本发明涉及水产养殖营养学领域，特别涉及一种芽孢杆菌与小球藻混合剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：水产业高密度、集约化养殖在大大提高产量的同时也带来了许多新的问题，研究表明，在养殖过程中饵料利用率较低，加之，生物排泄物、尸体等有机物大量累积于池底，有害微生物种类和数量增多，有机物在它分解作用下产生的有毒物质也随之增加。另外，池塘本是一个封闭、单一的生态系统，本身其自净和调节能力较弱，养殖生物长期处于化学耗氧量(COD)、生物耗氧量(BOD)、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标的水体中，病害爆发几率大大提高，水产品品质也受到严重影响。据不完全统计，全国每年发生中等程度以上的养殖病害面积占养殖总面积的20％以上，年损失产量超过146多万吨。芽孢杆菌是一种好氧革兰氏阳性菌，是对人畜无毒无害的细菌，芽孢杆菌在水中增殖后分泌的许多胞外酶能分解水体和底泥中的淀粉，蛋白质和脂肪等有机质；并多以氨气、氮气和二氧化碳等代谢终产物弥散到空气中，大大降低了水中有毒有害物质的浓度，稳定水体各项理化指标，达到了改良水质和维持养殖水体生态平衡的目的。但是，芽孢杆菌多数为好氧细菌，在其快速繁殖的过程中，水体中溶解氧迅速降低，容易导致养殖动物窒息死亡。小球藻是水产养殖池塘中的生产者，含有丰富的营养物质，是养殖动物的优良饵料。然而其光合作用只能利用水体中的无机盐成分，对粪便、残饵等有机物没有作用，特别在养殖后期，水体有机物积累较多，水体透光率较低等都不利于小球藻生长繁殖，因此小球藻单独使用，其繁殖速率达不到理想效果。技术实现要素：目前，水产养殖中单独使用芽孢杆菌或小球藻已经很普遍了，菌藻混合使用未见报道。针对现有水产养殖中存在的问题，本发明将芽孢杆菌和小球藻混合并用于水产养殖，能有效地改善养殖水体和底泥的环境，芽孢杆菌可将大分子有机物转化为小球藻直接利用的小分子物质，同时产生生长因子促进小球藻生长；同时小球藻通过光合作用利用水中大量的N、P等元素，从而降低水体中营养盐的含量，并释放大量氧气，提高水中溶解氧含量，弥补芽孢杆菌单独使用的缺陷，为芽孢杆菌和养殖生物提供丰富的氧气，充分发挥小球藻与芽孢杆菌的协同作用，取到很好的净化效果。本发明提供一种特别适合水产养殖的芽孢杆菌与小球藻混合剂，该混合剂中芽孢杆菌与小球藻的用量体积比为(1-9):3。本发明芽孢杆菌和小球藻混合剂的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)活化芽孢杆菌种，采用LB培养基，pH7-7.5，121℃高压灭菌20min，在30-35℃培养16-20小时；(2)芽孢杆菌的一级、二级液体扩大培养，采用50L发酵罐培养，按10-20％接种量接种；(3)将二级培养的芽孢杆菌4000rpm，离心，收集菌体，用LB培养基将菌体浓度稀释至5.0×109CFU/mL；(4)活化小球藻藻种，采用BG11培养液，pH6-8，121℃高温灭菌20min，藻种按1:2或1:3接种，在温度25-30℃，光照5000-10000lx条件下培养5-7天；(5)小球藻的一级、二级扩大培养，采用5吨玻璃管道培养，按1:5或1:10接种，在温度25-30℃，光照5000-10000lx条件下培养5-7天；(6)将二级扩培的小球藻液4000rpm，离心，收集藻泥，用BG11培养液将藻泥浓度稀释至2.0×109cell/mL；(7)将上述培养得到的芽孢杆菌、小球藻，分别按以下体积比混合：芽孢杆菌与小球藻1:3；芽孢杆菌与小球藻1:1；芽孢杆菌与小球藻3:1，于0-5℃保存，备用。所述LB培养基，其配方包含：酵母粉5-7g/L，胰蛋白胨10-12g/L；所述BG11培养液，其配方包含：NaNO30.15-0.3g/L，K2HPO40.04-0.06g/L，MgSO4·7H2O0.075-0.1g/L，CaCl2·2H2O0.036-0.05g/L，Citricacid0.006-0.01g/L，Ferricammoniumcitrate0.01-0.02g/L，EDTANa20.001-0.005g/L，Na2CO30.02-0.1g/L，微量元素A5母液1-2ml/L；所述微量元素A5母液配方为H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O1.86g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，Na2MoO4·2H2O0.021g/L，CuSO4·5H2O0.08g/L，Co(NO)3·6H2O0.05g/L。本发明还提供芽孢杆菌与小球藻混合剂的应用，将其应用于水产品养殖：(1)在幼苗阶段，即1-15天，拌料投喂：将所述混合剂与饲料充分拌匀，每公斤饲料搅拌0.1L混合剂，每天投喂3次；(a)如果幼苗摄食不良，消化不好，选用芽孢杆菌与小球藻3:1的混合剂，针对性改良幼苗肠道环境。(b)如果幼苗个体瘦小、生长缓慢，选用芽孢杆菌与小球藻1:1混合剂，为幼苗提供充足的蛋白质和不饱和脂肪酸。(2)大塘养殖阶段，即16-90天：(a)养殖16-25天，取体积比为1:3混合剂，按混合剂5L/亩用量全池泼洒，每2天泼洒1次；利用小球藻的快速繁殖，稳定藻相，形成养殖早期较好水色。(b)养殖26-60天，取体积比为1:1混合剂，按混合剂5L/亩用量全池泼洒，每天泼洒1次；利用芽孢杆菌快速分解水体中的残饵和粪便，结合小球藻光合作用快速降低水体中氨氮和亚硝酸盐含量，增加溶解氧。(c)养殖61-90天，取体积比为3:1混合剂，按混合剂5L/亩用量全池泼洒，每天泼洒1次；作用是在养殖61天后，水体中积累的有毒有害物质较多，水环境较恶劣，病原菌入侵几率较大，利用芽孢杆菌的快速繁殖，能起到很好的抑制病原菌，调节菌群结构的作用，再结合小球藻光合作用，能加快水质的恢复，降低发病率。本发明的有益效果：(1)针对不同养殖时期的水质情况，将芽孢杆菌与小球藻合理配伍，利用两者的协同作用，能明显降低水体中的氨氮、亚硝酸盐浓度，增加溶解氧含量；(2)将其应用于鱼虾蟹等水产养殖，能有效抑制水产品肠道病原菌的生长，增强抵抗力，提高存活率。具体实施方式下面对本发明的技术方案作进一步说明：一种芽孢杆菌和小球藻混合剂的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)活化芽孢杆菌种，采用LB培养基，pH7-7.5，121℃高压灭菌20min，在30℃培养18小时；(2)芽孢杆菌的一级、二级液体扩大培养，采用50L发酵罐培养，按20％接种量接种；(3)将二级培养的芽孢杆菌4000rpm，离心，收集菌体，用LB培养基将菌体浓度稀释至5.0×109CFU/mL；(4)活化小球藻藻种，采用BG11培养液，pH6-8，121℃高温灭菌20min，藻种按1:2接种，在温度25℃，光照10000lx条件下培养5天；(5)小球藻的一级、二级扩大培养，采用5吨玻璃管道培养，按1:10接种，在温度25℃，光照10000lx条件下培养5天；(6)将二级扩培的小球藻液4000rpm，离心，收集藻泥，用BG11培养液将藻泥浓度稀释至2.0×109cell/mL。(7)将上述培养得到的芽孢杆菌、小球藻，分别按以下体积比混合：芽孢杆菌与小球藻1:3；芽孢杆菌与小球藻1:1；芽孢杆菌与小球藻3:1，于0-5℃保存，备用。所述LB培养基，其配方包含：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L；所述BG11培养液，其配方包含：NaNO30.15g/L，K2HPO40.04g/L，MgSO4·7H2O0.075g/L，CaCl2·2H2O0.036g/L，Citricacid0.006g/L，Ferricammoniumcitrate0.01g/L，EDTANa20.001g/L，Na2CO30.02g/L，微量元素A5母液1ml/L；所述微量元素A5母液配方为H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O1.86g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，Na2MoO4·2H2O0.021g/L，CuSO4·5H2O0.08g/L，Co(NO)3·6H2O0.05g/L。实验组将上述制得的芽孢杆菌与小球藻混合剂，用于凡纳滨对虾养殖：(1)在幼苗阶段，即1-15天，拌料投喂：取5L所述芽孢杆菌与小球藻1：1混合剂喷洒于50公斤饲料表面，充分拌匀，每天投喂3次；(2)大塘养殖阶段，即16-90天：(a)养殖16-25天，取体积比为1:3混合剂，按混合剂5L/亩用量全池泼洒，每2天泼洒1次；(b)养殖26-60天，取体积比为1:1混合剂，按混合剂5L/亩用量全池泼洒，每天泼洒1次；(c)养殖61-90天，取体积比为3:1混合剂，按混合剂5L/亩用量全池泼洒，每天泼洒1次。对照组1将上述制得的芽孢杆菌，用于凡纳滨对虾养殖：(1)在幼苗阶段，即1-15天，拌料投喂：取5L芽孢杆菌体喷洒于50公斤饲料表面，充分拌匀，每天投喂3次；(2)大塘养殖阶段，即16-90天：(a)养殖16-25天，按芽孢杆菌体5L/亩用量全池泼洒，每2天泼洒1次；(b)养殖26-90天，按芽孢杆菌体5L/亩用量全池泼洒，每天泼洒1次。对照组2将上述制得的小球藻，用于凡纳滨对虾养殖：(1)在幼苗阶段，即1-15天，拌料投喂：取5L小球藻液喷洒于50公斤饲料表面，充分拌匀，每天投喂3次；(2)大塘养殖阶段，即16-90天：(a)养殖16-25天，按小球藻液5L/亩用量全池泼洒，每2天泼洒1次；(b)养殖26-90天，按小球藻液5L/亩用量全池泼洒，每天泼洒1次。控制其他养殖条件一致，定期取样(每隔9天)检测养殖水体中COD、氨氮、亚硝酸盐、弧菌、总菌含量，结果如下表1-5所示，养殖结束后，测定凡纳滨对虾生长指标，结果如下表6所示。结果显示，本发明不仅可以有效地降低养殖水体中COD、氨氮、亚硝酸盐的含量，达到卓越的水质净化效果，抑制致病菌的繁殖，降低养殖动物的发病率，而且还能很好地促进凡纳滨对虾生长，提高存活率。表1养殖水体COD含量表2养殖水体氨氮含量表3养殖水体亚硝酸盐含量表4养殖水体弧菌含量表5养殖水体总菌含量表6凡纳滨对虾各项生长指标项目实验组(数值±SE)对照组1(数值±SE)对照组2(数值±SE)体长(cm)/尾6.35±0.38a5.86±0.29b5.77±0.24b体重(g)/尾24.72±0.21a21.28±0.15b21.89±0.27b存活率(％)69.3±0.04a62.1±0.01b57.3±0.04b备注：格中ab表示实验组、对照组生长指标的差异性(P<0.01)；SE表示标准误。当前第1页1 2 3