雄性育性相关基因HT2925及其应用的制作方法

文档序号：15237754发布日期：2018-08-24 07:29阅读：302来源：国知局

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及植物杂交育种方法，包括不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及一个雄性不育基因ht-2925及其突变体及其在杂交育种中的应用。

技术背景

水稻是我国重要的粮食作物。从上世纪80年代起，以雄性不育为基础的杂交水稻育种技术极大的提高了水稻的单产，在保障我国粮食安全中发挥关键性作用。杂交水稻制种是用恢复系作父本和不育系杂交生产杂交种子的过程。利用作物杂种优势是提高作物产量的重要途径，而作物雄性不育是有效利用杂种优势的前提和基础。水稻育性是影响水稻产量的关键因素，为了提高产量和获取杂种优势，在杂交育种过程中，对雄性不育和雄性可育的遗传操作是一个关键步骤。利用雄性不育系生产杂交种，不仅能节省大量去雄的人工，降低种子成本，而且可以减少因去雄不净所造成的混杂，从而提高种子纯度，充分发挥杂种优势的作用。水稻雄性不育的发现与利用为增加水稻产量，改进品质，增加抗性和适应性提供优异种源，因而在植物育种上具有重要的应用价值。

植物雄性不育是指在有性繁殖过程中不能产生正常可育雄配子体的遗传现象，在广泛的开花植物中普遍存在。水稻作为模式植物，雄性生殖发育的显著特征是形成6枚雄蕊，任何参与雄蕊发育、孢原细胞分化、减数分裂、小孢子的有丝分裂、花粉分化或开花等过程基因的突变，均有可能引起花药发育异常，最终导致雄性不育(mah.moleculargeneticanalysisofmicrosporogenesisandmicrogametogenesisinfloweringplants.annualreviewofplantbiology.2005,56:393-434.)。

雄性不育可以分为细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility，cms)和细胞核雄性不育(genicmalesterility，gms)。细胞质雄性不育的实质是细胞质基因组与细胞核基因组竞争传递自身遗传物质的结果。细胞核雄性不育由核基因突变产生，突变性状可通过雌配子或者雄配子遗传。遗传分析表明，大多数雄性育性是由核基因控制的(sunokm,ki-hongj,do-eunl,dong-yeonl,jinwonl,kyungsookan,hong-gyuk,gynheungan.thericefon1genecontrolsvegetativeandreproductivedevelopmentbyregulatingshootapicalmeristemsize.moleculesandcells.2006,21(1):147-152)。

近年来，随着水稻基因组测序的完成，水稻突变体库的构建以及基因表达谱分析等工作的开展，水稻花粉发育的分子机理研究起取得了一定的进展，发现了一些控制水稻花器官数目基因，如fon1～4^[、oslrk1，控制花粉囊细胞的分开和分化基因msp1、ostdl1a，控制雄性减数分裂基因pair1、pair2、pair3、mel1、mil1、dtm1、ossgo1等，促进花粉粒发育的关键基因cyp703a3、cyp704b2、wda1、osnop、dpw、ugp2、mtr1等。这些基因涉及多个方面，包括小孢子母细胞的减数分裂、绒毡层发育及降解，以及花粉细胞壁形成等方面。根据不育基因的功能和调控时期的差异，可将水稻隐性核雄性不育基因主要分为3类：1)小孢子母细胞发育时期不育基因；2)绒毡层发育时期不育基因；3)花粉囊和花粉外壁发育时期不育基因。

目前水稻突变体基因克隆最常用的技术有图位克隆、同源克隆、转座子或t-dna标记法、表达序列标签法、差异表达基因克隆等技术。随着高通量测序技术的发展，2012年，日本科学家提出了基于重测序方法的mutmap基因克隆技术(abea,kosugis,yoshidak,natsumes,takagih,kan-zakih,matsumurah,yoshidak,mistsuokac,muluneht,innanh,canol,kamouns,teraushir.genomesequencingrevealsagronomicallyimportantlociinriceusingmutmap.naturebiotechnology.2012,30(2):174-178)，该技术将突变体与野生型亲本进行杂交，产生f2代分离群体，随机取20-30个突变个体，分别提取基因组dna，等量混合后，利用二代测序技术，结合分子生物学与生物信息学分析测序数据，找出候选突变基因，大大缩短了基因克隆时间，降低了基因克隆成本。

到目前为止，涉及水稻花药发育和花粉形成的一些关键基因已被鉴定和研究，这些基因的突变导致雄性不育的表型。但对水稻雄配子体发育过程和调控机制并未完全探明，水稻雄性不育基因的定位与克隆有助于更全面地了解雄配子体发育的分子机制，加快利用雄性不育株系进行育种的进程。

本研究通过ems诱变水稻品种黄华占，筛选得到一个由单个隐性核基因控制的雄性不育突变体，命名为os2925，对其进行初步的表型鉴定、遗传分析及遗传背景鉴定，并利用simm方法(yanetal.,simultaneousidentificationofmultiplecausalmutationsinrice.frontiersinplantscience,2016)，结合hrm及基因序列分析，成功定位并克隆了该雄性不育基因。本发明还阐述了所述雄性不育基因的应用范围和应用方法。

发明简述

本发明提供了一种dna序列，所述dna序列具有调控植物育性的功能，其特征在于，所述dna序列选自下列组的序列之一：

a)具有seqidno：1、4或5所示的核苷酸序列；

b)具有seqidno：10所示的核苷酸序列；

c)具有seqidno：12所示的核苷酸序列；

d)具有seqidno：14、15、16所示的核苷酸序列；

e)在严格条件下能够与(a)-(d)之任一所述序列的dna杂交的dna序列；或

f)与(a)-(e)之任一所述序列互补的dna序列。

上述dna序列编码的氨基酸序列如seqidno：2、3、6、7、11、13、17、18或19所示。

本发明还提供了一种表达盒，其特征在于所述表达盒包含上述的dna序列。

本发明还提供了一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含上述的表达盒。

本发明还提供了一种工程菌，其特征在于所述工程菌包含上述的表达载体。

本发明还提供了一种基因在植物育性调控中的应用，其特征在于，所述育性调控基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

a)具有seqidno：1、4或5所示的核苷酸序列；

b)具有seqidno：10所示的核苷酸序列；

c)具有seqidno：12所示的核苷酸序列；

d)具有seqidno：14、15、16所示的核苷酸序列；

e)在严格条件下能够与(a)-(d)之任一所述序列的dna杂交的dna序列；或

f)与(a)-(e)之任一所述序列互补的dna序列。

本发明还包括一种通过突变育性调控基因seqidno:1、4、5、10、12、14、15或16获得雄性不育材料的方法。

本发明中所述的“突变”包括在育性调控基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。所述的突变可以是点突变，也可以是dna缺失或插入突变。所述突变可以通过化学诱变或基因定点突变的方式获得，化学诱变的方法包括用ems等诱变剂处理所导致的诱变；基因定点突变的方法包括但不限于zfn定点突变方法、talen定点突变方法、和/或crispr/cas9等定点突变方法。

本发明还提供了一种恢复由相应的seqidno:1、4、5、10、12或14、15、16所示基因突变所导致的雄性不育，使雄性不育突变体恢复成可育的方法。

本发明还包括一种突变体材料的应用，其特征在于所述突变材料是由核苷酸序列的突变所造成，所述核苷酸序列如seqidno:1、4、5、10、12或14、15、16所示。

上述“突变”可以是点突变，也可以是dna缺失或插入突变，也可以是通过rnai、定点突变等手段产生。

本发明还提供了将上述材料和dna序列应用于育种中的方法，更具体地所述应用是指将突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。

本发明还包括上述dna序列在以下(a)至(d)中任一项中的应用：

(a)培育植物品种或品系；

(b)培育授粉受精能力增强的植物品种或品系；

(c)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

(d)培育雄性不育植物品种或品系。

本发明还提供了一种用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态的方法(详细方法可参阅pct专利pct/cn2013/086657)，所述方法包括：

a)提供第一植株，其包含ht2925基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的；

b)向第一植株中引入下述构建体，形成第二植株，所述第二植株包含ht2925基因的纯合隐性等位基因和所述构建体，且构建体在第二植株中为半合状态，所述构建体包含：

i)第一核苷酸序列，其包含ht2925核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复雄性生育力；

ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能，具体为花粉失活基因zm-pa；以及

c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。

附图说明

图1是osht2925突变体和野生型黄华占植株形态。

图2是osht2925突变体和野生型黄华占稻穗形态。

图3是osht2925突变体和野生型黄华占小穗形态。

图4是osht2925突变体和野生型黄华占花药形态。

图5是osht2925突变体和野生型黄华占花粉染色分析。

图6是osht2925突变体和野生型黄华占花药横向切片分析,其中e是epidermis(表皮层)；en是endothecium(内皮层)；m是middlelayer(中层)；t是tapetallayer(绒毡层)；pmc是pollenmothercell(小孢子母细胞)；tds是tetrads(四分体)；dms是degeneratedmicrospores(降解的小孢子)；mp是maturepollen(成熟花粉粒)；ms是microspores(小孢子)。

图7为黄华占osht2925、osht2925突变体和日本晴osht2925的cds序列比对结果，其中hhzcds-1、hhzcds-2分别表示黄华占osht2925转录的两个cds序列，mutantcds表示osht2925突变体osht2925转录的cds序列，nipcds-1、nipcds-2分别表示日本晴中的osht2925转录的两个cds序列。

图8为黄华占osht2925、osht2925突变体和日本晴osht2925的蛋白质序列比对结果，其中hhz-1、hhz-2分别表示黄华占osht2925编码的两个蛋白序列，mutant表示osht2925突变体osht2925编码的蛋白序列，nip-1、nip-2分别表示日本晴中的osht2925编码的两个蛋白序列。

图9osht2925在不同水稻组织器官中的表达水平分析。其中st6、st7、st8、st9、st10、st11、st12依次表示花药发育时期的雌蕊和幼穗颖花原基分化期、幼穗花粉母细胞减数分裂时期、四分体形成阶段、小孢子早期、小孢子中晚期、二孢花粉期及成熟花粉期。

图10水稻雄性不育突变体(osht2925)的转基因功能互补载体。

图11osht2925基因的敲除载体。

图12osht2925基因在不同作物中的同源基因蛋白的序列对比图。其中brachypodiumdistachyon是指来源于二穗短柄草osht2925同源基因编码的蛋白、setariaitalica是指来源于小米(谷子)osht2925同源基因编码的蛋白、zeamays.1、zeamays.2、zeamays.3是指来源于玉米osht2925同源基因编码的蛋白。

发明详述

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

本发明包括一种育性相关基因及其核苷酸和蛋白序列，还包括通过操作该基因在调控植株雄性生育力中的应用。非限制性地举例而言，下文描述的任何方法都可与本发明所提供的相应核苷酸序列一起使用，例如，将所述育性基因的突变体序列引入植株以导致植株雄性不育、使植株内源序列突变、向植株中引入该序列的反义序列、使用发卡形式、或将其与其它核苷酸序列连接起来调控植株的表型，或者是本领域技术人员已知的可用于影响植株的雄性生育力的多种方法中的任一方法。

本发明所提供的育性基因ht2925，是一个花粉发育相关的基因。在水稻中该育性基因位于第4号染色体上，其在籼稻中的核苷酸序列如seqidno：1或4所示，氨基酸序列如seqidno:2和3所示；在粳稻中其核苷酸序列如seqidno:5所示，其氨基酸序列如seqidno:6和7所示；在二穗短柄草中该育性基因的核苷酸序列如seqidno:10所示，其氨基酸序列如seqidno:11所示；在谷子中该育性基因的核苷酸序列如seqidno:12所示，其氨基酸序列如seqidno:13所示；在玉米中该育性基因的核苷酸序列如seqidno:14、15和16所示，其氨基酸序列依次如seqidno:17、18和19所示。

本发明中获得的雄性不育突变体osht2925是由于osht2925基因上的一个单碱基突变g..a，导致在突变体中编码seqidno:2蛋白的转录本，第一个内含子和第二个外显子的剪切位点由gt…ag突变为gt…aa，进而导致突变体中主要以编码seqidno:3的转录本存在；对于seqidno:3所编码蛋白来说，第117个氨基酸由ggg(甘氨酸)突变为agg(精氨酸)；最终导致编码如seqidno:9所示的蛋白。

本发明还包括下列组的序列之一：a)与上述ht2925基因序列具有至少90％(优选为至少95％)序列相似性，且具有相同功能的dna序列；b)在严格条件下能够与(a)所述序列的dna杂交的dna序列；c)与上述任一所述序列互补的dna序列。

上述所述育性基因，可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本发明所述的育性恢复基因包括与ht2925基因高度同源，并且具有同样的育性调控功能的高度同源的功能等价体序列。所述高度同源的功能等价体序列包括在严谨条件下能够与本发明所公开的ht2925基因的核苷酸序列杂交的dna序列。本发明中所使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mmnacl、40mmpipes(ph6.4)和1mmedta的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1sds、和0.1％ssc的洗涤液洗涤15-60分钟。

功能等价体序列还包括与本发明所公开的ht2925基因所示的序列有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列相似性，且具有育性调控功能的dna序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法(bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、needleman-wunsch全局比对法(j.mol.biol.，48(3)：443-53，1970)、smith-waterman局部比对法(j.mol.biol.，147：195-197，1981)、pearson和lipman相似性搜索法(pnas，85(8)：2444-2448，1988)、karlin和altschul的算法(altschul等，j.mol.biol.，215(3)：403-410，1990；pnas，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

本发明所述的基因序列可以从任何植物中分离获得，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(grammagrass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。

本发明还提供了通过影响ht2925的核苷酸序列或者通过调控ht2925基因的转录表达从而影响植株育性的方法。所述影响植株育性是指通过调控ht2925基因的表达，从而使所述植株的育性发生改变，如导致植株雄性不育。具体地，取决于具体应用需求，可以通过多种方法来影响ht2925基因在植物体内的表达，从而达到调控植株雄性育性的效果。更具体地，调控ht2925基因的表达可以使用许多本领域普通技术人员可获得的工具进行，例如，通过突变、诱变、反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入等，都可以用于破坏ht2925基因的正常表达，从而获得雄性不育的植株。另一方面，本发明还包括通过将野生型ht2925的核苷酸序列引入植株来恢复ht2925表达被破坏的植株的雄性生育力。

本发明还提供了一种ht2925基因的不育突变体序列及其雄性不育突变体材料。更具体地，所述雄性不育突变体材料是通过突变水稻内源的osht2925基因，或突变与其高度同源的基因的核苷酸序列，使该植物体丧失雄性育性的过程。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用ems等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是dna缺失或插入突变，还可以是通过rnai、基因定点突变等手段产生，基因定点突变的方法包括但不限于zfn定点突变方法、talen定点突变方法、和/或crispr/cas9等定点突变方法。

具体地，本发明还提供了一种水稻雄性不育突变体，其含有突变后的雄性不育基因，所述突变后的雄性不育基因的核苷酸序列如seqidno:8所示，氨基酸序列如seqidno:9所示。与野生型相比，在不育突变体中，该基因的一个单碱基突变g..a，导致在突变体中编码seqidno:2蛋白的转录本，第一个内含子和第二个外显子的剪切位点由gt…ag突变为gt…aa，进而导致突变体中主要以编码seqidno:3的转录本存在；对于seqidno:3所编码蛋白来说，第117个氨基酸由ggg(甘氨酸)突变为agg(精氨酸)；最终导致编码如seqidno:9所示的蛋白。(图7)。本领域技术人员应该知晓，可以将所述核苷酸序列seqidno:8构建到植物表达载体，进行植物转化，从而获得新的转基因的雄性不育突变体材料。

此外，本发明的启动子可与并非ht2925基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达，更具体地，在该植株的雄性器官中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。

在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作地连接在本发明启动子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小rna。

本发明还包括含有ht2925基因和/或其启动子的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表达盒。所述构建体中的启动子可以是天然启动子或被取代的启动子，其将驱动所连核苷酸序列在植株中的表达。构建体中的启动子可以是诱导型启动子。当将ht2925基因的核苷酸序列与另一个启动子相连，优选的是，该启动子在花粉发育早期充分驱动该序列的表达,例如可以在花粉发育的p9期特异性表达。具体地，可使用的启动子的种类包括组成型病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)19s和35s启动子，或玄参花叶病毒35s启动子,或泛素启动子。

组织特异表达启动子可用于靶向特定的植物组织中增强转录和/或表达。启动子可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。在一种实施方式中，启动子是偏好在植物的雄性或雌性组织中特异表达的类型。本发明不必须在方法中使用任何特定的雄性组织优先型启动子，本领域技术人员已知的很多此类启动子中的任何都可以使用。本文描述的天然的ht2925启动子是可使用的启动子的一个例子。另一种此类启动子是5126启动子、ms45启动子、ms26启动子、bs92-7启动子、sgb6调控元件和ta29启动子等，其偏好于指导其连接的基因在植物雄性组织中的表达。某些构建体中还可以包括配子组织优先表达启动子。雄性配子优先表达启动子包括pg47启动子以及zm13启动子。

上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于rubisco的小亚基、植物epsp合酶、玉米brittle-1叶绿体转运肽等。

在制备表达盒的过程中，可对多种dna片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的dna序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将dna片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁膦抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体dna中。

本发明还包括所公开的ht2925基因及其启动子的应用，在某些应用的实施方式中，可以应用本发明所提供的ht2925基因或其启动子来实现ht2925或其他类似育性相关基因突变所获得的雄性不育系的繁殖和保持。

具体地，上述雄性不育系的繁殖和保持，是指以纯合隐性核雄性不育突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育突变体受体植株中。所述3个目标基因分别是育性恢复基因、花粉失活基因和筛选基因。其中，育性恢复基因可使不育的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。

在本发明中，所述花粉失活基因包括但不限于dam甲基化酶基因、zeamaysα淀粉酶基因、细胞毒素编码基因、或barnase与barstar的组合序列。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子选自聚半乳糖醛酸酶47基因(pg47)、zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因或硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域即其启动子区域。

上述筛选基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的筛选基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁膦抗性基因。所述筛选基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

更具体地，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性不育ht2925/ht2925突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系：其中，育性恢复基因osht2925可使转化受体育性恢复；花粉失活基因zm-pa可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；荧光色选基因rfp(r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产不育系。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题，即三系法资源利用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题(详细方法可参阅pct专利pct/cn2013/086657)。

本发明还提供了一种植物的生产方法，其包括：

(1)构建本发明所提供的表达盒；

(2)将步骤(1)获得的表达盒导入植物细胞；

(3)再生出转基因植物；和

(4)选择出转基因植物；并且

(5)任选地，增殖步骤(4)获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的dna摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术(可参见horschrb等(1985)science225：1229；whiteff，vectorsforgenetransferinhigherplants，transgenicplants，第1卷，engineeringandutilization，academicpress，1993，pp.15-38；jenesb等.techniquesforgenetransfer，transgenicplants，第1卷，engineeringandutilization，academicpress，1993，pp.128-143，等)。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(ti或ri质粒)和t-dna元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而t-dna被整合进植物细胞的基因组中。t-dna可位于ri-质粒或ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供了一种水稻花粉发育基因以及基于该基因突变所产生的雄性不育系，该不育系的育性稳定、不受环境条件影响、能够被野生型转基因恢复。该基因以及该基因突变产生的不育系为构建第三代杂交育种体系提供了必要的元件，该基因突变产生的雄性不育系，用来生产杂交种子，对于突破并改良现有的“三系”和“两系”杂交技术有重要意义。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、水稻雄性不育突变体(osht2925)筛选

该突变体的获得是通过ems诱变籼稻黄华占种子(m0)，ems诱变浓度和时间是0.7％，12小时,来自m0代种子植株结实后混收，获得突变体库(m1)。来自m1代种子的植株在种子成熟期用于筛选，通过表型观察，获得不育株(图1，2)。不育株割稻桩再生，再生株在生殖期用i2-ki染色检测花粉发育和染色反应。其中一个突变体的花粉是典型不育，为无粉型，植株表现为完全雄性不育，命名为osht2925。

实施例2、水稻雄性不育突变体(osht2925)遗传分析

osht2925突变体不育株与野生型黄华占杂交，三个杂交群体f1代植株全部表现为可育。再将f1代进行自交，f2代植株中不育与可育植株的分离比接近1:3(67:192)，显示该突变是由隐性单基因控制。

实施例3、水稻雄性不育突变体(osht2925)生殖器官表型分析

与野生型相比，突变体植株生长发育正常，同期开花。外稃和内稃大小、形态、开张尺寸、开张时间与野生型没有差别(图3)。但突变体花药瘦小，呈浅黄(图4)，花药不开裂，进一步用i2-ki溶液对突变体的花粉进行染色检测，结果如图5所示，野生型的花粉染色正常，而突变体表现无粉。如图6，与野生型相比，stage9突变体小孢子没有明显的液泡化并且皱缩，直到stage12突变体花药室内小孢子降解消失，其他组织如绒毡层、花药外壁、花粉外壁没有明显差别。

实施例4、水稻雄性不育突变体基因的克隆

突变体基因克隆采取mutmap方法，即利用突变体与原野生亲本杂交构建f2群体，通过重测序进行基因定位的方法。将不育株与野生型黄华占杂交，选取30棵f2代不育植株，取叶片提取基因组dna，等量混合后用于高通量基因组测序，共获得约10gb基因组序列数据，相当于22x水稻基因组(表1)。与野生型黄华占基因组序列比较显示突变基因可能是第4染色体上的loc_os04g024530等位基因。

表1水稻雄性不育突变体重测序数据

在野生型黄华占中该基因的编码区全长2121bp,其核苷酸序列如seqidno:1所示。seqidno:1编码两个蛋白序列，其氨基酸序列如seqidno:2、seqidno:3所示，seqidno:2编码的蛋白含556个氨基酸，seqidno:3编码的蛋白含523个氨基酸。在不育突变体中，osht2925基因上的一个单碱基突变g..a，导致在突变体中编码seqidno:2蛋白的转录本，第一个内含子和第二个外显子的剪切位点由gt…ag突变为gt…aa，进而导致突变体中主要以编码seqidno:3的转录本存在；对于seqidno:3所编码蛋白来说，第117个氨基酸由ggg(甘氨酸)突变为agg(精氨酸)；最终导致编码如seqidno:9所示的蛋白。。采用最新的snp(单核苷酸多态性)研究工具hrm(highresolutionmelt，即高分辨率熔解)分析，进一步验证所有的不育植株均携带纯合突变型位点，而可育植株携带纯和野生型或杂合型位点(表2)。该位点为纯和野生型的植株自交后代全部可育，该位点为杂合型的植株自交后代表现1:3(不育：可育)分离。

表2突变基因(loc_os04g24530)hrm分型结果

该基因cdna编码区在粳稻日本晴和野生型黄华占之间存在核苷酸序列多态性(图7)，导致对应的该基因的氨基酸序列出现个别氨基酸残基的多态性(图8)。具体的在粳稻日本晴中，该基因的核苷酸序列如seqidno:5所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:6、seqidno:7所示。

loc_os04g24530中的单碱基突变引起前转录终止，导致osacos12突变体的花药表皮缺陷，最终导致水稻完全雄性不育的表型。

实施例5、osht2925基因在水稻各器官中的表达分析

根据osht2925的cdna序列设计引物，上游引物为osht2925-qrt-f15’agaggaaggaggagacggag3’(seqidno:20)，下游引物为osht2925-qrt-r15’gcgacctgaaaccccttgta3’(seqidno:21)，同时以水稻actin基因作为内参对照设计引物，上游引物为5’gctatgtacgtcgccatcca3’(seqidno:22)，下游引物为5’ggacagtgtggctgacaccat3’(seqidno:23)。用黄华占水稻材料提取总rna并合成cdna模板。采取实时定量pcr方法，分析osht2925基因在水稻根、茎、叶、外稃、内稃、颖片、雌蕊和幼穗颖花原基分化期(stage6)、幼穗花粉母细胞减数分裂时期(stage7)及四分体形成阶段(stage8)、小孢子早期(stage9)、小孢子中晚期(stage10)及成熟花粉期(stage12)的表达谱，其结果如图9所示，该基因在水稻花药中特异表达(图9)。

实施例6、水稻雄性不育突变体(osht2925)的转基因功能互补

互补载体的构建(图10)：用引物osht2925-res-f(ccatgattacgaattcctatcccatcaatgtagctgaagataagg，seqidno:24)和osht2925-res-r(ggccagtgccaagctttacttcatgcatgtattttccctttttg，seqidno:25)扩增水稻基因组，获得含有osht2925起始密码子atg上游的2000bp左右的碱基和终止密码子taa后的2600个碱基的全长基因组dna序列片段(seqidno：3)，同时把基因组互补表达载体用ecorⅰ、hindⅲ内切酶双酶切并回收酶切后的片段，用in-fusion酶将载体回收片段与全长基因组dan序列片段连接。通过农杆菌介导的方法转化至黄华占osht2925突变体的种子诱导的愈伤组织中，筛选再生得到转基因植株。

分析所有获得的转基因阳性植株，发现所有转基因阳性植株均表现可育。这些分析进一步证明基因osht2925参与花粉发育调控，该基因突变导致花粉败育。

实施例7、osht2925基因的敲除转基因株系的获得与表型分析

osht2925基因的敲除载体(图11)的构建：用靶点target1(tgaaggatggatcctgcaagaaacc，seqidno:26)和target2(tggactagttttgatacgtgctcatttc，seqidno:27)分别连接到crispr/cas9载体的u6a和u3启动子上，酶切后连入crispr/cas9载体中得到ht2925敲除载体。通过农杆菌介导的方法转化武运粳的愈伤组织，筛选再生得到转基因植株。对该转基因阳性植株进行表型分析，发现所有转基因植株均表现出花粉败育，该实施例进一步说明osht2925参与花粉发育调控，该基因的表达被抑制导致花粉败育。

实施例8、osht2925基因编码的蛋白与大麦、高粱、玉米基因组中预测的同源蛋白的序列比对

在ncbi数据库中，利用proteinblast工具，对水稻osht2925基因编码的蛋白全序列在蛋白数据库中进行查找，得到了小米(谷子)(setariaitalica)、二穗短柄草(brachypodiumdistachyon)、玉米(zeamays)的基因组中预测的同源蛋白，将这些蛋白序列进行比对分析，结果显示来自不同植物的同源蛋白都具有非常相似的保守序列，彼此之间同源性很高(图12)，表明该蛋白在植物花的雄性器官发育过程中生物学功能保守，起着非常重要的作用。

其中，在二穗短柄草中该育性基因的核苷酸序列如seqidno:10所示，其氨基酸序列如seqidno:11所示；在谷子中该育性基因的核苷酸序列如seqidno:12所示，其氨基酸序列如seqidno:13所示；在玉米中该育性基因zmht2925的核苷酸序列如seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16所示，其氨基酸序列如seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19所示。

sequencelisting

<110>深圳兴旺生物种业有限公司

深圳市作物分子设计育种研究院

<120>雄性育性相关基因ht2925及其应用

<130>

<160>27

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2121

<212>dna

<213>水稻（oryzasativassp.indica）

<400>1

atgggcgacgccgcggtacccgccatggtggtggaggaggaggaacaggagcacgtgttc60

cggagcaggttcccgccggtggccgtgccggacggcgtcaccgtgccggagttcgtgctg120

gacggcgccgaggcctacgccgacagggtggcgctcgtggaggccgcggcgggcgggcgg180

tcgtacacgtacggcgaggtggcgcgcgacacggcgcggttcgccagggcgctccggtcg240

gtgggcgtccggaaggggcacgtcgtcgtcgtcgcgctcccaaacctcgccgtgtacccc300

gtcgtgtcgctcgggatcatgtcggcgggggccgtgttctccggcgtgaacccgcgcgcg360

ctcgccgcggagatcaagaagcaggtggaggactccgaggcgaagctggtcgttgccaac420

gaggtcgcgttcgacaaggtgaaggacgccggcgtgccggtgatcggcgtcggcgacagg480

gagcggatgcctggggcgatcagctgggacgagctcctcgccgcggcggaccgcaccggc540

gccggggtggtgccggtggacgcggcgcagcagtccgacctgtgcgcgctcccctactcc600

tccggcaccaccggcgtgtccaagggcgtgatgctgagccaccgcaacctggtgtccaac660

ctctgctcgtccatgttcgccgtggcgccggagacggccgggcaggtggtgacgctgggg720

ctcatgccgttcttccacatctacggcatcaccggcatctgctgcgccacgctccggcac780

aagggcacggtggtggtgatggaccgcttcgacctccgcacgttcctccgtgcgctcgtc840

gaccaccgcgtcatgttcgcgccgctggttccccccgtgatgctcgccatggtcaagagc900

cccgtcgccgacgagttcgacctctccgacctcgccctcaagtccgtcatgaccgccgcc960

gcgccgctcgcccccgacctcctcgccgcgttccagcgcaagttccccggcgtgcaggtg1020

gaggaagcctacggcctcaccgagcacagctgcatcaccctcacgcacgccgccggcgac1080

ggccacggccacgtcgccaagaagagctcggtggggttcatcctgccgaacctggaggtg1140

aagttcgtggacccggacaccgggaggtcgctgccggcgaacacgccgggggagctgtgc1200

gtgcggagccagagcgtgatgcaggggtactacaagaggaaggaggagacggagcgcacg1260

gtggacggcaaggggtggctgcacaccggcgacgtcgggtacatcgacggcgacggcgac1320

gtgttcatcgtggacaggatcaaggagctgatcaagtacaaggggtttcaggtcgccccc1380

gccgagctcgaggccgtcctcctctcccacccctccgttgaggacgccgccgtcttcggg1440

taacacccttcttcttcttcttctctgaccgtcgaaacttcaacagttgattctggagta1500

aagttatgaagcagtcaaaacccagctttatatttctagtttattttgtgagatcatttc1560

agccagcttcattctaattttgtatggagtttaaactttttagttggattttaattttaa1620

aaagatggaattgtagatggagcttttgccatgtcctaaagccatgcatgcatggatacg1680

cagggtgccggacgaggaggccggcgaggtgccggtggcgtgcgtggtgcggcggcacgg1740

tgcggaggagggggaggaggagatagtggcgtacgtggcggagagggtggcgtcgtacaa1800

gcgggtccgggtgctgcacatcgtcgacgccatccccaagtcggtgtccgggaagatcct1860

gaggaggcagcttagggacgagttcatcaagaggatgaaaccgtcagcttgattaattaa1920

cagacataaatcattgtgattgatatcaagaaccgaaagcatgcaaggtgttaaattgca1980

taaaaatggagttggataagtgtttcatcatcaccgagtatatgtacgtacatgttagtg2040

attatcgtgtgaaattaccatggaaatgaattctaagtctttaatttaagtacatttatc2100

ttcgtttcttttttacaaata2121

<210>2

<211>555

<212>prt

<213>水稻（oryzasativassp.indica）

<400>2

metglyaspalaalavalproalametvalvalgluglugluglugln

151015

gluhisvalpheargserargpheproprovalalavalproaspgly

202530

valthrvalprogluphevalleuaspglyalaglualatyralaasp

354045

argvalalaleuvalglualaalaalaglyglyargsertyrthrtyr

505560

glygluvalalaargaspthralaargphealaargalaleuargser

65707580

valglyvalarglysglyhisvalvalvalvalalaleuproasnleu

859095

alavaltyrprovalvalserleuglyilemetseralaglyalaval

100105110

pheserglyvalasnproargalaleualaalagluilelyslysgln

115120125

valgluaspserglualalysleuvalvalalaasngluvalalaphe

130135140

asplysvallysaspalaglyvalprovalileglyvalglyasparg

145150155160

gluargmetproglyalailesertrpaspgluleuleualaalaala

165170175

aspargthrglyalaglyvalvalprovalaspalaalaglnglnser

180185190

aspleucysalaleuprotyrserserglythrthrglyvalserlys

195200205

glyvalmetleuserhisargasnleuvalserasnleucysserser

210215220

metphealavalalaprogluthralaglyglnvalvalthrleugly

225230235240

leumetprophephehisiletyrglyilethrglyilecyscysala

245250255

thrleuarghislysglythrvalvalvalmetaspargpheaspleu

260265270

argthrpheleuargalaleuvalasphisargvalmetphealapro

275280285

leuvalproprovalmetleualametvallysserprovalalaasp

290295300

glupheaspleuseraspleualaleulysservalmetthralaala

305310315320

alaproleualaproaspleuleualaalapheglnarglysphepro

325330335

glyvalglnvalgluglualatyrglyleuthrgluhissercysile

340345350

thrleuthrhisalaalaglyaspglyhisglyhisvalalalyslys

355360365

serservalglypheileleuproasnleugluvallysphevalasp

370375380

proaspthrglyargserleuproalaasnthrproglygluleucys

385390395400

valargserglnservalmetglnglytyrtyrlysarglysgluglu

405410415

thrgluargthrvalaspglylysglytrpleuhisthrglyaspval

420425430

glytyrileaspglyaspglyaspvalpheilevalaspargilelys

435440445

gluleuilelystyrlysglypheglnvalalaproalagluleuglu

450455460

alavalleuleuserhisproservalgluaspalaalavalphegly

465470475480

valproaspgluglualaglygluvalprovalalacysvalvalarg

485490495

arghisglyalaglugluglygluglugluilevalalatyrvalala

500505510

gluargvalalasertyrlysargvalargvalleuhisilevalasp

515520525

alaileprolysservalserglylysileleuargargglnleuarg

530535540

aspglupheilelysargmetlysproserala

545550555

<210>3

<211>522

<212>prt

<213>水稻（oryzasativassp.indica）

<400>3

metglyaspalaalavalproalametvalvalgluglugluglugln

151015

gluhisvalpheargserargpheproprovalalavalproaspgly

202530

valthrvalprogluphevalleuaspglyalaglualatyralaasp

354045

argvalalaleuvalglualaalaalaglyglyargsertyrthrtyr

505560

glygluvalalaargaspthralaargphealaargalaleuargser

65707580

valglyvalarglysglyhisvalvalvalvalalaleuproasnleu

859095

alavaltyrprovalvalserleuglyilemetseralaglyalaval

100105110

pheserglyvalasnproargalaleualaalagluilelyslysgln

115120125

valgluaspserglualalysleuvalvalalaasngluvalalaphe

130135140

asplysvallysaspalaglyvalprovalileglyvalglyasparg

145150155160

gluargmetproglyalailesertrpaspgluleuleualaalaala

165170175

aspargthrglyalaglyvalvalprovalaspalaalaglnglnser

180185190

aspleucysalaleuprotyrserserglythrthrglyvalserlys

195200205

glyvalmetleuserhisargasnleuvalserasnleucysserser

210215220

metphealavalalaprogluthralaglyglnvalvalthrleugly

225230235240

leumetprophephehisiletyrglyilethrglyilecyscysala

245250255

thrleuarghislysglythrvalvalvalmetaspargpheaspleu

260265270

argthrpheleuargalaleuvalasphisargvalmetphealapro

275280285

leuvalproprovalmetleualametvallysserprovalalaasp

290295300

glupheaspleuseraspleualaleulysservalmetthralaala

305310315320

alaproleualaproaspleuleualaalapheglnarglysphepro

325330335

glyvalglnvalgluglualatyrglyleuthrgluhissercysile

340345350

thrleuthrhisalaalaglyaspglyhisglyhisvalalalyslys

355360365

serservalglypheileleuproasnleugluvallysphevalasp

370375380

proaspthrglyargserleuproalaasnthrproglygluleucys

385390395400

valargserglnservalmetglnglytyrtyrlysarglysgluglu

405410415

thrgluargthrvalaspglylysglytrpleuhisthrglyaspval

420425430

glytyrileaspglyaspglyaspvalpheilevalaspargilelys

435440445

gluleuilelystyrlysglypheglnvalalaproalagluleuglu

450455460

alavalleuleuserhisproservalgluaspalaalavalphegly

465470475480

trpserphecyshisvalleulysprocysmethisglytyralagly

485490495

cysargthrargargproalaargcysargtrpargalatrpcysgly

500505510

glythrvalargargargglyargargarg

515520

<210>4

<211>7408

<212>dna

<213>水稻（oryzasativassp.indica）

<400>4

ctatcccatcaatgtagctgaagataaggtagagttaattgctggactacttggttgcaa60

ggttggatctatgccattcaattatttgagtttacctatggggacaaccatacctaaggt120

aattgattttgctcctttagtggatagagttgagagaaggctaacaataagctcagcctt180

tttaccccagggtggtaggctgacacttatcaactatgttctttctataatcctcacata240

ctatatgtgttctcttgaactgtctttaactgtcatcaaagccattgatacagtaagaaa300

gaacggtttatagagaggaaataacccaaattccaccagaaaatatttagtttcctagga360

gctagtgtgcaggctaaaggacaagggtggtttaggggtgataaatctaagaaaccagaa420

tgttgttcttttattgaaacacttagataagttctatagaaatgttgatcttccttgggt480

ggatctcatatggaaatcttattgcacttaaaagtctcttcacttagtttcaaacagagg540

ctccttttggtggaaaaatattgtttccctggttgatgtttttagagggatgctcattgc600

acagtgcaaataggaacctcactgctcttttggggatctgtgtaatggggaactaagttt660

cctaatcttttttgggcagcttataacaaagatgaatttgttaagatggcttgctccaag720

cctttggaagatgctttacgctaccaatgaatgctgaagcttatggggaatttttagttt780

tgcaatctgaacttgacaatgtccatttaagtgaggggttgggtgatcattggagctata840

tttggaatgttgataagtattctgctcaaagattttaaaaaatgaattattcatgcttac900

agcctccaaggccgcttgtttggatctggaagacaaagcgtgtgatgaaaatcaaagtgt960

ttgcttggctcctctctttagacagaattaatacaagggacatggtggattgcaggcact1020

atgctaaggaaaatgatgatctcacctgtgttctttgctttgggggtattagagagataa1080

ggctacatctcttctttacttacctttttagtctccgatgttgacagtatttgggttttg1140

attggtctccttatttaaatttcttccagatgattgttctagtgagaattcgttttggta1200

cgaaggtttcctggagatcttctttacaactcctgacatatttggaagcaaagaaatggc1260

ttgatttttcataatgtacctccaacttttcatggatggaaagttcagttcaggaaagag1320

cttcttctacatatgtgtagaatgaaggagcctctcaagcaattagtttttgattagtca1380

caaattttgtaattattttgtgggtttctgtttttcctagtaagatgtaaatatttcttt1440

ttatacaagctatactggtaggcaaatgcctggcagtaatttgtcaaaaaaaaatgaact1500

ttgtatttatcgtattatgttgttaatctagtatttaagtatcaaatgcaaattgcagtt1560

ggggtgtcaaggatatgtgtgttagtgtgtgtattagtgtgctaaggacattttagtctt1620

ttcccatatctttgtatacaatatattcccctctagggcaaaatcaatggatcaacgatt1680

tatccccagatccccaaaattataacatctgacatgtgaaccgtatgcacctacacttat1740

ccgctactacggtctgttaatattcaggcacaacacaacttacacgatatacaaaatgca1800

tcaagaaaatcatcgtaagatcgattattattatgcatcaagaaaatcatcgtaagatcg1860

attattattattaactgtttatagttaacaacagctactacgatcctctccatttctacc1920

agcattcgaagattcacactctttgcaagccaaaaggccatgacccaaccaaacctcacc1980

tacaccccactagtcatggtaacacacaagaaccgtgtcatcctcgccacgaccaccacc2040

accaccatgtcgtcgccttcctctcgccacccctcgccaccacgctctctacaaatgcca2100

gagctccggccacccccaccaccacccaagaagcctgcgccgccgaccggcatcgcgaca2160

tgggcgacgccgcggtacccgccatggtggtggaggaggaggaacaggagcacgtgttcc2220

ggagcaggttcccgccggtggccgtgccggacggcgtcaccgtgccggagttcgtgctgg2280

acggcgccgaggcctacgccgacagggtggcgctcgtggaggccgcggcgggcgggcggt2340

cgtacacgtacggcgaggtggcgcgcgacacggcgcggttcgccagggcgctccggtcgg2400

tgggcgtccggaaggggcacgtcgtcgtcgtcgcgctcccaaacctcgccgtgtaccccg2460

tcgtgtcgctcgggatcatgtcggcgggggccgtgttctccggcgtgaacccgcgcgcgc2520

tcgccgcggagatcaagaagcaggtggaggactccgaggcgaagctggtcgttgccaacg2580

aggtcgcgttcgacaaggtgaaggacgccggcgtgccggtgatcggcgtcggcgacaggg2640

agcggatgcctggggcgatcagctgggacgagctcctcgccgcggcggaccgcaccggcg2700

ccggggtggtgccggtggacgcggcgcagcagtccgacctgtgcgcgctcccctactcct2760

ccggcaccaccggcgtgtccaagggcgtgatgctgagccaccgcaacctggtgtccaacc2820

tctgctcgtccatgttcgccgtggcgccggagacggccgggcaggtggtgacgctggggc2880

tcatgccgttcttccacatctacggcatcaccggcatctgctgcgccacgctccggcaca2940

agggcacggtggtggtgatggaccgcttcgacctccgcacgttcctccgtgcgctcgtcg3000

accaccgcgtcatgttcgcgccgctggttccccccgtgatgctcgccatggtcaagagcc3060

ccgtcgccgacgagttcgacctctccgacctcgccctcaagtccgtcatgaccgccgccg3120

cgccgctcgcccccgacctcctcgccgcgttccagcgcaagttccccggcgtgcaggtgg3180

aggaagcctacggcctcaccgagcacagctgcatcaccctcacgcacgccgccggcgacg3240

gccacggccacgtcgccaagaagagctcggtggggttcatcctgccgaacctggaggtga3300

agttcgtggacccggacaccgggaggtcgctgccggcgaacacgccgggggagctgtgcg3360

tgcggagccagagcgtgatgcaggggtactacaagaggaaggaggagacggagcgcacgg3420

tggacggcaaggggtggctgcacaccggcgacgtcgggtacatcgacggcgacggcgacg3480

tgttcatcgtggacaggatcaaggagctgatcaagtacaaggggtttcaggtcgcccccg3540

ccgagctcgaggccgtcctcctctcccacccctccgttgaggacgccgccgtcttcgggt3600

aacacccttcttcttcttcttctctgaccgtcgaaacttcaacagttgattctggagtaa3660

agttatgaagcagtcaaaacccagctttatatttctagtttattttgtgagatcatttca3720

gccagcttcattctaattttgtatggagtttaaactttttagttggattttaattttaaa3780

aagatggaattgtagatggagcttttgccatgtcctaaagccatgcatgcatggatacgc3840

agggtgccggacgaggaggccggcgaggtgccggtggcgtgcgtggtgcggcggcacggt3900

gcggaggagggggaggaggagatagtggcgtacgtggcggagagggtggcgtcgtacaag3960

cgggtccgggtgctgcacatcgtcgacgccatccccaagtcggtgtccgggaagatcctg4020

aggaggcagcttagggacgagttcatcaagaggatgaaaccgtcagcttgattaattaac4080

agacataaatcattgtgattgatatcaagaaccgaaagcatgcaaggtgttaaattgcat4140

aaaaatggagttggataagtgtttcatcatcaccgagtatatgtacgtacatgttagtga4200

ttatcgtgtgaaattaccatggaaatgaattctaagtctttaatttaagtacatttatct4260

tcgtttcttttttacaaatagccatgcttattttttttaaaaaaaaaaactaggaagata4320

gtccacgcatatgcgcgagcatcttattaaatattgtttgaatttttattatggaagctt4380

atatgtgggtgattttttctttaaatattctgactctattctaaatctatttccgtcgat4440

aatttatttaagattgcttatgatttttttctaattacccttgcaacgtataaatcactt4500

ttattaggtcaattcttacgataaagtatattttcattacatggattctcatatatatat4560

aagtttaacatggtatgcttctcctagttaaccgaatttatagtggaatatccatgtacc4620

aattatatttaatactggatggataccccacgtattgctgcggaatttttatatccttcg4680

gagcattcccctattgtcatgcataaagccatattcctcattcgagtataaaaagataac4740

atgaaaaattatatgaaaaattataggaatgttttgtctaaatggactccatggaaccct4800

tttagaaaataggcatgttcgtaattaggggtgaaaacggtaacggtaattaccggccga4860

ccggcgttcgttttcgactttctaccggccgagccatatggaaatggtaatcgaccgaaa4920

caaaaatggaaatggtaaaaaatatggaaatgaaaacggaaatggttttgctgttatacc4980

gatcgtttccgtatttaccgtattcttgcggaaattaccatttcttataatatgataatt5040

accgtattctaaatatgtcgatattataggacatgtctatactttacccacagcttatag5100

attgaatgactctttaataaaatctctaacttttgtacatggctaaaatgaagttaattt5160

ataatttatatagtataaacttgaatttatgtatatatataacatacttatgtaaagtta5220

aatatatatttttatagtttaatgtttccgtatttgttaccggtttccgatctgtaccga5280

catgtttccgtccgtattgttccgtttccggttttccgatatttccgatatcgttttcgt5340

ttccgactttaccgtttccgattttgtttccgagaaaaatatggttacggaaatggttga5400

ggctgttttccgatcgtttccgaccgttttcatccctattcgtaatgatacatatataaa5460

attttcccaaaaactgaaaacaaataaccaagtatctgtaattctgagctggaattgcac5520

agcatgaaaaaaaattatgcgaggttaacgtcaagaagattaaatataacacgtaatatg5580

ggacaaaataaaatggattactcttgaagtataaaattggatgcaaaagcatatacctaa5640

caaaaaaactaatcaatgtaatttggcattcagtttagagggttaaaaatgcacgatgca5700

aaatatttttcaacatgaggtcccaacgaactgaaatatgagcgggtgactgataactcg5760

tacttcagatccacatgattgttttttcctcatagtccatcttaatatccatttgcagct5820

aagtgtagagtattgaacgggagattctgatattctagagaaaaatataaaccatcagtg5880

cacggtaatatgagcaaacaaaagtacaaactgacatggagatgccacattaacggtaat5940

atgaacaaacaaaagtacaaactgacacggagatgccgcaggaacttagagaggaatggg6000

agggaggagagatcaagtaattacatgtgcttgtcggagtgattaaataattacacaatg6060

atgttttaaccttttttattctagtaggattggaccatgacccttatagcagattctacc6120

aatagtcgacaaatggatggaactatttatatacatgaggaggctatgcagcatgaacac6180

cgatgaaatgatgagggaaccgttggtttttaggcgatatgggaggtgattggacgaatc6240

gatcgataaacgtgcagacggacacgtgcgcaacattgaagtgaacttttacgtggtgtc6300

gcatggcatccatcagggatggcaaaccgatcatatgggttgggccagttggctatgccc6360

tatgctgggctaggattaaatatcaatcgacatggatgaacggtcagatgagaagcaaag6420

aagcggatagataaaaatcgaacagctatgctattagtaatgatgtggctcactctcaag6480

atagcaaattagtattaattatactaagtgcgatcaattatatagttatactaaaaaatc6540

ggcatgcttagtcagcctatatatacttattatcactaaaaaatattacatggtaaaatt6600

ggtgtgctcactaatatttaaaatatgtatatacttcattttcttatttgaatttttaga6660

gttttcataaaatattttaaaaagaaaattgtgaaccactcttttagttttaacaaatga6720

atatatgatattaaaaacatttatggacgtatatataaatgatttatttattatgtataa6780

gtgaaaaacatatgtgtcataaaaaatatagaactttatatcatgtcaaccaaaagtata6840

aaatttaatgtgtcattttatacataaattttgatgaaatccaaaaaatttaatgtgtca6900

ttttatacataaattttgataaaatccaaacaagtaaagttatttttaagatttatcaaa6960

attaattggttaaaatatatgatttgaatatttgaaagatcaattatttagtatattcaa7020

agttataggagtagtaccgagtaggcgtagtatatttaaagaaggaaaatgaatgtaaat7080

tcgttgttttagatttgttttttttttaataatgttgggtttactatatattctagagtt7140

ataggagtagtaccgagtgtggtatatttatataaggcaaaggagtaaaagtttttgtga7200

ttgaaaaagggagatagttttggaagcctctggaatccatatgtgatacttttctctata7260

tttttcctgacatatgattgttaggtgttttttctttactataaatttatgatttttctt7320

caaagtaagagatgccacgtggaccaatcgaaagctagcaaaaagccagctaggataaat7380

caaaaagggaaaatacatgcatgaagta7408

<210>5

<211>2121

<212>dna

<213>水稻（oryzasativassp.japonica）

<400>5