一株耐冷草假单胞菌及其在污水处理中的应用的制作方法

本发明涉及环境微生物及污水处理技术领域。

背景技术：

生物处理是污水处理最常用也是最经济有效的一种技术手段，其能够实现污染物达标排放的关键在于生物处理构筑物中存在足量且具有高效污染物分解能力的微生物。生物处理技术在寒冷地区冬季低温时存在处理效果差、出水难以达标排放的问题。污水处理厂一般采取降低污泥负荷、提高污泥浓度来确保出水水质，但同时会增加运行费用。Sudarno（Effect of varying salinity, temperature, ammonia and nitrous acid concentrations on nitrification of saline wastewater in fixed-bed reactors. Bioresour Technol, 2011,102(10):5665-5673）和Kroupova（Nitrite influence on fish: a review.Veterinární Medicína,2005,50( 11): 461-471）研究发现：低温时污水处理效果差的根本原因在于构筑物中低温微生物的数量和活性远远不够，这会强烈抑制微生物的硝化和反硝化能力，最终导致冬季有机物的降解效率和生物脱氮处理效果下降。为了从根本上解决这一问题，应该从生物强化的角度提高污水处理构筑物中的耐冷微生物即耐冷菌的数量和活性，因此分离筛选出耐冷菌并应用于寒冷地区生活污水的处理这一研究工作非常重要。

污水处理耐冷菌的筛选及应用研究能够提高污水处理效率，但直接投加到污水处理系统中，存在菌体流失、与土著菌竞争劣势、难以长效运行等问题。为了解决这一问题，人们尝试采用微生物固定化的形式提高耐冷菌的低温生物强化效果。目前国内外一些学者开展了固定化微生物应用于污水处理的研究工作，取得了一定进展。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一株耐冷草假单胞菌及其在污水处理中的应用，该耐冷草假单胞菌能够在低温条件下提高污水生物处理效率，对污水中NH₃-N、NO₃^--N和COD均有有效去除效果，用丰富污水生物处理构筑物中耐冷微生物的数量和活性，来提高出水达标率的方法操作简单、成本低廉、经济环保，可以单独使用或者固定化后应用于废水处理中，应用广泛。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一株耐冷草假单胞菌NL-4分离自河北省张家口市崇礼污水处理厂SBR反应池活性污泥，经鉴定为草假单胞菌（Pseudomonas poae），已于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号），保藏号为CGMCC No.13450。

本发明还提供了耐冷草假单胞菌NL-4在污水处理中的应用。污水处理为污水除氨氮、硝态氮和COD。污水处理的温度为5-25℃，在低温条件下去除效果更为明显。

本发明还提供了用聚乙烯醇和海藻酸钠包埋一株耐冷草假单胞菌NL-4得到的固定化载体和固定化载体在污水处理中的应用。污水处理为污水除氨氮、硝态氮和COD。污水处理的温度为5-25℃，较之游离菌，去除效率更高。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

（1）耐冷草假单胞菌NL-4在低温条件下有较好的脱氮效果，培养24 h后，对污水中TN、NH₃-N和NO₃^--N去除率分别是63.16、68.05和98.94%；培养24 h后，对污水中COD去除率是68.64%，提高低温条件下污水生物处理效率，用丰富污水生物处理构筑物中耐冷微生物的数量和活性，来提高出水达标率的方法操作简单、成本低廉、经济环保，可以单独使用或者固定化后应用于废水处理中，应用广泛。

（2）与游离菌相比，采用PVA-SA包埋固定化方法固定化耐冷草假单胞菌NL-4后，在低温时对污水中TN、NH₃-N、NO₃^--N和COD的去除效率比游离菌分别提高了8.42%、14.49%、0.6%和5.75%。

（3）综合分析污水降解性能和固定化SEM图，采用PVA-SA包埋方式制备的耐冷草假单胞菌NL-4固定化载体可以有效的保证微生物量和菌体活性，在发挥降解效率的同时能够稳定的存在。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明；

图1是本发明实施例1中耐冷菌NL-4的细胞形貌扫描电镜（SEM）图（Bar=10µm）；

图2是本发明实施例1中耐冷菌NL-4的5和10℃生长曲线图；

图3是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌和固定化后对污水中总氮的去除效果图；

图4是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌和固定化后对污水中硝态氮的去除效果图；

图5是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌和固定化后对污水中氨氮的去除效果图；

图6是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌和固定化后对污水中COD的去除效果图；

图7是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌在5℃和10℃下对污水中COD的去除效果对比图；

图8是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌在5℃和10℃下对污水中总氮的去除效果对比图；

图9是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌在5℃和10℃下对污水中氨氮的去除效果对比图；

图10是本发明实施例1中耐冷菌NL-4游离菌在5℃和10℃下对污水中硝态氮的去除效果对比图；

图11是本发明实施例1中耐冷菌NL-4固定化颗粒在处理污水前的内部形貌扫描电镜（SEM）图（Bar=10µm）；

图12是本发明实施例1中耐冷菌NL-4固定化颗粒在处理污水后的内部形貌扫描电镜（SEM）图（Bar=10µm）。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1

1 试验材料与方法

1.1菌源

河北省张家口市崇礼污水处理厂SBR反应池活性污泥。

1.2富集与分离培养基

耐冷菌培养基：CH₃COONa，3.0 g；KNO₃，1.0 g；K₂HPO₄，0.1 g；KH₂PO₄，0.1 g；NH₄Cl，0.2 g；MgSO₄·7H₂O，0.6 g；CaCl₂·2H₂O，0.07 g；微量元素溶液，2 ml；蒸馏水1 L。

微量元素：FeCl₃·6H₂O，1.5 g；CuSO₄·5H₂O，0.03 g；MnCl₂·4H₂O，0.12 g；ZnSO₄·7H₂O，0.12 g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.06 g；H₃BO₃，0.15 g；KI，0.03 g；CoCl₂·6H₂O，0.15 g；蒸馏水，1 L。

培养基在高压锅中121 ℃灭菌 30 min后使用，调至 pH = 7.0～7.2，操作均为无菌操作。固体培养基在液体培养基的基础上添加 2%（W/V）的琼脂粉。

1.3耐冷菌的筛选

分别取 10 mL的污泥和底泥加 90 mL 无菌水，放入带有玻璃珠的三角瓶里，振荡约30 min。取上清液10 mL，分别加入到90 ml三种不同液体培养基中，在10 ℃和150 r·min^-1 下振荡培养 7 d，然后再分别取 10 mL 培养基加入到 90 mL 新的已灭菌的液体培养基中，同样条件下继续培养7 d，如此进行4轮富集。最终取0.1 mL最后一次的培养液，涂布法接种于对应的固体培养基上，10 ℃下恒温培养。当出现菌落时，挑取单个菌落，重新接种于液体培养基，10 ℃下摇床培养，24 h后再涂布接种于固体培养基里。如此反复纯化，直至分离出单菌株。经过多次反复分离纯化共筛选出可在10 ℃下生长的耐冷菌共22株。将其挑入斜面，在4 ℃冰箱中保存。

1.4 耐冷菌的鉴定

首先，通过碱裂解法提取耐冷菌DNA，然后进行1% 琼脂糖凝胶电泳检测，以27F/1492R为通用引物进行16S rDNA的PCR扩增，PCR产物纯化后进行测序，并将测定结果在NCBI上进行Blast比对，对筛选的耐冷菌进行初步鉴定。

1.5模拟污水

以葡萄糖为碳源、氯化铵为氨态氮源、硝酸钾为硝态氮源和磷酸二氢钾为磷源(C:N:P=100:5:1)，并添加适量微量元素，COD、氨氮和硝态氮初始值分别约为800、20和10 mg.mL^-1，pH=7.2.称取10 g固定化载体加入装有100 mL模拟废水的150 mL锥形瓶中，并以等量的 Pseudomonas poae strain B42游离菌为对照组，比较分析在10 ℃培养24h后水样中的氮含量。

1.6耐冷菌的固定化制备方法

以海藻酸钠（SA）、聚乙烯醇（PVA）为包埋材料，硼酸和氯化钙为交联剂。将PVA和SA混合，加入80 mL蒸馏水浸泡过夜，次日高温灭菌，冷却至30℃左右后加入菌悬液，用无菌水定容至100 mL，搅拌均匀，用蠕动泵从20 cm高处将其缓慢匀速滴加到磁力搅拌器上盛有的氯化钙饱和硼酸溶液中（用Na₂CO₃调pH 6.7左右），静置1 h，使固定化颗粒成形，由于交联剂硼酸对微生物的毒害较大，会影响微生物活性，因此1 h后取出固定化颗粒，放入4 ℃冰箱中，放置24 h，再转入对微生物毒性较小的0.5 mol.L^-1Na₂SO₄溶液，进一步对凝胶颗粒进行交联。最后，用灭菌的去离子水和生理盐水各冲洗两次，保存于4℃冰箱中备用。

1.7分析项目与测定方法

1.7.1污水测定项目与方法

NH₃-N：纳氏试剂分光光度法； NO₃^--N：紫外分光光度法；SEM图：KYKY-2800B型数字化扫描电子显微镜。

1.7.2耐冷菌固定化物理特性评价项目

固定化颗粒的密度、直径、成球性、粘连状况、弹性好坏、机械性能、膨胀率系数和传质性、SEM内部特征。

2 结果和分析

2.1 耐冷菌分离鉴定结果

2.1.1耐冷菌生理特性及形态学特征

通过连续富集培养和反复分离纯化，筛选出1株在10℃培养条件下生长性能良好并对NH₃-N和NO₃^--N具有较好净化性能的耐冷菌，命名为NL-4。10℃培养条件下，NL-4平板培养特征及形态学特征如表1所示，细胞形貌如图1所示。

2.1.2 NL-4的16S rDNA序列分析及鉴定

将菌株16S rDNA 区序列应用Bioedit软件采用进行多序列匹配比对，用MEGA7 采用 Neighbor-Joining 方法进行分子系统学分析并构建系统发育树展示菌株的遗传多样性和菌株间的亲缘关系。发现NL-4与Pseudomonas poae strain B42 ( KT767705)聚于统一分支，同源性高达100%，结合形态观察，初步鉴定NL-4是草假单胞菌。此耐冷菌NL-4的16S rDNA基因序列如SEQ. ID. NO:1。

2.1.3 耐冷菌NL-4的生长曲线

采用光电比浊法测定耐冷菌NL-4在5℃和10℃下的生长曲线如图2所示，菌株的生长周期为36 h左右，在6~24 h进入对数增长期，世代时间是2.74 h。

2.2 耐冷菌NL-4对模拟污水的净化效果研究

2.2.1 耐冷菌NL-4在10℃脱氮效果和COD去除效果

耐冷菌NL-4固定化后对模拟废水中的TN、NO₃^--N、NH₃-N和COD的去除效果如图3-6所示。可以看出在整个培养周期内耐冷菌NL-4固定化后对污水脱氮效率均高于游离菌，随着培养时间的延长，两者的去除效率变化趋势基本一致。由图3可知，耐冷菌NL-4表现出对污水中的TN有较好的去除效率，而且适应环境快，反应3 h时已表现出较好的脱氮效率，12 h后反应达到顶点，去除率逐渐趋于平衡。由图4可知，耐冷菌NL-4无论固定化和游离菌均表现出较高的NO₃^--N去除率，培养3 h后对NO₃^--N的去除率已经分别达到87.38%和86.38%。培养24 h后，固定化NO₃^--N去除率达99.54%。由图5可知，耐冷菌NL-4对NH₃-N的去除比较平缓，培养21 h后，反应趋于稳定。培养24 h后，固定化对NH₃-N去除率为82.54%，提高了14.49%左右。由图6可知，耐冷菌NL-4对COD的去除中，在培养24 h后，固定化对COD去除率为74.39%，游离菌为68.64%，提高了5.75%左右。

2.2.2 耐冷菌NL-4游离菌在5℃和10℃的降解效果对比

耐冷菌NL-4游离菌在5℃和10℃下对污水中COD、总氮、氨氮、硝态氮的去除效果对比如图7- 10所示。可以看出在整个培养周期内耐冷菌NL-4在10℃下对污水脱氮除COD效率均高于在5℃下。

由图7- 10可知，耐冷菌NL-4在10℃下，培养24 h后，对污水中TN、NH₃-N和NO₃^--N去除率分别是63.16、68.05和98.94%；培养24 h后，对污水中COD去除率是68.64%。耐冷菌NL-4在5℃下，培养24 h后，对污水中TN、NH₃-N和NO₃^--N去除率分别是52.16、43.11和58.77%；培养24 h后，对污水中COD去除率是60.08%。

2.3 SEM图表征分析耐冷菌NL-4固定化载体内部特征

为了考察耐冷菌NL-4在固定化载体内的存活状态及稳定性，采用SEM对比分析耐冷菌NL-4固定化颗粒在处理污水前后的内部形貌。由图11和图12可看出，固定化内部由大量网状结构连接而成，空隙较多，且孔径分布均匀。耐冷菌菌体贯穿在颗粒的网络结构中，载体内部空隙较多，质地疏松，有利于微生物的附着生长以及基质物质的运输与扩散。对比处理污水前后的固定化载体内部特征可以看出，固定化颗粒在污水处理后仍能够保持相当数量的微生物，没有出现菌体流失或大量死亡的现象。处理污水后，颗粒内部存在一些絮状物质，分析是污水处理过程中的代谢产物，由于数量不多，不会影响菌体的生长繁殖和物质的传输。

3结论

（1）耐冷菌NL-4在低温条件下有较好的脱氮效果，培养24 h后，对污水中TN、NH₃-N和NO₃^--N去除率分别是63.16、68.05和98.94%；培养24 h后，对污水中COD去除率是68.64%。

（2）综合考虑固定化小球的物理特性，通过正交试验确定耐冷菌固定化最佳条件为：固定化载体SA质量分数为1%， PVA质量分数为12%、CaCl₂质量分数1%、包菌量为10%，制备的固定化小球密度较高，初始直径较大；成球性好，大小均匀；弹性较好，不易变软变形；且孔隙较大，传质性能好。

（3）与游离菌相比，采用PVA-SA包埋固定化方法固定化耐冷草假单胞菌NL-4后，在低温时对污水中TN、NH₃-N、NO₃^--N和COD的去除效率比游离菌分别提高了8.42%、14.49%、0.6%和5.75%。

（4）综合分析污水降解性能和固定化SEM图，采用PVA-SA包埋方式制备的耐冷菌NL-4固定化载体可以有效的保证微生物量和菌体活性，在发挥降解效率的同时能够稳定的存在。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一株耐冷草假单胞菌及其在污水处理中的应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1168

<212> DNA

<213> 草假单胞菌（Pseudomonas poae）

<400> 1

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