方法获得。
5.一种抗HP特有的蛋白质抗原的复合卵黄抗体(抗--HPSlgY)，其特征是，所述抗体只与HP或HP特有的抗原起抗原抗体反应，而不与人体肠道的正常菌群或其抗原起抗原抗体反应。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征是，所述抗体能特异地与HP的UreB、Hsp60、CagA、VacA抗原起特异的抗原抗体反应。
7.根据权利要求5所述的抗体，其特征是，它的制备方法包括如下步骤(1)采用基因工程方法制备HP特有的蛋白质抗原；(2)免疫产卵母鸡选用10-40周龄(30)健康产卵母鸡隔离饲养，进行鸡皮下注射，每只母鸡注射点为2-8个，免疫用抗原浓度为100-500μg/ml(200)，并加等量福氏佐剂，每只母鸡每次免疫剂量为100-600μg抗原，首次免疫后，每两周加强免疫一次，共计免疫8次；(3)收集最后一次免疫之后所产的鸡蛋；(4)从免疫鸡蛋黄中分离纯化抗体。
8.权利要求1所述的鸡蛋在下列领域但不限于中的应用食品、食品添加剂、医药、保健食品和诊断。
9.权利要求5所述的抗体在下列领域但不限于中的应用食品、食品添加剂、医药、保健食品和诊断。
全文摘要
本发明公开了一种特异性抗幽门螺杆菌卵黄抗体、制备方法及其应用。采用多价基因重组的HP特有蛋白质抗原，免疫产卵母鸡，并从其产出的卵中提取复合卵黄抗体(抗－HPSlgY)。应用本发明将含复合卵黄抗体(抗－HPSlgY)的蛋黄粉添加于食品或制成保健食品，可用于辅助防治因幽门螺杆菌感染引起的相关疾病；纯化后复合卵黄抗体(抗－HPSlgY)可制成药品，用于防治因幽门螺杆菌感染引起的相关疾病。
文档编号A61P31/00GK1594362SQ03150870
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月9日 优先权日2003年9月9日
发明者许春娣, 徐帆洪 申请人:上海立泰哲田生命科技有限公司