本发明涉及生物絮团的培养，尤其是涉及一种培养生物絮团的方法及在凡纳缤对虾养殖中的应用。
背景技术：
生物絮团技术核心在于通过添加碳源和益生菌于养殖水体中，提高水体C/N比，促异养微生物来发挥净化水质和絮凝作用。传统的养殖系统内微生物对残余饵料及有机废物的转化率是极低的，仅有5％～7％的氮和4％～6％的磷被微生物转化，调控好养殖水体的碳和氮，微生物对残饵粪便的转化率就会明显提高，若按照C/N＝8-10在养殖水体内添加碳源，养殖系统有机氮和无机氮均可利用，氨可以被净消耗，浓度为10mg/L的氨态氮在5h内即可全部去除。研究证明，通过添加碳源也就是利用生物絮团技术，可有效去除养殖水体的有机氮。通过大量实验证实，水体内碳、氮数量比值是对异养菌繁殖的主要影响因素，因而提出应用C/N比值调控异养微生物的技术，认为只有C/N比值达到10以上时，才有利于异养菌的发育。
生物絮团技术采用添加碳源控制水体C/N比，养殖池内的异养微生物在充分曝气条件下形成生物絮团，既可以作为养殖作物的额外食物来源，又可通过异养微生物吸收转化残饵、养殖作物排泄物以及有害的病原菌及其代谢物可被有效降解。通过微生物的控制与管理，来解决高密度养殖过程中易出现的问题，通过特定的芽孢杆菌与乳酸菌等形成生物絮团，该絮团由以菌胶团、丝状细菌为核心，附着微生物胞外产物胞外聚合体、多糖类、多聚磷酸盐等，以及二价的阳离子，附聚的异养菌、硝化菌、脱氮细菌、微藻类、真菌、原生动物等生物形成的絮团。絮团的大小范围为800μm左右，比表面积为50～150cm2/ml。絮团内的活的生物体占10％～90％，因此它具有自我繁殖能力。以细菌为基础的絮状物可以作为饵料源，提供部分营养，补充配合饲料不足的营养，从而间接提高了对虾对饲料蛋白质的利用率。既降低了养殖水体中的有害物质的积累，又可作为食物提高饲料利用率，从而提高养殖产量，增加养殖收益。
本申请人在中国专利CN103497906A中公开一种微生态制剂及其制备方法与应用，涉及水产养殖。微生态制剂含有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的至少一种和植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种；
短小芽孢杆菌包括：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151，保藏编号CCTCC NO:M 2013291；
嗜酸乳杆菌包括：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7，保藏编号CCTCC NO:M 2013294。
在制备促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治病害，提高存活率，净化养殖水质制剂中应用。
本申请人在中国专利CN102242071A公开一种能够降解碳链长度为12C～36C直链烷烃的新颖的微生物——季也蒙毕赤酵母，菌株编号510-6jm(Pichia guilliermondii sp.510-6jm)CCTCC NO：M 2010173。一种来源于深海的新种季也蒙毕赤酵母，利用该菌降解石油烃类物质，主要用于生物修复和工业清洗行业。本发明公开了培养该菌所需的原料，利用该原料可培养大量的菌体细胞用于降解石油烃。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种培养生物絮团的方法及在凡纳缤对虾养殖中的应用。
所述培养生物絮团包括：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7和季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii sp.510-6jm)510-6jm；
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151的保藏编号为CCTCC NO:M 2013291；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7的保藏编号为CCTCC NO:M 2013294；
所述季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii sp.510-6jm)510-6jm的保藏编号为CCTCC NO：M20100173。
所述培养生物絮团的方法包括以下步骤；
1)制备短小芽孢杆菌剂、嗜酸乳杆菌剂和季也蒙毕赤酵母菌菌粉，具体方法如下：
(1)将相应的冻存的菌种活化划线于相应的平板，再将活化后的单克隆接种于种子培养基培养，配制种子培养基500ml，灭菌；
(2)配制发酵培养基，将50L发酵培养基作为一级种子培养基，乳酸菌发酵，加入低聚果糖或海藻糖等中的一种作为促进乳酸菌生长剂，灭菌；
(3)培养获得的初级活化种子接种于50L一级种子培养基中培养，通过移种管接种于1000L发酵培养基中培养；
(4)发酵结束后，短小芽孢杆菌和季也蒙毕赤酵母菌通过管式离心机离心收集菌体；
(5)将步骤(4)获得的菌泥添加维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖等中的至少两种作为保护剂，起到协调保护作用，混合后，将菌泥平铺于样品冻干机的样品板，并将菌泥分成小块；
(6)乳酸菌发酵结束后，用水稀释，再加入维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖等中的至少两种作为保护剂；
2)每天采用每亩水体泼洒芽孢杆菌菌粉、酵母菌菌粉和乳酸菌菌剂的方式，并在养殖池四周中下层设置纳米曝气管曝气，形成絮团；
3)对养殖水体的C/N比进行调节，控制C/N在(12～14)︰1；
4)生物絮团培育好后在养殖期间每天每亩水体泼洒短小芽孢杆菌剂、季也蒙毕赤酵母菌菌粉和嗜酸乳杆菌剂。
在步骤1)第(1)部分中，所述培养可静置培养18h；所述灭菌可在115℃灭菌30min。
在步骤1)第(2)部分中，所述低聚果糖或海藻糖的加入量按质量百分比可为乳酸菌的0.5％，所述灭菌可在115℃灭菌30min。
在步骤1)第(3)部分中，所述接种于50L一级种子培养基中培养可静置培养12h；所述接种于1000L发酵培养基中培养可培养48h。
在步骤1)第(5)部分中，所述维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖的添加量按质量百分比可为菌泥的1％。
在步骤1)第(6)部分中，所述用水稀释可采用自来水进行等体积稀释，再调节pH至3～4；所述维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖的添加量按质量百分比可为乳酸菌发酵结束后产物的1％。
在步骤2)中，所述芽孢杆菌菌粉和酵母菌菌粉的泼洒量可为200～300g，所述乳酸菌菌剂的泼洒量可为1～2L；所述曝气可连续操作3天，所形成的絮团的直径可为800～1000μm。
在步骤3)中，所述调节可采用稀释后的糖蜜对养殖水体的C/N比进行调节。
在步骤4)中，所述短小芽孢杆菌剂和季也蒙毕赤酵母菌菌粉的泼洒量可为80～150g，嗜酸乳杆菌剂的泼洒量可为0.5～1L。
短小芽孢杆菌生命力极强，对环境适应能力强、不易变异、胞外酶系多、生理代谢产物无毒且芽胞杆菌产品，适合于产业化大规模生产，技术成熟，生产稳定，产量高，周期短。尤其是芽胞的休眠体耐酸碱、耐干旱高温可以长期贮存。在动物肠道酸性环境中具有高度的稳定定性，可使肠道pH值及氨浓度降低，能产生较强活性的蛋白酶和淀粉酶，促进水产动物的消化，并且能提高动物的免疫力、抑制部分病原菌，因此具有一定的防治疾病的功能。该菌种生理代谢旺盛，能在水体中迅速繁殖，并产生大量的胞外酶类，可利用、消耗池塘中的残饵和动物排泄物等大分子有机质。大分子有机物被分解为小分子的有机酸、氨基胞内产物等物质。
季也蒙毕赤酵母菌从海洋自然环境中分离出来的单细胞真核生物，菌体富含蛋白质、肝糖不饱和脂肪酸、幼体促生长激素、虾青素等，能显著提高水产动物幼体的存活率，改善成体饲养效果，并能增强水产动物免疫力、减少抗生素用量，是生态养殖的优良添加剂。
本发明培养的生物絮团可在凡纳缤对虾养殖中应用。具体是由芽孢杆菌粉末、酵母菌粉末和乳酸菌菌液3种混合制剂泼洒在水产养殖中的应用，促进水体形成生物絮团有利于养殖经济作物-凡纳滨对虾提高免疫力和抗病力、抑制由弧菌引起的病害、增加摄食量提高凡养殖存活率中的应用。
本发明能够在较短时间内形成生物絮团且能够在养殖期间通过合理调控维持生物絮团的稳定存在，降低水体氨氮和亚硝酸盐，尤其是增加对虾摄食量，促进凡纳滨对虾生长，提高对虾免疫力和抗病力，提高对虾存活率。
本发明以持续性、低添加量添加微生物菌粉与液体菌剂，以稀释后的糖蜜控制水体碳氮比在(12～14)︰1范围、养殖池中下层充分曝气形成低速环流有利于生物絮团快速形成。
本发明选用的菌株特性及功能如下
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151，保藏编号CCTCC NO：M2013291，芽胞杆菌生命力极强，对环境适应能力强、不易变异、胞外酶系多、生理代谢产物无毒且芽胞杆菌产品。
季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii sp.510-6jm)510-6jm保藏编号CCTCC NO：M20100173从海洋自然环境中分离出来的单细胞真核生物，菌体富含蛋白质、不饱和脂肪酸、幼体促生长激素、虾青素等，能显著提高水产动物幼体的存活率，改善成体饲养效果，并能增强水产动物免疫力、减少抗生素用量，是生态养殖的优良添加剂
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7，保藏编号CCTCC NO：M2013294，可以进入水产动物肠道，可以调节肠道菌群平衡，产酸能力强且在肠道存活周期长，抑制病原菌生长，提高养殖动物机体免疫力和抗病力。
上述3种微生物菌体已于2013年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明所述的利用芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌通过纳米管曝气、控制水体碳氮比的一种快速培养生物絮团的方法，在凡纳缤对虾养殖中的应用，能够在泼洒所述三种经过筛选在养殖对虾方面具有明显效果的复合微生态制剂后三天内快速形成较大絮团量的的生物絮团，在凡纳缤对虾养殖过程中提高对虾抗病力与免疫力，净化养殖水质，增加对虾摄食量，提高养殖质量和产量等方面具有显著效果。
具体实施方式
实施例1用于培养生物絮团的微生物制剂菌体制备
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294的培养：将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基；乳酸菌发酵加入0.5％低聚果糖作为促进乳酸菌生长剂，发酵培养基配方(W/V)：糖蜜6％、红糖3％、酵母膏0.03％、蛋白胨0.6％、低聚糖0.5％、硫酸镁0.05％、硫酸锰0.05％、碳酸钙0.5％；发酵条件为37℃静置培养36～48h，发酵结束后进行稀释2倍处理，调节pH至3～4，并加入海藻糖、维生素C，低聚果糖、甘露醇，淀粉糊精中的至少一种，并按1％～3％比例混合均匀，经测定菌量大于10亿/mL。
芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1A08151，保藏编号CCTCC NO：M2013291的培养方法：将出发菌株按斜面、液体种子、大体积液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规的营养琼脂培养基或肉汤培养基；大体积液体发酵的培养基配方：W/V：豆饼粉3％、淀粉1.5％、玉米浆1％、葡萄糖0.5％、(NH4)2SO4 0.1％、NH4CL 0.1％、，KH2PO4 0.05％、NaH2PO40.5％、MgSO4 0.05％、MnSO4 0.05％；发酵培养条件为28～37℃通气培养36～48h，发酵结束离心收集菌体，添加1％的维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖中的至少两种作为保护剂，起到协调保护作用，进行混合均匀冻干，按照剂型要求，添加固体辅料制成片剂、粉剂中的一种；所述固体辅料包括石灰石、沸石粉、活性碳、硅藻土中的至少一种并加入相应的微量元素。经测定菌量大于40亿/g。
毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii sp.510-6jm)510-6jm保藏编号CCTCC NO：M20100173的培养方法：将出发菌株按斜面、液体种子、二级种子及液体发酵的顺序培养；斜面活化固体培养基为：YPD固体培养基；液体种子培养基为YPD液体培养基摇瓶培养接种于二级种子及大体积液体发酵培养基培养基：糖蜜6％、葡萄糖2％、酵母膏0.5％、蛋白胨2％、KH2PO40.05％、MgSO4 0.05％、单独灭菌(NH4)2SO4 0.1％；发酵结束离心收集菌体，添加1％的维生素C、海藻糖、淀粉糊精、低聚果糖中的至少两种作为保护剂，起到协调保护作用，进行混合均匀冻干，按照剂型要求，添加固体辅料制成片剂、粉剂中的一种；所述固体辅料包括石灰石粉、沸石粉、活性碳、硅藻土中的至少一种并加入相应的微量元素。经测定菌量大于40亿/g。
实施例2快速培养生物絮团的试验
一、材料与方法
1.试验产品：实施例1的复合微生态制剂。
2.试验水体：试验用水取自砂滤海水。
3.试验场地：试验在80cm×100cm×100cm(长×宽×高)的玻璃纤维缸中进行。试验缸置于室内靠窗自然条件下放置，并在玻璃纤维缸四周按同一方向排布纳米曝气管，分别置于缸底10CM和50CM高度。
4.试验方法：采用6口规格为：80cm×100cm×100cm(长×宽×高)的玻璃纤维缸中养殖体长为3cm凡纳缤对虾100尾进行试验，其中3口为实验组，3口为对照组；周期30天，实验组采取糖蜜调节水体C/N比控制在(12～14)︰1；微生物制剂(芽孢杆菌1g、乳酸菌制剂6mL、酵母菌2g)与玉米芯粉5g混合，水份含量不超过60％，37℃发酵过夜后泼洒；对照组只进行正常投料喂养。统计生物絮团沉积量：使用沉淀漏斗测定生物絮团的沉积量，取样静置15min后读数。
测定水体中氨氮、亚硝酸盐含量：水样通过0.2μm微孔滤膜，使用真空抽滤泵进行过滤，滤液用于水质指标测定，氨氮(NH3-N)含量测定采用次溴酸盐氧化法(国家海洋局，2007)，亚硝酸氮(NO2--N)含量采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定(国家海洋局，1991)，硝酸氮(NO3--N)含量测定采用锌-镉还原法(国家海洋局，1991)。统计虾体存活个数与体重、体长。
一、试验结果
1、生物絮团形成的影响
实验组在加入微生物制剂的第三天，通过沉淀漏斗测定生物絮团的沉积量，取样静置15min后读数，絮团量基本达到12ml/L，在以后的几天絮团都稳定在10ml/L左右，相比其他方法培养生物絮团的方法时间上较为快速稳定的培养出絮团；对照组通过沉淀漏斗测定生物絮团的沉积量仅为3ml/L左右。
2、对水体氨氮、亚硝酸盐的影响
在试验第7天开始测定6口试验缸中水体氨氮、亚硝酸盐的含量：实验组的3口水体中氨氮、亚硝酸盐含量均低于0.01mg/L,对照组水体中氨氮含量均在0.01～0.02mg/L、亚硝酸盐含量在0.02～0.03mg/L；
3、对存活率、虾体长体得的影响
在试验的第30天，对6口缸中的存活虾及其体长体得进行统计；实验组平均存活93尾对虾、平均体长为5.5cm、体重平均为2.48g，对照组平均存活78尾对虾、平均体长为4.5cm、体重平均为1.36g
实施例3本发明的快速培养生物絮团在对虾养殖中的应用试验1
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂。
2、试验对虾：试验周期投苗至30天的对虾全程使用。设5口实验池和5口对照池，体积为5m×5m×1.5m,水深1.2m的水泥池，四周配置纳米曝气管两排，高度分别为距池底10cm与60cm。
3、试验场地：漳州东山岛某对虾养殖场。
4、试验方法：日常饲养时，取实施例1复合菌剂泼洒于养殖池，每天用法用量：芽孢杆菌与酵母菌50g、乳酸菌液体200mL与200g玉米芯粉混合发酵，37℃发酵过夜泼洒；并投加稀释后的糖蜜控制水体碳氮比在(12～14)︰1、早中晚开启曝气管各两h。对照组只进行正常投料喂养。
5、试验结果：
实施例1复合菌剂的使用效果主要体现在快速形成生物絮团，实验组在试验第三天絮团量基本达到10ml/L且通过定期使用复合菌剂与控制水体碳氮比能够稳定维持水体中絮团含量占水体体积10％左右，具体为：(1)水体pH值稳定，絮团量较多且稳定；(2)定期使用实施例1复合菌剂，水体氨氮、亚硝酸盐维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂，虾体生长快，期间无发生病害，存活率高；(3)增加摄食量，对虾肠道增粗，肠道中充满食物，活力较高；养殖全程，实验组使用实施例1复合菌剂的4口实验池对虾基本未见病害发生，而4口对照池常有病害发生，使用较多的消毒剂，其中有1口中对照池因病害严重致对虾大规模死亡而最终排塘。
实施例4本发明的快速培养生物絮团在对虾养殖中的应用试验2
1、试验产品：实施例1的复合微生态制剂及其絮团培养方法。
2、试验对虾：凡纳滨对虾。
3、试验厂地：福建长乐市梅花镇某对虾苗养殖厂中的高位池，面积为每池一亩，水深3m。
4、试验方法：选择四口对虾养殖池，其中一口为对照池，三口为实验池，养殖前期每天用法用量：芽孢杆菌与酵母菌1000g、乳酸菌液体10L与12kg玉米芯粉混合发酵，32～37℃发酵36h后泼洒，每天泼洒一次并在早中晚各开启一次纳米曝气管两h(纳米曝气管排布为：养殖池四周同一方向，高度为距池底20cm、150cm两个高度)，絮团培养好后微生态制剂泼洒量减半。同时实验池水体投加稀释过的糖蜜作为碳源供给絮团微生物生长需求。投料喂养与对照池相同。
5、实验结果：
实施例1复合菌剂的使用效果主要体现在快速形成生物絮团，实验组在试验第三天絮团量基本达到8ml/L且通过定期使用复合菌剂与控制水体碳氮比能够稳定维持水体中絮团含量占水体体积12％左右，具体为：(1)水体pH值稳定，絮团量较多且稳定；(2)定期使用实施例1复合菌剂，水体氨氮、亚硝酸盐维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂，虾体生长快，期间无发生病害，存活率高；(3)增加摄食量，对虾肠道增粗，肠道中充满食物；(4)三口实验组存活率均高于对照组25％左右，每池产量高于对照组约800～1000kg。
本发明提供了一种快速培养生物絮团的方法及应用于水产养殖的方法，通过往水体添加微生物菌剂、以市售玉米芯粉为絮团载体及池底中下层同一方向采用纳米管充分曝气形成环流，并添加糖蜜稀释液控制水体碳氮比促使生物絮团形成，在养殖期间维持生物絮团占养殖水体的体积比在10％左右，本发明通过添加微生物菌剂、糖蜜稀释液作为碳源降低了生物絮团培养成本、促进生物絮团更加快速地生成，获得粒径为800～1000μm的生物絮团；充分曝气能有效促进水体流动及增加溶氧量，有利于池底物质上浮实现生物絮团的再悬浮与再利用；有效控制凡纳缤对虾高密度养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐、弧菌等理化参数，提高饲料利用率，调节养殖水体水质，降低发病率。