一种嗜盐玫瑰色库克菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种嗜盐玫瑰色库克菌菌株及其应用。

背景技术：

微生物多糖主要是细菌、真菌等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物。微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。胞外多糖是由微生物大量产生的多糖，易与菌体分离，可通过深层发酵实现工业化生产。据Eveleigh统计，已经发现49属76种微生物产生胞外多糖，但真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。近几年，随着对微生物多糖研究的深入，世界上微生物多糖的产量和年增长量均在10％以上，而一些新型多糖年增长量在30％以上。到目前为止，已大量投产的微生物多糖主要有黄原胶(Xanthangum)、结冷胶(Gellan gum)、右旋糖酐(Dextran)、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pollulan)、热凝多糖(Curdlan)等。近年来又兴起对一些新型微生物多糖如海藻糖(Trehalose)、透明质酸(Hyaluronic)、壳聚糖(Chitasan)等的研究。

微生物多糖一般无毒、无害、可降解、对环境无污染，与植物多糖和动物多糖相比，有生长周期短，不受季节、气候和地理条件影响等优势，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。例如微生物多糖与植物多糖相比具有的优良而且独特的物理性质，如在低浓度下能增大黏滞性而不生成凝胶，微小的切变力即能迅速增大流动性，并降低黏滞性，消除切变力后可迅速恢复原有效应。多糖是自然界含量最丰富的多聚物，而且绝大多数对人体无毒害作用。还可以通过调节淋巴细胞、吞噬细胞、白介素、抗体的水平增强机体免疫机能，所以一些多糖分别或同时具有抗肿瘤、抗感染、抗辐射、抗衰老、抗突变、抗遗传损伤、抗毒物损伤、抗水肿、降血糖、降血脂、促进造血机能的恢复以及促进蛋白质和核酸的生活合成等多方面生物活性。许多微生物多糖已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等，广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。多糖在微生物的生存过程中主要有以下几方面作用：①细胞内存在的内多糖主要是作为能源储存物质存在的；②胞壁多糖主要是N-乙酞葡萄糖胺和N-乙酞胞壁酸以β-1，4糖昔键链接的多糖，它的作用主要是作为骨架维持细菌菌体的固有形态；③荚膜和黏液多糖的生理功能，主要是防护作用，一些动物致病菌的荚膜还可保护它们免受宿主白细胞的吞噬，贮存养料，保持适当水分，吸收金属离子，并可能抑制溶菌酶和防御噬菌体作用等。它的结构和功能较为多样，将是今后多糖研究的重点。

目前，大多数微生物多糖的产量低，产糖微生物营养要求高，提取成本高，因此研究高产多糖最多的方法就是通过筛选获得高产菌株，同时优化发酵培养基和发酵条件，这也是提高多糖产量的前提保证。

嗜盐微生物在古菌域，细菌域和真核生物域中都有存在，地理分布极为广泛。嗜盐菌独特的生理生化特性，易于在高盐环境下生长及可以利用多种有机物作为碳源和氮源，决定了其在酶制剂生产、食品工业、污水处理等方面的具有可能的应用价值。嗜盐菌作为一种新型微生物资源，不仅为微生物生理、遗传和分类及生命科学和相关学科许多领域的研究提供新的课题。也为生物进化、生命起源的研究提供新的材料。嗜盐菌由于其独特遗传背景和代谢途径，使其产生的生物酶在食品、化工、环保等领域有重大的应用潜力，因此其逐渐成为研究的热点。耐盐与嗜盐微生物，因其能适应和生存于高盐环境，致使在生物技术应用领域，具备实际的应用潜力。目前，国内外学者颇为关注的研究领域，主要集中于以下方面：生物电子(视紫红质应用于全息摄影、空间光调节器、光计算与存储器等)、耐盐酶筛选(异构酶与水解酶等)、相容溶质(细胞与分子稳定剂、高盐与压力保护剂等)、生物聚合物(表面活性剂、胞外多糖等)、生物发酵食品制备(腌制食品)、环境生物治理(降解与转化有机毒物、高盐有机污水处理等)、天然化工制品(β-胡萝卜素生产、生物塑料等、医药制品行业化妆制品、细胞保护剂等)、转基因应用(转基因烟草、抗盐碱作物等)等方面。中度嗜盐菌胞外多糖对逆环境具有一定的耐受性，这种抗逆性以及其他对策：通过细胞膜上Na+/K+的反向运输系统或ATP驱动的Na+外排泵(原核生物)，或紫膜光驱动H+质子泵(古生菌)排出Na+来对抗胞外的高渗环境(细胞质盐溶平衡策略、相容溶质积累策略)使嗜盐菌能在高盐度的环境中生存。

技术实现要素：

本发明提供了一种嗜盐玫瑰色库克菌菌株，能用于多糖生产。

一种嗜盐玫瑰色库克菌菌株，分类命名为玫瑰色库克菌(Kocuria rosea)ZJUQH，该菌株已于2016年12月15日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M2016754。

玫瑰色库克菌ZJUQH是从青海茶卡盐湖湖水中分离筛选得到的。该菌株的主要形态及生物学特征如下：红色、圆形菌落，表面光滑，革兰氏阳性菌，无荚膜、无芽孢，未见鞭毛。该菌株能在高盐度的环境中生存，对培养基营养要求不高。

本发明提供了上述玫瑰色库克菌ZJUQH在生产胞外多糖中的应用。该菌株通过合适的培养方法和培养条件进行发酵，能够高产胞外多糖。

本发明还提供了一种发酵生产胞外多糖的方法，包括：

(1)将经活化的玫瑰色库克菌ZJUQH接入种子培养液中进行种子培养，得到种子液；

(2)将种子液接入发酵培养基中进行发酵培养，培养后去除菌体，得到发酵液；

(3)从发酵液中提取得到胞外多糖。

步骤(1)中，所述活化为：将玫瑰色库克菌ZJUQH接种到活化培养基中，于28℃培养24-72h。

所述活化培养基包括以下原料：蛋白胨0-2％，牛肉膏0.1-1％，柠檬酸三钠0.1-1％，MgSO₄·7H₂O1-5％，KCl 0.1-1.0％，FeSO₄·7H₂O 0-0.01％，NaCl 0-1.5％，琼脂粉3-4％；pH为7.0-7.2；

或者，所述活化培养基包括以下原料：酪素水解物0.5％，酵母提取物1％，柠檬酸钠0.3％，蛋白胨0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄ 1％，琼脂粉3％；pH为7.0。

以重量百分比计，所述种子培养液包括以下原料：蛋白胨0-7％，牛肉膏0-3％，柠檬酸三钠0-3％，MgSO₄.7H₂O 1-10％，KCl 0.1-10％，FeSO₄·7H₂O 0-1％，NaCl 0.1-3％；pH为7.0-7.2；

或者，所述种子培养液包括以下原料：酪素水解物0-2％，酵母提取物0-2％，柠檬酸钠0.1-0.8％，蛋白胨0.1-1％，KCl 0.1-5％，MgSO₄ 0-5％；pH为7.0-7.2。

所述种子培养的培养条件为培养温度20-30℃，培养时间48-72h，摇床转速为110-140r/min；优选为培养温度25℃，培养时间48h，摇床转速130r/min。

步骤(2)中，所述种子液在发酵培养基中的接种量以体积百分比计为3-10％。

可以通过改变发酵培养基的盐度(12g/L-32g/L)来控制胞外多糖的产量。

以重量百分比计，所述发酵培养基包括以下原料：酪素水解物0-2％，酵母提取物0-3％，柠檬酸钠0-1％，蛋白胨0.1-2％，KCl 0.1-1％，MgSO₄ 0.1-10％；pH为7.0-7.2。

优选地，所述发酵培养基包括以下原料：酪素水解物0.8％，酵母提取物1.5％，柠檬酸钠0.5％，蛋白胨0.8％，KCl 0.3％，MgSO₄ 4％；pH为7.0。此配方盐度较高且配比合适，多糖产量最高。

所述发酵培养的培养温度为20-30℃，培养时间为72-96h；优选为培养温度25℃，培养时间96h。

所述发酵培养为摇床振荡培养，摇床转速为110-140r/min，优选为130r/min。

步骤(3)中，发酵培养完成后，胞外多糖存在于发酵液中，通过合适的提取方法可以将其制备出来。

所述提取包括：向发酵液中加入乙醇溶液，通过醇沉法得到胞外多糖水溶液；采用Savage试剂法脱除胞外多糖水溶液中的蛋白质，干燥，得到胞外多糖。

具体地，可以采用如下提取方法：①醇沉法：取纱布过滤后的发酵液加入4倍体积的95％乙醇，混均后4℃下放置24h，于4℃、4000r/min离心20min，沉淀中加入80mL蒸馏水，沸水浴溶解30min，1000r/min离心取上清液即为胞外多糖水溶液。②脱除蛋白：(Savage法)将预先配制好的Savage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)加入多糖水溶液中(多糖水溶液∶Savage试剂＝5∶1)，剧烈振荡30min，以4000r/min离心20min，除去蛋白乳化层，将上清液再用此方法处理，重复3次，得到脱去蛋白质的上清液。

本发明具有如下有益效果：(1)提供的玫瑰色库克菌ZJUQH是从青海茶卡盐湖湖水中分离得到的，能够用于制备微生物胞外多糖，增加了多糖生产的菌株来源；利用该菌株生产多糖的产量达到8.93-21.49g/L，经培养基改良后，多糖产量可达到44.77g/L；(2)该嗜盐菌耐盐度高，其对环境的适应能力赋予了它相对其他微生物的优势。高盐度的发酵环境不仅能提高多糖产量，还能减少其他微生物的污染，降低人工和成本，有利于工业化生产，为工业化生产多糖提供新途径。

附图说明

图1为玫瑰色库克菌ZJUQH的革兰氏染色的显微图片；

图2为玫瑰色库克菌ZJUQH的分子鉴定进化树；

图3为玫瑰色库克菌ZJUQH在发酵培养基中的生长曲线。

具体实施方式

实施例1菌株的分离、驯化、纯化、鉴定和保藏

1、菌株的分离、驯化、纯化

(1)分离：采用稀释涂布分离法，从样品(青海茶卡盐湖湖水)中分离出耐盐微生物。

(2)驯化：对耐盐微生物的驯化筛选是逐级挑选对NaCl百分比含量的耐受过程，设定耐盐驯化培养基的含NaCl量分别为0.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％。利用固体培养基划线培养，逐级提高NaCl百分比含量。经反复平板涂布、划线至得到单一菌落，最后筛选出具有高稳定性的耐盐菌，并于4℃冰箱中保存。

(3)纯化：将驯化筛选出的菌落进行划线培养，然后置于恒温培养箱中培养至单菌落出现，在生物显微镜下观察，若不是单一的微生物细胞，则继续划线分离直到获得纯培养的单细胞微生物。

2、菌株的鉴定

(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株按《伯杰氏细菌鉴定手册(第8版)》中规定的方法进行生理生化特性测定，得到该菌株的主要形态及生物学特征如下：红色、圆形菌落，表面光滑，革兰氏阳性菌，无荚膜、无芽孢，未见鞭毛；其具体生理生化鉴定见表1。革兰氏染色的显微图片如图1所示。

表1菌株生化试验结果

(2)菌株的序列测定：用PCR扩增产物进行切胶纯化测序，将测序结果与所有己知的16SrDNA序列进行最大同源性比较，发现该菌与己知的玫瑰色库克菌上的16SrDNA具有很高的同源性，该菌株的分子鉴定进化树见图2。结合该细菌的培养特征、细胞形态及典型的生理生化特征，确定该内菌株为玫瑰色库克菌(Kocuria rosea)，命名为玫瑰色库克菌ZJUQH。

3、菌株的保藏

该菌株保藏在武汉大学中国典型微生物菌种中心(CCTCC)，编号为CCTCC NO：M 2016754。

实施例2玫瑰色库克菌ZJUQH在12g/L盐度下发酵制备胞外多糖

(1)菌株的活化：用接种环将嗜盐菌划线接种于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28℃；其中活化培养基包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，柠檬酸三钠0.3％，MgSO₄·7H₂O 2％，KCl 0.2％，FeSO₄·7H₂O 0.005％，NaCl 0.5％，琼脂粉3％；蒸馏水配制；pH为7.0-7.2。

(2)种子液的制备：将步骤(1)培养获得的嗜盐菌的单菌落接种于100ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养48h，温度25℃，转速130r/min；其中，种子培养液包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，柠檬酸三钠0.3％，MgSO₄·7H₂O 3％，KCl 0.2％，FeSO₄·7H₂O 0.005％，NaCl 0.5％；pH为7.0-7.2。

(3)发酵液的制备：以体积百分比为5％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养96h，温度25℃，转速130r/min，获得所需的发酵液，收集备用，测粗多糖产量；其中，发酵培养基包括以下原料(以重量百分比计)：酪素水解物0.5％，酵母浸粉1％，柠檬酸钠0.3％，蛋白胨0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄ 1％；蒸馏水配制，调pH至7.0；12l℃湿热灭菌20min。

(4)多糖提取：①醇沉法：取纱布过滤后的液体培养基加入4倍体积的95％乙醇，混均后4℃下放置24h，于4℃、4000r/min离心20min，沉淀中加入80mL蒸馏水，沸水浴溶解30min，1000r/min离心取上清液即为胞外多糖水溶液。②脱除蛋白：(Savage法)将预先配制好的Savage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)加入多糖水溶液中(多糖水溶液∶Savage试剂＝5∶1)，剧烈振荡30min，以4000r/min离心20min，除去蛋白乳化层，将上清液再用此方法处理，重复3次，得到脱去蛋白质的上清液。将上清液预冻一天冻干两天后称干重并计算得出多糖生产量为8.93g/L。

实施例3玫瑰色库克菌ZJUQH在22g/L盐度下发酵制备胞外多糖

(1)菌株的活化：用接种环将嗜盐菌划线接种于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28℃；其中活化培养基包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，柠檬酸三钠0.3％，MgSO₄·7H₂O 2％，KC1 0.2％，FeSO₄·7H₂O 0.005％，NaCl 0.5％，琼脂粉3％；蒸馏水配制；pH为7.0-7.2。

(2)种子液的制备：将步骤(1)培养获得的嗜盐菌的单菌落接种于100ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养48h，温度25℃，转速130r/min；其中，种子培养液包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，柠檬酸三钠0.3％，MgSO₄·7H₂O 3％，KCl 0.2％，FeSO₄·7H₂O 0.005％，NaCl 0.5％；pH为7.0-7.2。

(3)发酵液的制备：以体积百分比为5％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养96h，温度25℃，转速130r/min，获得所需的发酵液，收集备用，测粗多糖产量；其中，发酵培养基包括以下原料(以重量百分比计)：酪素水解物0.5％，酵母浸粉1％，柠檬酸钠0.3％，蛋白胨0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄ 2％；蒸馏水配制，调pH至7.0；121℃湿热灭菌20min。

(4)多糖的提取：①醇沉法：取纱布过滤后的液体培养基加入4倍体积的95％乙醇，混均后4℃下放置24h，于4℃、4000r/min离心20min，沉淀中加入80mL蒸馏水，沸水浴溶解30min，1000r/min离心取上清液即为胞外多糖水溶液。②脱除蛋白：(Savage法)将预先配制好的Savage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)加入多糖水溶液中(多糖水溶液∶Savage试剂＝5∶1)，剧烈振荡30min，以4000r/min离心20min，除去蛋白乳化层，将上清液再用此方法处理，重复3次，得到脱去蛋白质的上清液。将上清液预冻一天冻干两天后称干重并计算得出多糖生产量为15.76g/L。

实施例4玫瑰色库克菌ZJUQH在32g/L盐度下发酵制备胞外多糖

(1)菌株的活化：用接种环将嗜盐菌划线接种于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28℃；其中活化培养基包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，柠檬酸三钠0.3％，MgSO₄·7H₂O 2％，KCl 0.2％，FeSO₄·7H₂O 0.005％，NaCl 0.5％，琼脂粉3％；蒸馏水配制；pH为7.0-7.2。

(2)种子液的制备：将步骤(1)培养获得的嗜盐菌的单菌落接种于100ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养48h，温度25℃，转速130r/min；其中，种子培养液包括以下原料(以重量百分比计)：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，柠檬酸三钠0.3％，MgSO₄·7H₂O 3％，KCl 0.2％，FeSO₄·7H₂O 0.005％，NaCl 0.5％；pH为7.0-7.2。

(3)发酵液的制备：以体积百分比为5％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养96h，温度25℃，转速130r/min，获得所需的发酵液，收集备用，测粗多糖产量；其中，发酵培养基包括以下原料(以重量百分比计)：酪素水解物0.5％，酵母浸粉1％，柠檬酸钠0.3％，蛋白胨0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄ 3％；蒸馏水配制，调pH至7.0；121℃湿热灭菌20min。

(4)多糖的提取：①醇沉法：取纱布过滤后的液体培养基加入4倍体积的95％乙醇，混均后4℃下放置24h，于4℃、4000r/min离心20min，沉淀中加入80mL蒸馏水，沸水浴溶解30min，1000r/min离心取上清液即为胞外多糖水溶液。②脱除蛋白：(Savage法)将预先配制好的Savage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)加入多糖水溶液中(多糖水溶液∶Savage试剂＝5∶1)，剧烈振荡30min，以4000r/min离心20min，除去蛋白乳化层，将上清液再用此方法处理，重复3次，得到脱去蛋白质的上清液。将上清液预冻一天冻干后称干重并计算得出多糖生产量为21.49g/L。

实施例5玫瑰色库克菌ZJUQH在改良后的发酵培养基条件下发酵制备胞外多糖(盐度为43g/L)

(1)菌株的活化：用接种环将嗜盐菌划线接种于活化培养基上，并于恒温培养箱中培养24-72h，培养温度设定为28℃；其中活化培养基包括以下原料(以重量百分比计)：酪素水解物0.5％，酵母提取物1％，柠檬酸钠0.3％，蛋白胨0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄ 1％，琼脂粉3％；蒸馏水配制，pH为7.0。

(2)种子液的制备：将步骤(1)培养获得的嗜盐菌的单菌落接种于50ml的种子培养液中，并将其置于恒温摇床中振荡培养48h，温度25℃，转速130r/min；其中，种子培养液包括以下原料(以重量百分比计)：酪素水解物0.5％，酵母提取物1％，柠檬酸钠0.3％，蛋白胨0.5％，KCl 0.2％，MgSO₄1％；蒸馏水配制，pH为7.0。

(3)发酵液的制备：以体积百分比为5％的接种量将步骤(2)所获得的种子液转入已消毒灭菌的发酵培养基中，发酵培养96h，温度25℃，转速130r/min，获得所需的发酵液，收集备用，测粗多糖产量；其中，发酵培养基包括以下原料(以重量百分比计)：酪素水解物0.8％，酵母提取物1.5％，柠檬酸钠0.5％，蛋白胨0.8％，KCl 0.3％，MgSO₄ 4％；蒸馏水配制，调pH至7.0；121℃湿热灭菌20min。

(4)多糖的提取：①醇沉法：取纱布过滤后的液体培养基加入4倍体积的95％乙醇，混均后4℃下放置24h，于4℃、4000r/min离心20min，沉淀中加入80mL蒸馏水，沸水浴溶解30min，1000r/min离心取上清液即为胞外多糖水溶液。②脱除蛋白：(Savage法)将预先配制好的Savage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)加入多糖水溶液中(多糖水溶液∶Savage试剂＝5∶1)，剧烈振荡30min，以4000r/min离心20min，除去蛋白乳化层，将上清液再用此方法处理，重复3次，得到脱去蛋白质的上清液。将上清液预冻一天冻干两天后称干重并计算得出多糖生产量为44.77g/L。

可见，实施例2-4通过改变发酵液的盐度(操作中将MgSO₄的添加量作变量)来控制多糖的产量。发酵液盐度为12g/L-32g/L，多糖产量为8.93g/L-21.49g/L。发现发酵液盐度越高，多糖产量也越高。而实施例5通过改良发酵培养基，多糖产量达到44.77g/L。

由实施例2-5可知，利用实施例5的嗜盐菌制备多糖时，不仅操作简便，而且制备获得的多糖产量最高，为44.77g/L，是值得研究的一种新的产多糖的嗜盐菌菌株。

综上，本实施例利用获得的嗜盐玫瑰色库克菌菌株制备多糖，即该菌株能够产多糖，从而增加了多糖生产菌株的新菌株来源。