解淀粉芽孢杆菌BN‑1及应用的制作方法

本发明涉及植物病害的生物防治，属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领域。具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌及应用。

背景技术：

桃枝枯病是近几年我国南方桃产区新出现的重要病害，特别是江苏无锡和浙江嘉兴产区，极易造成新梢枯死、树势衰弱，严重影响桃果产量。目前防治该病的方法主要是利用咪鲜胺、多菌灵和苯醚甲环唑等化学药剂喷施，其他药剂防效不够理想。而这些化学农药的常年和大量使用，病原菌会产生抗药性，并对桃果、环境和人类健康产生不利影响，不符合桃产业的可持续发展。而生物防治的研究及其应用避免了化学农药带来的负面影响，成为目前植物病害综合或生态治理中的重要手段。目前在桃枝枯病防控方面缺乏生物防治手段，从病害防治角度，还需开发其它有效药剂特别是生物菌剂供农业生产选择使用。自然界含有许多有益微生物，从环境中大量筛选得到生防微生物是生物药剂研制的基础工作，也是业内筛选有益微生物的惯用工作模式。生防细菌一般是一类可产生抗菌物质(如抗生素、抗菌蛋白、多肽等)的细菌，以桃枝枯病菌为目标真菌，从土壤或植物根际根围土壤中筛选能抑制该菌的细菌，是一种效率较高的筛选生防微生物的方法。

技术实现要素：

本发明为了给研制新型生物农药提供基础，丰富防治桃枝枯病的药剂种类，提供一株生防菌株，其能有效抑制桃枝枯病菌(Phomopsis amygdali)生长。

本发明所述的生防菌是：一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BN-1，它的保藏编号为CGMCC No.13262。

本发明进一步公开了解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BN-1在防治桃枝枯病菌中的应用。

该菌株对桃枝枯病菌的抑制效果与化学农药多菌灵相当。可弥补桃枝枯病防控中缺乏的生物防治手段，该菌可部分替代化学农药或与化学农药交替使用，在不影响防效的情况下能明显减少化学农药使用，减少农药残留和对环境造成的污染，同时也可延缓病菌产生抗药性，有助于保证桃果的安全性，提升水蜜桃优质果品率和质量。因此可以用解淀粉芽孢杆菌BN-1研发新型生物农药，用于桃枝枯病的生物防治。另外用该菌株生物防治还可辐射到浙江、上海等桃枝枯病发生严重的桃产区。因此，该发明及其应用，不仅能够防治病害减少经济损失，而且还能推动桃产业的绿色可持续发展，减少农药对环境造成的污染。

本发明解淀粉芽孢杆菌BN-1能有效抑制桃枝枯病菌，效果与化学农药多菌灵相当，有防治桃枝枯病的潜力。该菌株产生的抑菌活性物质主要是脂肽类抗生素，对桃枝枯病菌产生抑制作用。与化学药剂相比，使用BN-1菌株防治植物病害没有环境污染、农药残留等问题。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌BN-1菌株对桃枝枯病菌的拮抗效果。

图2是从BN-1菌株发酵液提取的脂肽抗生素粗提物对桃枝枯病菌的拮抗效果。

图3是BN-1菌株的菌落形态。

图4是BN-1菌株16S rDNA序列PCR扩增电泳图。

图5是BN-1菌株脂肽抗生素合成相关基因PCR扩增电泳图。

本发明所述菌株BN-1于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为解淀粉芽孢杆菌，拉丁名为：Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.13262。

具体实施方式

(1)采集桃根际土样(3～10cm耕作层)，去除石子等大颗粒物质，碾碎均匀，风干后过筛(40目)。

(2)10g土样放置于含100mL无菌水的三角瓶中，强烈充分振荡5min，然后静置5min；以上层悬浮液为母液，进行10倍系列梯度稀释。

(3)取10^-5、10^-6稀释液0.1mL均匀涂布牛肉浸膏蛋白胨(NA)平板。

(4)30℃条件下培养4天。

(5)分离不同性状、颜色的单菌落，再NA平板划线纯化后保存。

(6)将桃枝枯病菌(菌株由本实验室从无锡阳山桃园病枝上分离获得，经形态、致病性测测和分子生物学鉴定为桃枝枯病菌)菌丝块(直径6mm)接在马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)平板中央，将分离出的待测细菌菌株分别接种到离病原菌月20mm的对称位置，每个平板接种4个待测菌株。30℃培养48h观察抑菌活性。根据抑菌带的有无确定待测菌株的拮抗活性。

(7)对初筛有拮抗活性的菌株进行复筛，方法同(6)，只是在每个平板上只验证一株拮抗菌，两侧接种。同时连续转接多代后按上述方法再测菌株的拮抗性，确定拮抗稳定性。获得一株拮抗性强且稳定的菌株，命名为BN-1。如图1，平板中靠近接种BN-1菌落的病菌菌丝生长受到了抑制，形成可明显的抑菌带，说明BN-1菌株发酵过程中能产生抑菌物质，使附近的病菌不能生长。

(8)采用形态特征和生理生化特征和16S rRNA基因序列分析进行菌株种类鉴定。

形态和培养特征：革兰氏染色阳性，杆状，有芽孢；菌落在平板上呈白色至淡黄色，不透明，蜡质，平铺，表面粗糙中央有隆起皱褶，边缘不规则，不产生色素(图3)；液体培养静止时，前期有颗粒沉淀，后期除沉淀外，液面产生菌膜。

生理生化特征：菌株的生理生化特征见表1。

表1菌株BN-1的生理生化特征

注：+，阳性；－，阴性。

以上特征与解淀粉芽孢杆菌一致。

16S rRNA基因序列分析：提取BN-1基因组DNA，采用细菌16S rRNA基因通用引物扩增，扩增出一条特异性条带，大小约1200bp(图4)。将目的条带回收、测序，将获得的序列在GenBank中进行BLAST比对，结果表明菌株BN-1的16S rRNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的序列相似性高达99.％。因此，BN-1菌株为解淀粉芽孢杆菌。

BN-1菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

(9)BN-1产生脂肽类抗生素分析及活性

脂肽抗生素合成相关基因序列分析：

利用分子生物学手段对BN-1基因组中脂肽类抗生素合成相关基因进行检测，以明确BN-1是否具有代谢产生脂肽抗生素的可能性。利用特定菌株的特定基因序列设计出四对引物，分别对mycB基因(抗霉枯草菌素mycosubtilin操纵元中的基因)、fenB基因(丰原素fengycin合成酶基因)、ituA基因(伊枯草菌素iturin A合成酶基因)和sfp基因(sfp基因编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，是非核糖体途径合成脂肽类化合物的关键基因，该基因通常与表面活性素surfactin合成酶基因srf相邻，是表面活性素产生的必须基因，通常认为含有sfp基因的芽孢杆菌菌株能够代谢产生表面活性素)进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，均能在指定位置出现一条特异性条带(图5)。将凝胶条带回收纯化后进行测序，所测序列进行BALST分析，结果表明测序序列分别与mycB、fenB、ituA和sfp基因的相似性为98％、99％、98％和99％。扩增比对结果见表2。

根据分析结果推测解淀粉芽孢杆菌BN-1基因组中存在伊枯草菌素家族成员抗霉枯草菌素、伊枯草菌素A合成相关基因，丰原素合成相关基因和表面活性素合成相关基因，该菌株可能代谢产生这几类脂肽抗生素。

表2菌株BN-1脂肽类抗生素合成相关基因扩增比对结果

脂肽类抗生素粗提液制备和活性：

BN-1发酵液4800r/min离心30min，收集上清液；加入7mol/L的浓盐酸至pH达到2，每10mL进行分装，过夜沉淀。12000r/min、4℃离心25min，去除上清液，每管沉淀中加入0.5mL甲醇，混匀后萃取8h，后12000r/min、4℃离心20min，取上清。将上清液进行浓缩，获得5倍浓度，用细菌滤器(滤膜孔径0.22μm)过滤，获得粗提液。

将6mm桃枝枯病菌菌丝块接种到PDA平板中央，菌落直径长至2cm时，在菌丝边缘约20mm处放置4个对称的直径6mm无菌滤纸，其上加入8μL粗提液，观察菌丝生长情况。结果表明，粗提液能明显抑制桃枝枯病菌，有明显的抑菌带，如图2，说明BN-1菌株发酵过程中能产生脂肽类抗生素类抑菌活性物质。

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<120> 解淀粉芽孢杆菌BN-1及应用

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