本发明涉及水产养殖，尤其是涉及一种高菌量乳酸菌制剂及其制备方法与应用。
背景技术：
在水产养殖中，微生态制剂作为抗生素的替代品，一方面通过有益微生物降解养殖环境的氨氮、亚硝酸盐、硫化氢、饵料残渣、粪便排泄物等净化水质，为养殖动物营造一个良好的水体环境，防止病原菌滋生；另一方面，通过有益微生物产生代谢产物和活性物质如有机酸、抗菌肽等来抑制或者杀灭病原菌，同时提高养殖动物免疫力和抵抗力，达到防治病害的目的；再者有益微生物通过产生多种消化酶，帮助蛋白质、碳水化合物、脂肪代谢、提高饲料的利用率和转化率，达到减少资源消耗和增产的目的。
乳酸菌作为常见微生态益生菌的一种，可通过大量产生有机酸、酶、细菌素等生物活性物质抑制病原菌的繁殖与定植，可维持养殖动物肠道内微生态平衡与正常的生理功能。乳酸菌是定植在动物肠道内的有益菌群，以乳酸菌为代表的专性厌氧菌群是构成定植抗力的主要力量(定植抗力指宿主对致病菌和潜在致病菌在正常微生物群中繁殖和定植的阻抗力)。乳酸菌产生的细菌素是一类具有抑菌活性的多肽或者蛋白类物质，部分细菌素的抑菌谱较广，对多种革兰氏阳性菌有较强的抑制作用。本发明所述乳酸菌制剂对于促进水产养殖动物生长，提高免疫力和抗病力，防治病害尤其是弧菌类病原体造成的病害方面有显著作用。
乳酸菌在发酵过程中由于代谢产物乳酸及其他有机酸累积对其自身细胞生长的抑制作用，单位活菌量与其他益生菌如芽孢杆菌等相比较较低，一般条件下仅能达到芽孢杆菌的30％左右，对于乳酸菌制剂的实际应用造成很大的制约，因而可通过降低上述抑制作用的影响，延长乳酸菌的对数生长期，从而获得较高浓度的乳酸菌制剂。
目前市场上与水产养殖相关的乳酸菌类制剂发酵主要采取两种方式，一种为常规厌氧培养，如多数EM菌剂，此类培养方法得到的发酵产物中乳酸菌含量较低，一般低于5×108CFU/mL，无法满足大规模水产养殖中的需求；另一种为高密度发酵培养，采取流加氨水或NaOH、KOH等方式控制发酵液pH，最后以离心方式浓缩乳酸菌发酵液，此类培养方法得到的发酵产物中乳酸菌含量一般高于1011CFU/mL，但对设备要求较高且操作复杂，发酵成本较高，限制了在大规模水产养殖中的应用。
本申请人在中国专利CN103497906A中公开一种微生态制剂及其制备方法与应用，涉及水产养殖。微生态制剂含有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的至少一种和植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的至少一种；
植物乳杆菌包括：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806，保藏编号CCTCC NO:M 2013293；
嗜酸乳杆菌包括：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7，保藏编号CCTCC NO:M 2013294。
在制备促进对虾或石斑鱼生长，提高对虾或石斑鱼免疫力和抗病力，防治病害，提高存活率，净化养殖水质制剂中应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高菌量乳酸菌制剂及其制备方法。
本发明的另一目的是提供一种高菌量乳酸菌制剂的应用。
所述高菌量乳酸菌制剂含有植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌等中的至少一种；所述植物乳杆菌含量占总菌数百分比50％～60％；所述嗜酸乳杆菌含量占总菌数百分比40％～50％；总量为100％。
所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806；
所述嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806的保藏编号为CCTCC NO：M2013293；
所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7的保藏编号为CCTCC NO：M2013294。
所述高菌量乳酸菌制剂中，植物乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液均按照本领域常规的深层液体发酵培养的方式获得，经过平板活化、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养。具体可以通过以下方法制备得到：
植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的培养：
将出发菌株按平板活化、液体种子、液体发酵的顺序培养，平板和种子培养基为常规MRS培养基。
经数学模型优化后，植物乳杆菌发酵培养基的主要组分及其含量如下：糖蜜4％～6％，红糖1％～2％，酵母粉0.02％～0.04％，蛋白胨0.4％～0.6％，KH2PO4 0.15％～0.25％，FeSO40.01％～0.02％，MnSO40.005％～0.01％，CaCO30.3％～0.5％，发酵培养条件为28～37℃，静置培养36～48h，当发酵液pH降至4.7时补加30％NaCO3及10％CaCO3混合液，12h后再补加一次，发酵结束后发酵液活菌数≥1.1×1010CFU/mL。
经数学模型优化后，嗜酸乳杆菌发酵培养基的主要组分及其含量如下：糖蜜3％～5％，红糖2％～3％，酵母粉0.04％～0.06％，蛋白胨0.4％～0.6％，KH2PO4 0.15％～0.3％，FeSO40.01％～0.02％，MnSO40.005％～0.01％，CaCO30.3％～0.5％，发酵培养条件为28～37℃，静置培养36～48h，当发酵液pH降至4.7时补加30％NaCO3及10％CaCO3混合液，12h后再补加一次，发酵结束后发酵液活菌数≥1010CFU/mL。
所述高菌量乳酸菌制剂的存在形式为微生物菌体发酵液或者微生物冻干菌体与固体辅料的混合物。
当所述高菌量乳酸菌制剂的存在形式为微生物菌液时，制备方法如下：
将植物乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液按比例均匀混合即可；混合后可加入维生素C，低聚果糖、甘露醇等中的至少一种作为保护剂，起到协调保护作用，利于微生态制剂的保藏。
当所述高菌量乳酸菌制剂的存在形式为微生物菌粉与固体辅料的混合物时，制备方法如下：将植物乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液按比例均匀混合，并加入添加剂，所述添加剂可选自海藻糖、甘油、淀粉糊精、甘露醇、低聚果糖等中的至少一种，所述添加剂的添加量按质量百分比可为植物乳杆菌发酵液和嗜酸乳杆菌发酵液的1％～3％，经过浓缩冻干后作为主要活性成分，按照一定的剂型工艺，添加固体辅料制成片剂、散剂、粉剂等。所述固体辅料为本领域常规使用固体辅料，包括石灰石、硅藻土、沸石粉、活性炭、微量元素等中的至少一种。
本发明所述高菌量乳酸菌制剂中的上述任一组合，均具有促进水产养殖动物生长，提高免疫力和抗病力，防治病害尤其是对虾红腿、烂眼、甲壳溃疡等由弧菌引起的病害，增加摄食量，提高存活率，净化养殖水质的作用。在对虾肠道增粗，对虾红腿病、烂眼病及对虾白斑病毒防治应用中具有显著效果。
由此可见，所述高菌量乳酸菌制剂可在制备防治对虾病害、对虾生长促进剂、饲料添加剂、水质净化剂等中应用。所述对虾病害包括对虾红腿、烂眼、甲壳溃疡等由弧菌引起的病害。
本发明选用的菌株特性及功能如下：
植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌：所述植物乳杆菌CCTCC NO：M2013293和嗜酸乳杆菌CCTCC NO：M2013294可以定植水产动物肠道，可以调节肠道菌群平衡，能产生细菌素和乳酸，抑制病原菌生长，提高养殖动物机体免疫力和抗病力。
所述高菌量乳酸菌制剂可促进水产养殖动物尤其是对虾生长，提高对虾抗病力，防治对虾病害发生，提高对虾存活率，净化养殖水质。所述高菌量乳酸菌制剂应用于对虾养殖的使用方法如下：
日常饲养时，取所述菌剂全池均匀泼洒。每5天使用一次，每亩养殖水体用量为1～2L，水质恶化时可加倍使用。同时取菌剂用适量水稀释后均匀喷洒在饲料表面，每100kg饲料使用1～2L,每日拌料投喂，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。
所述高菌量乳酸菌制剂可用于防治凡纳滨对虾养殖期间病害的发生，包括：红腿、烂眼、甲壳溃疡等症状；有效缓解或预防病害发生，极大地降低病害造成的死亡率；同时能改善养殖水质，增强凡纳滨对虾消化吸收功能和抗病能力，提高对虾产量和质量，缩短养殖周期。所述高菌量乳酸菌制剂在防治凡纳滨对虾红腿、烂眼、甲壳溃疡症状时的使用方法和用量如下：
凡纳滨对虾一旦出现红腿、烂眼、甲壳溃疡等病害症状，立即使用所述菌剂。每亩水体用量为500～700ppm，全池均匀泼洒。每两天加一次乳酸菌制剂，每次加菌之前池底清污，少量换水。2天为一个周期，连用6天。
本发明所述乳酸菌制剂制备方法为通过数学模型优化发酵培养基，发酵过程中分批补加121℃、20min灭菌后的30％NaCO3及10％CaCO3混合液，解除乳酸菌发酵产物对于自身生长的抑制作用，发酵结束后乳酸菌含量超过1010CFU/mL，经后续处理可得到质量较为稳定的高菌量乳酸菌制剂。本发明具有操作简单，发酵成本低廉，效果显著，质量稳定等特点，适用于大规模水产养殖。
附图说明
图1为高菌量乳酸菌制剂在对虾养殖30～105天对水体弧菌含量的影响。
具体实施方式
通过以下实施例将对本发明做进一步的说明。
制备例说明：上述已经对本发明的高菌量乳酸菌制剂的制备进行说明，通过植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCC NO：M2013293；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294二种微生物的液体制剂为例进行说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达成制备目的的方法均可以。以下实施例将对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。
包含植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCC NO：M2013293；嗜酸乳杆菌包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294，二种微生物已于2013年6月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为中国，湖北省，武汉市，武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编430072。
实施例1 一种高菌量植物乳杆菌发酵制备
一材料与方法
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)1A07806保藏编号CCTCC NO：M2013293的培养：将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基。发酵培养基配方：糖蜜6％，红糖2％，酵母粉0.02％，蛋白胨0.5％，KH2PO4 0.2％，FeSO40.01％～0.02％，MnSO40.005％～0.01％，CaCO30.5％，发酵条件为28～37℃，静置培养36～48h，通过此方式发酵培养的最终活菌数≥109CFU/mL；
通过分批补加NaCO3及CaCO3的方式提高最终发酵活菌数，方法为在原发酵方式的基础上将NaCO3加水稀释成30％的溶液，再加入10％的CaCO3，121℃灭菌20min，冷却后待发酵液pH降至4.7以下时补加(每次补加总比例0.5％的NaCO3，0.17％的Ca CO3)，12h后再补加一次，最终发酵活菌数提高至1.1×1010CFU/mL以上。
将上述制备的植物乳杆菌菌液中添加维生素C或低聚果糖(添加量1g/L)。
植物乳杆菌菌剂稳定性实验：
植物乳杆菌在常温下避光保存0个月、1个月、2个月、3个月后，分别取样检测菌剂中的乳酸菌含量。乳酸菌采用MRS加2％碳酸钙稀释倒平板法检测，计数时只计算周围有溶钙圈的菌落。同时设1组对照组，对照组为同一菌种，使用MRS培养基常规培养，培养结束后不做其他处理，保存条件及时间与实验组一致。植物乳杆菌发酵及保存方法与常规培养保存方法的单位活菌量对比参见表1。
表1
二试验结果
通过本实施例制备的植物乳杆菌菌剂与MRS培养基常规培养的对照组相比较，单位活菌量高于对照组822％，存放3个月后的单位活菌量高于对照组3752％，存活率提高了255％。
实施例2 一种高菌量嗜酸乳杆菌发酵制备
一、材料与方法
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PL7保藏编号CCTCC NO：M2013294的培养：将出发菌株按斜面、液体种子、液体发酵的顺序培养，斜面和种子培养基为常规MRS培养基。发酵培养基配方(W/V)：糖蜜5％，红糖3％，酵母粉0.04％，蛋白胨0.4％，KH2PO4 0.2％，CaCO30.5％，糖蜜3％，红糖1％，酵母粉0.6％，蛋白胨0.5％，KH2PO4 0.2％，FeSO40.01％～0.02％，MnSO40.005％～0.01％，CaCO3 0.5％，发酵条件为28～37℃，静置培养36～48h，通过此方式发酵培养的最终活菌数≥109CFU/mL；
通过分批补加NaCO3及CaCO3的方式提高最终发酵活菌数，方法为在原发酵方式的基础上将NaCO3加水稀释成30％的溶液，再加入10％的CaCO3，121℃灭菌20min，冷却后待发酵液pH降至4.7以下时补加(每次补加总比例0.5％的NaCO3，0.17％的Ca CO3)，12h后再补加一次，最终发酵活菌数提高至1010CFU/mL以上。
将上述制备的嗜酸乳杆菌菌液中添加维生素C或低聚果糖(添加量1g/L)。
嗜酸乳杆菌菌剂稳定性实验：
嗜酸乳杆菌在常温下避光保存0个月、1个月、2个月、3个月后，分别取样检测菌剂中的乳酸菌含量。乳酸菌采用MRS加2％碳酸钙稀释倒平板法检测，计数时只计算周围有溶钙圈的菌落。同时设1组对照组，对照组为同一菌种，使用MRS培养基常规培养，培养结束后不做其他处理，保存条件及时间与实验组一致。嗜酸乳杆菌发酵及保存方法与常规培养保存方法的单位活菌量对比参见表2。
表2
二试验结果
通过本实施例制备的植物乳杆菌菌剂与MRS培养基常规培养的对照组相比较，单位活菌量高于对照组1172％，存放3个月后的单位活菌量高于对照组3805％，存活率提高了207％。
实施例3 本发明的高菌量乳酸菌制剂在对虾抗病及促进生长的小型应用试验
一材料与方法
1.试验产品：实施例1的植物乳杆菌菌液，总活菌数在80亿个/mL以上。
2.试验对虾：将对虾分为2组，每组250尾，每组设3个重复。
3.试验水体：试验用水为砂滤海水。
4.试验场地：试验在500L的玻璃纤维缸中开展。试验缸置于室外开阔处，自然条件下随机放置。
5.试验方法：
试验周期45天，该试验采取对虾常规饲料喂养，试验组每吨饲料添加试验菌剂1kg，保证每克饲料中活菌数≥107CFU/mL，对照组不加试验菌剂。在试验的第30天和第45天统计每组对虾的重量及存活情况。在试验的第45天，每个试验缸中留下50条对虾，余下取出。往每组试验水体中投加2×106CFU/mL的坎贝氏弧菌VH1进行致病性弧菌感染实验。
二试验结果
1.对促进生长的影响
结果表明，试验组与对照相比，体重约提高了15％，差别具有统计学意义(P<0.05)
2.对存活率的影响
结果表明，试验组与对照组对虾存活率分别为90.5％和78.0％，试验线比对照组高12％左右，差异具统计学意义(P<0.05)
3.有益菌在肠道和水体中的存活情况
通过检测对虾肠道以及养殖水体中肠乳酸杆菌存活数发现，乳酸杆菌在肠道中的存活数达2×106CFU/g，水体中也可检测到一定数量的乳酸杆菌(>1000CFU/ml)。
4.弧菌感染后对虾的存活情况
在试验的第45天，进行致病性弧菌感染实验。经过5天的感染试验，对照组的对虾平均存活率为44％，而试验组对虾存活率高达91.3％，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 本发明的高菌量乳酸菌制剂在对虾虾苗养殖中的应用试验
一材料与方法
1.试验产品：
实施例1、2的两种乳酸菌发酵液等体积混合得到的乳酸菌复合菌剂，总活菌数在50亿个/mL以上。
2.试验对虾：投苗至30天的对虾全程使用。设3口实验池和5口对照池。
3.试验场地：福建漳州市东山县某对虾虾苗养殖场。
4.试验方法：
日常饲养时，取实施例1复合菌剂合池均匀泼洒。每三天使用一次，每亩养殖水体用量为0.5～1L，水质恶化时加倍使用。对照组不使用菌剂。同时取实施例1复合菌剂用适量水稀释后均匀喷洒在饲料表面，每日拌料投喂实验池虾苗，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。而对照组虾苗投喂不加菌剂的饲料。
二试验结果：
复合乳酸菌制剂使用效果主要体现在改善水质、控制水体弧菌数和防治虾苗病害等方面，具体为：(1)改善水质，当水质老化时，泼洒复合菌剂，使用期间，水色较好，pH值稳定，藻类生长旺盛，未见倒藻现象；(2)定期使用实施例1、2混合得到的复合菌剂，水体弧菌维持在较低水平，养殖过程基本不使用消毒剂，虾苗生长快，期间无发生病害，存活率高，相比对照组存活率提高约30％，说明该复合菌剂对对虾虾苗养殖有良好作用。
实施例5 本发明的复合乳酸菌制剂在对虾养殖中的应用试验
一材料与方法
1.试验产品：
实施例1、2两种乳酸菌发酵液等体积混合而成的复合乳酸菌制剂菌液，总活菌数在50亿个/mL以上。
2.试验对虾：投苗至养成的对虾全程使用。设3口实验池和5口对照池。
3.试验场地：福建长乐市张港镇镇某对虾养殖场。
4.试验方法：
日常饲养时，取复合乳酸菌制剂合池均匀泼洒。每五天使用一次，每亩养殖水体用量为1～2L，水质恶化时加倍使用。对照组不使用菌剂。同时取复合乳酸菌制剂用适量水稀释后均匀喷洒在饲料表面，每100kg饲料使用1～2L，每日拌料投喂实验池对虾，连续投喂3天后停用2天，再连用3天。而对照组对虾投喂不加菌的饲料。
二试验结果：
复合乳酸菌制剂的使用效果主要体现在改善水质、控制水体弧菌数和防治对虾病害等方面，具体为：(1)改善水质，使用期间，水色较好，pH值稳定，藻类生长旺盛，未见倒藻现象；(2)定期使用复合乳酸菌制剂，水体弧菌维持在较低水平(见图1)，养殖过程基本不使用消毒剂；(3)增加摄食量，将复合菌拌饲料投喂对虾，连续投喂3天后可见对虾肠道增粗，肠道中充满食物，活力较高；当对虾呈现病态，出现断肠等肠炎症状时，使用复合乳酸菌制剂拌料投喂2天，第三天观察可见肠道恢复正常，摄食情况好转。终养殖全程，使用复合乳酸菌制剂的3口实验池对虾基本未见病害发生，而5口对照池常有病害发生，且需使用较多的消毒剂。对虾最终收成时，实验池比对照池增产约1000kg/亩。
结论
实施例1、2的高菌量乳酸菌制剂及复合乳酸菌制剂与常规培养基发酵的乳酸菌制剂相比较，初始单位活菌量高于对照组800％以上，存放3个月后的乳酸菌活菌量高于对照组3500％以上，存活率提高了200％以上。本发明中涉及的高菌量乳酸菌制剂制备方法与其他高密度乳酸菌发酵方法相比具有成本低，操作简单，效果明显等优点，获得的乳酸菌制剂在促进对虾生长，提高对虾抗病力与免疫力，净化养殖水质，增加对虾摄食量，提高养殖质量和产量等方面具有显著效果，因此在水产养殖中具有重要的应用价值。