本发明属于工业微生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸所用的菌株及其生产方法。
背景技术：
：丁二酸又称琥珀酸(Succinicacid)，是一种重要的C4平台化合物，是1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、己二酸等重要大宗化学品和专用化学品的基本原料，广泛应用于食品、塑料、医药、香料等工业，可以取代苯合成250种以上的化工产品。其中最具有发展前景的领域为合成塑料，它是合成聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚乙二醇丁二酸酯(PES)、聚丙二醇丁二酸酯(PPS)等可生物降解高分子材料的主要原料。2004年，美国能源部公布的12种最有潜力大宗产品中，丁二酸排在首位。据透明度(Transparency)预测：到2018年丁二酸产量将超过25万吨，市场价值达8.326亿美元，年均增长率达19.4％。如果进一步降低成本将可能有超过400万吨的市场容量，市场前景巨大。目前，丁二酸的主要生产方法是以石油为原料化学法合成，不仅需要消耗大量不可再生的石化原料，生产成本较高，而且环境污染严重，从而限制了丁二酸的广泛应用。但随着石油资源日益枯竭以及环境污染日益严重等问题出现，化学法合成受到限制。与化学合成法相比，微生物发酵法具有以下优点：(1)原料为价格低廉、可再生的生物质资源；(2)发酵过程中可吸收大量CO2，绿色环保；(3)发酵条件温和。因此，微生物发酵法近年来备受瞩目，成为近年来国内外的研究热点。丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌代谢的重要中间产物。目前人们已经发现多种微生物可以通过发酵来生产琥珀酸，其中研究主要集中在产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)和大肠杆菌(E.coli)。此外，曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimiasucciniciproducens)，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)和一些乳酸菌、丙酸产生菌及真菌等也可以产生少量的丁二酸。在众多的产琥珀酸的微生物中，产琥珀酸放线杆菌能够利用多种碳源(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖等)进行发酵，并且可以耐受葡萄糖和丁二酸的浓度分别高达158g/L和104g/L。因此，该菌以丁二酸产量高、耐受性强等优点，成为目前丁二酸最具工业化潜力的生产菌株之一。目前，有关发酵生产丁二酸的所用的原料除葡萄糖外，主要为粮食原料，如美国Argonne实验室进行了玉米生产丁二酸研究，日本味之素和三菱化学公司共同联合开展以玉米淀粉为原料发酵生产丁二酸的研究。但由于近几年粮食原料的生物工业的蓬勃发展，粮食出现短缺，价格上涨趋势明显，此外过度依赖粮食也会影响国家的粮食安全，所以使用价格低廉的农业废弃物为原料进行丁二酸发酵是降低丁二酸生产成本的关键之一。韩国LeePC报道了以ManheimiasucciniciprducensMBEL55E发酵乳清原料生产丁二酸；日本科学家Inui等利用纤维素水解液生产丁二酸；江南大学孙志浩等以糖蜜、芭蕉芋等原料进行了发酵丁二酸研究；南京工业大学姜岷及合肥工业大学姜绍通等对纤维素原料生产丁二酸进行报道；广西科学院申乃坤等对产琥珀酸放线杆菌高产菌株选育、以木薯、甘蔗糖蜜及浮萍为原料发酵产丁二酸等方面进行了系统研究。但与化学合成法相比，丁二酸生产成本仍然偏高，需要进一步探索更为低廉的丁二酸生产原料。生物柴油生产过程中副产物粗甘油约占10％，随着生物柴油产量的不断增加，副产物粗甘油的产量也迅速增加，如何对副产物粗甘油进行开发利用，已成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障。如果能够将副产物粗甘油发酵生产高附加值的丁二酸，就能有效降低生物柴油生产成本，提高资源利用率，延伸产业链，降低丁二酸生产成本，同时提升生物柴油产业的整体技术水平和循环效益。技术实现要素：本发明的目的是针对现在丁二酸发酵生产中原料成本过高的问题，提供一种生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸所用的菌株及其生产方法。本发明通过以下技术方案实现：一种生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸所用的菌株，该菌株为产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)XT，保藏编号为CCTCCNO：M2016397。本发明产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)XT，保藏日期为2016年7月19日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2016397。本发明还提供一种生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，包括应用保藏编号为CCTCCNO：M2016397的产琥珀酸放线杆菌XT发酵生产丁二酸。运用本发明得到的产琥珀酸放线杆菌XT，将生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，包括以下步骤：将平板上的产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养16-20h，然后按5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按5-10％(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在5.5-7.0，在充满N2或CO2的环境中，在30-38℃分批发酵或分批补料发酵40-84h，即得丁二酸。作为本发明的进一步说明，所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。作为本发明的进一步说明，分批发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：粗甘油30-100g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，二甲基亚枫0-20g/L，碳酸氢钠2-10g/L，氯化钙0.3-1.0g/L，氯化镁0.3-1.0g/L。作为本发明的进一步说明，分批补料发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：初始粗甘油20-30g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氢钾2-10g/L，二甲基亚枫0-20g/L，碳酸氢钠2-10g/L，氯化钙0.3-1.0g/L，氯化镁0.3-1.0g/L，通过补料的方式维持罐内粗甘油浓度在20-30g/L，补料用粗甘油浓度为500g/L。作为本发明的进一步说明，所述氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉中的一种或几种以任意比例混合。作为本发明的进一步说明，所述pH调节剂是碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠中的一种或几种以任意比例混合，总浓度为20-80g/L。作为本发明的进一步说明，分批发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：粗甘油50g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾8g/L，二甲基亚枫10g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.6g/L。作为本发明的进一步说明，分批补料发酵时所述发酵培养基的成分及浓度为：初始粗甘油25g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾8g/L，二甲基亚枫10g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.6g/L，通过补料的方式维持罐内粗甘油浓度在25g/L，补料用粗甘油浓度为500g/L。与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：1、本发明采用生物柴油副产物粗甘油作为发酵的原料，发酵中不需要添加糖类，降低了生产成本，提高了粗甘油的利用率，延伸生物柴油产业链，提升了生物柴油产业的整体技术水平和循环效益。2、本发明的菌株利用生物柴油副产物粗甘油生产丁二酸，生产方法简单、高效，丁二酸产量最高可达72g/L，产率最高可达95％。3、本发明的产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397可以充分利用生物柴油副产物粗甘油生产丁二酸，既降低了丁二酸生产成本，又实现工业废弃物粗甘油的高效资源化利用，解决了生物柴油副产物甘油排放带来的环境问题，在废弃资源的有效利用和环境保护方面都具有重要意义。附图说明图1为本发明产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397扫描电镜照片(放大4×104倍)。具体实施方式以下是产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397的选育、鉴定、利用生物柴油副产物粗甘油生产丁二酸的具体实施例。实施例1产琥珀酸放线杆菌的选育和鉴定1、产琥珀酸放线杆菌的定向进化选育的方法为：先利用10g/L的甘油替换种子液的葡萄糖为碳源作为定向进行的培养基，接种后放置于厌氧培养箱，37℃培养12-18h进行传代，培养7-10天后甘油浓度增加至20g/L，依次类推，大约驯化90天后，培养基的甘油浓度可提高至80g/L选育获得一株产琥珀酸放线杆菌XT，该菌株可在甘油浓度80g/L培养集中生长良好。2、将上述选育得到的产琥珀酸放线杆菌XT进行16SrDNA基因鉴定，以及按照《伯杰式细菌鉴定手册》进行生理生化鉴定，结果如下：产琥珀酸放线杆菌XT与菌株产琥珀酸放线杆菌GXAS137相似度为100％，与菌株产琥珀酸放线杆菌130Z相似度为99.5％，经过形态及生理、生化鉴定：产琥珀酸放线杆菌XT属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧，细胞呈短杆状，无鞭毛，无芽孢，不运动，也不产生孢子，能利用常见的大多数碳源产丁二酸。由以上鉴定结果，可以认定产琥珀酸放线杆菌XT属于巴斯德菌属科(Pasteurellaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)。现已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2016397，保藏日期为2016年7月19日。实施例2运用产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397，将生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，其步骤如下：(1)种子培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。(2)发酵培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到发酵培养基：粗甘油30g/L，氮源5g/L，磷酸二氢钾2g/L，二甲基亚枫0g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L。以上所述氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉以任意比例混合。以上所述pH调节剂为碱式碳酸镁、碳酸钠以任意比例混合，总浓度为20g/L。(3)发酵产丁二酸将平板上的产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养16h，然后按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按5％(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在5.5-7.0，在充满CO2的环境中，在30℃分批发酵40h，即得丁二酸。本实施例丁二酸产量为14.76g/L，产率为49.2％。厌氧箱培养条件：厌氧箱(DonWhitleyScientificDG250anaerobicworkstation)，混合气N2：CO2：H2＝8.5：1.0：0.5，温度37℃。样品处理：发酵液在室温下12000r/min，离心10min，取上清，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液丁二酸及残还原糖浓度。有机酸测定：HPLC法，戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：RezexROA-organicacid300×7.8mm，流动相2.5mmol/LH2SO4，pH2.5，柱温45℃，进样量10uL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210nm。粗甘油测定：HPLC法，条件与有机酸测定相同，采用紫外与示差检测器连用，示差检测器温度为55℃。生物量测定：采用分光光度计(DU800UV/VISSpectrophotometer,Beckman,USA)在660nm进行测定，样品先用0.2MHCl进行处理，溶解所含的MgCO3，12000r/min离心10min，再用蒸馏水洗三次，以除去所含的色素及杂质。实施例3运用产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397，将生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，其步骤如下：(1)种子培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。(2)发酵培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到发酵培养基：粗甘油100g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，二甲基亚枫20g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L。以上所述氮源为玉米浆、酵母粉以任意比例混合。以上所述pH调节剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为80g/L。(3)发酵产丁二酸将平板上的产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养20h，然后按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按10％(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在5.5-7.0，在充满N2的环境中，在38℃分批发酵84h，即得丁二酸。本实施例丁二酸产量为21.53g/L，产率为21.53％。实施例4运用产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397，将生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，其步骤如下：(1)种子培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。(2)发酵培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到发酵培养基：粗甘油50g/L，氮源12g/L，磷酸二氢钾8g/L，二甲基亚枫10g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.6g/L。以上所述氮源为玉米浆。以上所述pH调节剂为碱式碳酸镁，浓度为60g/L。(3)发酵产丁二酸将平板上的产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养18h，然后按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按8％(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在5.5-7.0，在充满CO2的环境中，在37℃分批发酵60h，即得丁二酸。本实施例丁二酸产量为47.17g/L，产率为94.34％。实施例5运用产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397，将生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，其步骤如下：(1)种子培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。(2)发酵培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到发酵培养基：初始粗甘油20g/L，氮源5g/L，磷酸二氢钾2g/L，二甲基亚枫0g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L，通过补料的方式维持罐内粗甘油在20g/L，补料用粗甘油为500g/L。以上所述氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉以任意比例混合。以上所述pH调节剂为氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为20g/L。(3)发酵产丁二酸将平板上的产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养16h，然后按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按5％(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在5.5-7.0，在充满N2的环境中，在30℃分批补料发酵40h，即得丁二酸。本实施例丁二酸产量为17.22g/L，产率为86.1％。实施例6运用产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397，将生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，其步骤如下：(1)种子培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。(2)发酵培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到发酵培养基：初始粗甘油30g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，二甲基亚枫20g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L，通过补料的方式维持罐内粗甘油在30g/L，补料用粗甘油为500g/L。以上所述氮源为玉米浆、酵母粉以任意比例混合。以上所述pH调节剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为80g/L。(3)发酵产丁二酸将平板上的产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养20h，然后按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按10％(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在5.5-7.0，在充满CO2的环境中，在38℃分批补料发酵84h，补料结束后罐内甘油浓度达80g/L，即得丁二酸。本实施例丁二酸产量为70.21g/L，产率为87.76％。实施例7运用产琥珀酸放线杆菌CCTCCNO：M2016397，将生物柴油副产物粗甘油发酵产丁二酸的方法，其步骤如下：(1)种子培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。(2)发酵培养基的制备：将如下浓度的成分混合，在115℃灭菌20min即可得到发酵培养基：初始粗甘油25g/L，氮源12g/L，磷酸二氢钾8g/L，二甲基亚枫10g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.6g/L，通过补料的方式维持罐内粗甘油在25g/L，补料用粗甘油为500g/L。以上所述氮源为玉米浆。以上所述pH调节剂为碱式碳酸镁，浓度为60g/L。(3)发酵产丁二酸将平板上的产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中培养18h，然后按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按8％(V:V)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在5.5-7.0，在充满CO2的环境中，在37℃分批补料发酵72h，补料结束后罐内甘油浓度达80g/L，即得丁二酸。本实施例丁二酸产量为68.46g/L，产率为85.58％。实施例8将产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接种至种子培养基中，在厌氧箱中培养16h，按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按8％(V:V)的接种量将种子液接种到含有35g/L粗甘油发酵培养基中(250mL厌氧瓶，装液量为150mL)，DMSO的添加浓度分别为0、5、10、15、20g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾8g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.6g/L，在37℃分批发酵60h，丁二酸及主要副产物的产量。结果见表1。表1不同DMSO添加浓度对粗甘油发酵产丁二酸的影响由表1可知，当DMSO的添加浓度为10g/L，丁二酸产量最高，达30.53g/L，产率为87.31％。实施例9将产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接种至种子培养基中，在厌氧箱中培养16h，按5％(V:V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按8％(V:V)的接种量将种子液接种到含有不同浓度的粗甘油的发酵培养基中(250mL厌氧瓶，装液量为150mL)，其中：玉米浆12g/L，磷酸二氢钾8g/L，二甲基亚枫10g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.6g/L，添加50g/L的碱式碳酸镁调节pH在5.5-7.0，在37℃分批发酵60h，丁二酸及主要副产物的产量结果见表2。表2不同粗甘油浓度对丁二酸产量的影响粗甘油(g/L)丁二酸(g/L)乙酸(g/L)甲酸(g/L)丁二酸产率(％)3025.075.221.4383.574034.696.112.8586.725046.887.083.3593.766040.346.543.1167.237033.215.752.4247.448031.254.371.6939.199026.083.211.0228.9810021.352.860.8721.35由表2可知，当粗甘油50g/L时，丁二酸的产量最高，达到46.88g/L。实施例10将产琥珀酸放线杆菌XT单菌落接种至种子培养基中，在厌氧箱中培养18h，按5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，即得到种子液；按8％(V:V)的接种量将种子液接种到的发酵培养基中(1.3L发酵罐，装液量为0.8L)，发酵温度37℃，搅拌转速150r/min，通气为100％CO2，通气量为0.2mL/min，补料发酵84h。其中，初始粗甘油25g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾8g/L，二甲基亚枫10g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.7g/L，氯化镁0.6g/L，添加60g/L的碱式碳酸镁调节pH在5.5-7.0，通过补料的方式维持罐内粗甘油浓度在25g/L，补料用粗甘油浓度为500g/L，补料结束后罐内粗甘油浓度达80g/L。丁二酸及主要副产物的产量结果见表3。表3粗甘油分批补料发酵丁二酸产量影响发酵时间(h)丁二酸(g/L)乙酸(g/L)甲酸(g/L)丁二酸产率(％)8471.6910.243.3689.62本实施例丁二酸产量为71.69g/L，产率为89.62％。当前第1页1 2 3