B淋巴瘤和白血病的检测标记物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属医药技术领域，具体涉及B淋巴瘤或白血病的检测标记物、试剂盒及其在制备抗肿瘤药物的用途。

背景技术：

哺乳动物细胞中催化脯氨酸残基的是脯氨酰-4-羟化酶（P4H），产生(2S,4R)-4-羟基脯氨酸。脯氨酰-4-羟化酶具有广泛的底物，其中最为重要的是催化新合成的胶原蛋白前体，对其折叠形成正确的三维构象是关键且必要的。底物哺乳动物的脯氨酰-4-羟化酶是一个α₂β₂的四聚体，其α亚基具有底物结合结构域和酶活位点。α亚基具有3种亚型，一型亚基(prolyl 4-hydroxylase, alpha polypeptide Ⅰ,简称为“P4HA1”)是表达最为广谱的酶。脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基(prolyl 4-hydroxylase, alpha polypeptide II,简称为“P4HA2”)，由535个氨基酸组成，在某些特异组织表达。P4ha1^-/-基因敲除小鼠胚胎致死，但P4ha1^+/-或P4ha2^-/-基因敲除的小鼠没有观察到明显异常的表型，并且敲除P4ha1^+/-和P4ha2^-/-的小鼠软骨发育不良。近来研究表明，P4HA2基因（而非P4HA1）的异常与疾病紧密相关，该基因的突变伴随着非综合征性高度近视疾病，且P4HA2基因的一个内含子区域在中国吸烟人群中是肺癌易感位点。除此而外，有报道指出P4HA1和P4HA2在乳腺癌中高表达，并通过调节胶原蛋白的构象参与乳腺癌恶性转移。但是，未见P4HA1和P4HA2与弥散性大B淋巴瘤或白血病相关的报道。

Carabin是TBC1蛋白家族的成员，前期研究表明，Carabin 在脾脏和外周血淋巴细胞中表达，并负调控T细胞抗原受体（T cell antigen receptor TCR）信号通路。进一步研究发现Carabin是钙依赖磷酸酶Calcineurin的内源性抑制因子。除此之外，它还通过其Ras GAP活性抑制Ras信号通路。Carabin对Calcineurin和Ras通路的调控是因为通过直接与Ras以及Calcineurin相互作用而实现的。另外，Carabin还可以通过同样的机制负调控B细胞的BCR信号通路，抑制Carabin的表达可以加快B细胞的早期应答。最近，在敲除Carabin的小鼠中发现Carabin与心肌肥厚有关，也是通过抑制Calcineurin、Ras和Ca2+/钙依赖性蛋白激酶2信号通路防止心肌肥厚。但是，未见文献报导Carabin蛋白在B淋巴瘤中的表达情况及其相关性。

B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其中，弥散性大B淋巴瘤是最为常见的非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤,占成人非霍奇金淋巴瘤病例的1/3以上，其侵袭能力较强，恶性程度较高。弥散性大B淋巴瘤又分为GCB（germinal centre B-cell）、ABC和PMBL型，GCB型5年总生存率为76%，而非GCB型的5年总生存率仅为34%。目前，临床上对B淋巴瘤尤其是弥散性大B淋巴瘤病人采用CHOP或R-CHOP的标准治疗方案。虽然有超过50%的病人能够被此治疗方案治愈，但仍至少有1/3以上的病人难以治疗或者复发。对这类病人将采用自体造血干细胞移植，从而使其对标准治疗方案的化疗药物敏感，但收效甚微。因此,寻找新的具有B淋巴瘤诊断或联合诊断价值的，特异高表达的基因或蛋白质有着重要的诊断和治疗意义。

白血病与淋巴瘤同属于影响血液、骨髓与淋巴系统肿瘤当中的一种，此大类疾病被称为造血和淋巴组织肿瘤（Tumors of the hematopoietic and lymphoid tissues）。在恶性肿瘤死亡率中，白血病居第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下成人中则居第l位。最近10年来，白血病的发病率是此前的两倍。目前全国白血病患者已达400多万人，每年新增4万人，且儿童占到了一半。白血病可被分为急性淋巴性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、慢性淋巴性白血病（CLL）和慢性骨髓性白血病（CML）这四大类型，以及其他一些较不常见的种类。临床上，我国急性白血病比慢性白血病多见，急性白血病由于恶性细胞的剧增和扩散，必须立即治疗，否则病人在数月甚至数周内死亡。其中成人以AML最多，而儿童中比较常见的是ALL。白血病是最常见的儿童癌症。AML是一种具有高度异质性的疾病，根据细胞形态学和组织化学特征可将AML分为不同的类型。目前对于AML的治疗仍以联合化疗为主，AML患者总的完全缓解率仅50%～70%，长期无病生存率为25%～30%。因此，发现和开发新的白血病标记物对于白血病的精确分型、诊断、预后以及最佳治疗方案的选择有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种可用于检测B淋巴瘤或白血病的特异标记物、诊断试剂盒及其在制备抗肿瘤药物中用途。

具体地讲，本发明提供了脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基（P4HA2）的基因、mRNA、cDNA或蛋白的用途及TBC1结构域家族成员10C蛋白的用途，它们被用作：（1）检测B淋巴瘤或白血病的标记物；（2）制备检测B淋巴瘤或白血病的试剂盒试剂盒；（3）治疗B淋巴瘤的分子靶标，并制备有关抗肿瘤药物。

本发明提供的可作为B淋巴瘤或白血病的标记物,为脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基（P4HA2）的基因（SEQ.ID.NO1（ Gene: P4HA2; CDS: 565..2172））、mRNA（SEQ.ID.NO2（Gene: P4HA2; mRNA: 1..2588））、cDNA或蛋白（SEQ.ID.NO3（ Protein: P4HA2; protein_id="NP_004190.1"）），以及TBC1结构域家族成员10C的基因（Carabin基因）（SEQ.ID.NO4）、mRNA（SEQ.ID.NO5）、cDNA或蛋白（SEQ.ID.NO6）。研究表明，P4HA2基因和蛋白在正常人或反应增生淋巴结中几乎不表达或低表达，而在弥散性大B淋巴瘤中显著高表达；而Carabin蛋白在弥散性大B淋巴瘤中低表达。另外，P4HA2基因在急性髓性白血病血液样本中的表达量显著高于正常人。敲低P4HA2表达的弥散性大B淋巴瘤细胞株增殖减慢，裸鼠成瘤能力显著降低；而敲低Carabin的弥散性大B淋巴瘤细胞株增殖加快，裸鼠成瘤能力显著提高。因此，P4HA2可作为这类造血及淋巴肿瘤的诊断标记物及治疗靶标，而Carabin也可作为该类疾病的诊断标记物。

在本发明的具体实施例中，通过免疫组化的方法，用P4HA2蛋白抗体，检测了205例弥散性大B淋巴瘤和20例反应增生淋巴结的组织样。发现P4HA2在反应增生淋巴结的组织样中几乎不表达或表达水平很低，而在多数弥散性大B淋巴瘤中表达，并且P4HA2的表达和弥散性大B淋巴瘤的分型及国际预后指数（International Prognostic Index, IPI）等临床指标显著相关。也用自制的抗体检测了Carabin蛋白在B淋巴瘤样本中低表达，而在正常人的B细胞中高表达。因此，将P4HA2和Carabin视为B淋巴瘤的标记物。本发明的另一实施例中，通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR, RT-PCR）的方法，用P4HA2特异引物，检测了15例急性髓性白血病和3例正常人血液抽提的外周血单个核细胞样本。发现P4HA2在3例正常人样本中几乎不表达，而在12例（80%）急性髓性白血病人样本中高表达，因此，将P4HA2视为白血病标记物。

本发明还提供检测B淋巴瘤或白血病的试剂。所述的试剂包含：（a）抗P4HA2的抗体；（b）特异性扩增P4HA2 mRNA或P4HA2 cDNA的引物或引物对；（c）抗Carabin的抗体。

本发明还提供检测B淋巴瘤或白血病的试剂盒。即使用上述试剂或其组合物构建的检测B淋巴瘤或白血病的试剂盒。

本发明所述检测B淋巴瘤或白血病的试剂盒，包括：

容器（1），其中含有P4HA2特异性抗体、对应的二抗和人正常或反应性增生淋巴结组织石蜡切片，以及标签或说明书；所述标签或说明书注明，该试剂盒用于免疫组化或流式细胞仪检测分析P4HA2的蛋白含量来判断患B淋巴瘤的几率及预后。具体来说，以一定浓度将P4HA2抗体分别与人正常或反应性增生淋巴结石蜡切片或患者异常淋巴组织石蜡切片孵育，若患者石蜡切片染色高于人正常或反应性增生淋巴结，即P4HA2在患者异常的淋巴组织中表达，根据P4HA2在人正常或反应性增生淋巴组织中几乎不表达，则可判断该患者具有患B淋巴瘤的可能性。或者，以一定浓度将P4HA2抗体分别与正常人或患者血液分选的PBMC孵育并结合对应的荧光二抗，用流式细胞仪分析P4HA2蛋白的含量来判断患B淋巴瘤的几率。

容器（2），其中含有特异性扩增P4HA2 mRNA或cDNA的荧光定量PCR特异性引物对，以及标签或说明书；所述标签或说明书注明，该试剂盒用于通过定量检测P4HA2的表达量来判断患白血病的几率。进一步地，容器（2）内含有P4HA2基因荧光定量PCR扩增特异引物，序列为SEQ.ID.NO7和SEQ.ID.NO8，以及内参基因GAPDH荧光定量PCR扩增特异引物，序列为SEQ.ID.NO9和SEQ.ID.NO10。提取患者血液单核细胞后，用荧光定量PCR的方法检测P4HA2是否表达。若患者血液单核细胞中检测到P4HA2基因表达，根据P4HA2在正常人血液单核细胞中几乎不表达，则可判断该患者具有患白血病的可能性。

容器（3），其中含有Carabin特异性抗体，以及标签或说明书；所述标签或说明书注明，该试剂盒用于通过蛋白检测Carabin的表达量来判断患B淋巴瘤的几率。

本发明还包括P4HA2的基因、mRNA、cDNA或蛋白，以及Carabin的基因、mRNA、cDNA或蛋白，在制备检测和治疗B淋巴瘤或白血病药物中应用。

本发明研究表明，P4HA2能作为治疗B淋巴瘤的分子靶标。在本发明的一项实施例中，通过特异地针对P4HA2基因的短发夹RNA（shot hairpin RNA, shRNA），构建稳定抑制P4HA2表达的大B淋巴瘤细胞株及对照，检测到敲低P4HA2表达后的大B淋巴瘤细胞株的增殖速率减慢。在另一实施例中，将构建的稳定细胞株在裸鼠皮下接种。抑制P4HA2基因表达后，裸鼠体内成瘤能力大幅下降。在另一实施例中，将构建的稳定细胞株在裸鼠皮下接种。抑制Carabin基因表达后，裸鼠体内成瘤能力大幅提高。因此，可将P4HA2作为治疗B淋巴瘤的分子靶标，筛选P4HA2抑制剂对造血和淋巴组织肿瘤具有积极的治疗意义。

因此，本发明还包括P4HA2抑制剂，作为用于治疗B淋巴瘤的药物。

本发明的具体实现进一步说明如下：

（1）在弥散性大B淋巴瘤和反应增生淋巴结的组织样中检测P4HA2蛋白表达是否有异常（图1、2，实施例1、2、3和4）；

A、准备受试者测试样品；

B、用特异性抗P4HA2的抗体，检测待测弥散性大B淋巴瘤组织和反应增生淋巴结组织样本中P4HA2蛋白的表达量；

C、将弥散性大B淋巴瘤组织中测得的P4HA2蛋白表达量与对照反应增生淋巴结组织中的进行比较，如测得的表达量高于对照值，则表示被检测弥散性大B淋巴瘤组织中P4HA2的表达异常。P4HA2的表达量高于对照值表明受试者患有弥散性大B淋巴瘤，或患弥散性大B淋巴瘤的几率高于正常人群（图1（A））；

D、将弥散性大B淋巴瘤组织中P4HA2蛋白表达量与各项临床指标进行关联分析，发现P4HA2的高表达与弥散性大B淋巴瘤的分型和IPI指数相关联，由此可将P4HA2作为B淋巴瘤的标记物和预后指标；

E、将弥散性大B淋巴瘤组织中P4HA2蛋白表达量与病人生存期进行关联分析，发现P4HA2的高表达与非GCB型弥散性大B淋巴瘤病人的中位生存期相关联（图1（B）），由此可将P4HA2作为B淋巴瘤的预后指标。

（2）在急性髓性白血病和正常人血液样品中检测P4HA2基因表达是否有异常（图3，实施例6）；

A、准备受试者测试样品；

B、用特异性P4HA2的RT-PCR引物检测急性髓性白血病和正常人血液样品中P4HA2基因的表达量；

C、将P4HA2表达量检测结果与正常人对照值进行比较，P4HA2的表达量高于对照值表明受试者患有急性髓性白血病，或患急性髓性白血病的几率高于正常人群（图3）。

（3）本发明提供了P4HA2能作为治疗B淋巴瘤的分子靶标（图4、图5，实施例8、9）；

A、筛选针对P4HA2基因且有效抑制P4HA2表达的shRNA；

B、将抑制P4HA2表达的shRNA及对照制备慢病毒颗粒；

C、将B中制备的慢病毒颗粒分别侵染B淋巴瘤细胞株，筛选GFP表达阳性细胞株；

D、检测C中筛选出来细胞株的增殖速率，发现P4HA2敲减后的弥散性大B淋巴瘤细胞增殖速率显著减慢（图4），可将P4HA2作为治疗靶标；

E、将C中筛选出来的细胞株在裸鼠皮下接种，抑制P4HA2表达后移植瘤体积减小、体积增长减慢，并且重量减轻（图5），可将P4HA2作为治疗弥散性大B淋巴瘤靶标。同时，得到P4HA2抑制剂。

（4）本发明提供了Carabin能作为诊断B淋巴瘤的分子靶标（图6，实施例10）；

A、准备受试者测试样品；

B、用特异的Carabin抗体检测B淋巴瘤病人和正常人血液样品中Carabin蛋白的表达量；

C、将Carabin蛋白表达量检测结果与正常人对照值进行比较，Carabin的表达量高于对照值表明受试者患有B淋巴瘤的几率高于正常人群（图6）。

（5）本发明提供了Carabin能作为诊断B淋巴瘤的分子靶标（图7，实施例11）；

A、筛选针对Carabin基因且有效抑制Carabin表达的shRNA；

B、将抑制Carabin表达的shRNA及对照制备慢病毒颗粒；

C、将B中制备的慢病毒颗粒分别侵染B淋巴瘤细胞株，筛选GFP表达阳性细胞株；

D、检测C中筛选出来细胞株的增殖速率，发现Carabin敲减后的弥散性大B淋巴瘤细胞增殖速率显著加快（图7）；

E、将C中筛选出来的细胞株在裸鼠皮下接种，抑制Carabin表达后移植瘤体积增大、体积增长加。

附图说明

图1、P4HA2蛋白在弥散性大B淋巴瘤中高表达。其中，A、P4HA2蛋白弥散性大B淋巴瘤中差异表达；B、P4HA2表达量与非GCB型弥散性大B淋巴瘤病人中位生存期相关。

图2、流式细胞仪检测P4HA2蛋白在不同细胞株中的表达量。

图3、P4HA2基因在急性髓性白血病人血液样本中高表达。

图4、抑制P4HA2表达的B淋巴瘤细胞株增殖速率减慢。其中，A、shRNA抑制P4HA2蛋白表达；B、抑制P4HA2表达的B淋巴瘤细胞株增殖速率减慢。

图5、抑制P4HA2表达的B淋巴瘤细胞株体内致瘤能力降低。其中，A、抑制P4HA2表达的B淋巴瘤细胞株体内成瘤能力比较；B、裸鼠瘤体体积增长曲线；C、裸鼠瘤体重量。

图6、Carabin蛋白在弥散性大B淋巴瘤中低表达。

图7、抑制Carabin表达的B淋巴瘤细胞株体内致瘤能力增强。其中，A、抑制Carabin表达的B淋巴瘤细胞株体内成瘤能力比较；B、裸鼠瘤体体积增长曲线；C、裸鼠瘤体重量。

具体实施方式

实施例1、免疫组化分析P4HA2蛋白在弥散性大B淋巴瘤中的表达。

检测材料及其制备：收集205例弥散性大B淋巴瘤和20例反应增生淋巴结组织样本，缓冲福尔马林固定24小时。流水冲洗1小时，将样品置于30%、50%乙醇中各30分钟，最后4℃保存于70％乙醇中。将固定好的样品先经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，然后在52℃左右条件下进行石蜡包埋，并分别将厚4-10μm、直径宽为0.1mm切片以点排列形式贴于多聚赖氨酸处理过的干净载玻片上，制成组织芯片。34℃烤片过夜， 4℃密封保存。

操作方法：取制备好的组织芯片，先进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，然后加入0.3％过氧化氢37℃孵育20分钟；切片浸于柠檬酸缓冲液（PH6.0）中，微波进行抗原修复15分钟，自然冷却；PBS浸洗（5分钟×3 次）；加入兔抗人P4HA2多抗（Proteintech 公司，1:100稀释于5%BSA中），37℃反应1小时后4℃孵育过夜；PBS浸洗（5分钟×3 次）；加入HRP标记的羊抗兔即用型二抗（Dako公司），37℃反应1小时；PBS浸洗（5分钟×3 次）；DAB底物（Dako公司）显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后扫描（Leica SCN400 slide scanner）。对204例弥散性大B淋巴瘤组织中P4HA2的表达强弱进行判读及打分，对染色强度的判断采用0-3级系统：0为无染色（无棕色阳性信号），1为弱染色，2为中度染色，3为强染色。

结果：如附图1A所示，左图和右图分别是P4HA2在反应性增生组织和弥散性大B淋巴瘤组织中表达的代表性图片。图中显示P4HA2在反应性增生组织中几乎不表达或表达较低，而在弥散性大B淋巴瘤组织中高表达，结果具有显著性差异（p<0.01）。

实施例2、P4HA2蛋白的表达强度与弥散性大B淋巴瘤的分型和预后相关

根据实施例1的结果，进一步分析P4HA2蛋白在弥散性大B淋巴瘤中的表达与临床病理参数的相关性。结果如表1所示，P4HA2的表达与年龄、性别未发现有相关性，但是与弥散性大B淋巴瘤的分型和预后两个指标分别具有显著相关性。在恶性程度更高的非GCB型弥散性大B淋巴瘤患者中，P4HA2的表达更高。IPI由5个与预后相关的病理指标打分得来，分值越高，代表预后越差。P4HA2表达越高，IPI分值越高，弥散性大B淋巴瘤预后越差。

表1.P4HA2表达强度与临床病理指标的相关性分析

。

实施例3、P4HA2蛋白的表达强度与弥散性大B淋巴瘤病人的中位生存期分析

根据实施例1的结果，我们还分析了P4HA2与弥散性大B淋巴瘤病人中位生存期的关联性。发现P4HA2表达越强，非GCB性弥散性大B淋巴瘤病人中位生存期越短。这表明P4HA2确实与弥散性大B淋巴瘤发生发展密切相关，能作为弥散性大B淋巴瘤的诊断或治疗预后标记物。

实施例4、流式细胞仪检测P4HA2蛋白的表达

检测材料及其制备：

A、 获取P4HA2阳性细胞293T，以及P4HA2阴性细胞Jurkat。PBS洗两次，每次1000rpm，5分钟。洗去细胞中的培养基；

B、固定液：提前将甲醇放入-20℃过夜；

C、PBA: 配制2% BSA的PBS溶液。

操作方法：

A、将293T、Jurkat细胞重悬在100μl PBS缓冲液中，逐滴加入1ml -20℃预冷的甲醇（边加边震荡），-20℃静置10分钟；

B、1000rpm，5分钟离心，小心去上清，用1mlPBA溶液将细胞重悬并分为两份（此步骤及以后步骤需要小心轻柔的吹打细胞），1000rpm，5分钟离心去上清；

C、分别用PBS稀释IgG、P4HA2抗体至2μg/ml，各200μl；

D、分别用IgG、P4HA2抗体重悬293T、Jurkat两种细胞，并编号：293T-IgG、293T-P4HA2、Jurkat-IgG、Jurkat-P4HA2。4℃放置2小时；

E、用PBA将细胞洗一遍（1000rpm，5分钟）；

F、1:1000加入荧光标记的二抗（Jackson），室温放置30min；

G、PBA将细胞洗两遍（1000rpm，5分钟），重悬在100μl PBS中；

H、用流式细胞仪进行检测。（BD Accuri C6）。

结果：如图2所示，不表达P4HA2的Jurkat细胞中，P4HA2的检测结果呈阴性，而表达P4HA2的293T细胞中，P4HA2结果呈阳性，说明用于检测的P4HA2抗体特异性较好。且该方法可用于检测B淋巴瘤或白血病患者血液分离的外周血单核细胞中P4HA2的蛋白含量，并以此判断患者患有包括急性髓性白血病在内的造血及淋巴组织肿瘤疾病的几率。

实施例5、检测弥散性大B淋巴瘤的试剂盒

制备用于检测弥散性大B淋巴瘤的试剂盒，所述试剂盒包括：A、标签或说明书，所述标签或说明书注明该试剂盒用于检测或诊断弥散性大B淋巴瘤；B、特异性针对P4HA2的抗体（可购自Proteintech公司）。

用上述检测试剂盒，通过免疫组化的方法检测了201例弥散性大B淋巴瘤和20例反应增生淋巴结组织样本。结果表明，20例反应增生淋巴结组织样本染色强度为0或1，基本无阳性信号；当阳性阈值取1以上时，评定120例弥散性大B淋巴瘤样本为P4HA2阳性，阳性率约为59.7%。

实施例6、荧光定量RT-PCR方法检测P4HA2 mRNA在急性髓性白血病人血液样本中的表达

检测材料及其制备：

A、获取外周血单个核细胞（PBMC）。收集12例急性髓性白血病和3例正常人各3ml血液样本。采用Ficoll淋巴细胞分离液（GE公司）分离PBMC，以Ficoll比血液1：2的体积比缓缓将血液加入Ficoll液体中，室温静置15分钟后，4000g离心20分钟；离心后取界面细胞，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）重悬，1500g离心5分钟；去上清后加入红细胞裂解液（上海歌凡生物公司）处理3分钟后加入PBS再次重悬，1500g离心5分钟后得到血液样本中的PBMC；

B、制备PBMC的cDNA模板。将适量Trizol（Invitrogen公司）加入PBMC中，按照说明书推荐的方法抽取PBMC的总RNA，逆转录（Takara公司）制备cDNA模板；

C、检测P4HA2的mRNA丰度。设计合成P4HA2和内参基因GAPDH荧光定量PCR引物；

P4HA2上游引物序列：5’-CGGTGTTGTGGATGGAGCAGGTGC-3’（SEQ.ID.NO7）

P4HA2下游引物序列：5’-CTGCTCCATCCACAACACCGTATG-3’（SEQ.ID.NO8）

GAPDH上游引物序列：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’（SEQ.ID.NO9）

GAPDH下游引物序列：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’（SEQ.ID.NO10）。

操作方法：

按以下体积配置PCR反应体系：

按如下条件进行PCR反应：

98℃：1min

95℃：10s

60℃：10s40个循环

72℃：20s

72℃：2min。

结果：如图2所示，在检测的15例血液PBMC样本中，P4HA2在3例正常人血液PBMC样本红几乎不表达或表达很低，而在15例急性髓性白血病样本中均被检测到。因此，P4HA2 mRNA在急性髓性白血病人中较之正常人显著高表达（p<0.01）。

实施例7、P4HA2 mRNA检测试剂盒的制备

如实施例5所述，P4HA2 mRNA在正常人血液PBMC中不表达，而在急性髓性白血病血液PBMC样本中被检测到有表达，据此可制备P4HA2 mRNA检测试剂盒。

该试剂盒含有：A、标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于通过定量检测P4HA2的表达量来判断患白血病的几率；B、P4HA2荧光定量PCR检测的上下游引物，例如SEQ.ID.NO5和 SEQ.ID.NO6；C、内参基因GAPDH荧光定量PCR检测的上下游引物，例如SEQ.ID.NO7和SEQ.ID.NO8。

根据实施例6所述制备样品并检测，分析实验结果，如果检测对象的P4HA2 mRNA的量与一般人群中P4HA2 mRNA的量之比 ≥ 1.5（较佳地≥ 2.0,更佳地≥ 2.5），则该对象发生包括急性髓性白血病在内的造血及淋巴组织肿瘤疾病的几率大于正常人群。

实施例8、抑制P4HA2表达使弥散性大B淋巴瘤细胞增殖速率显著减慢

检测材料及其制备：

A、构建敲减P4HA2的慢病毒载体。设计并验证有效敲减P4HA2的psicor shRNA，序列如下：shP1:GCGGTACTTTGAGCAGTTA（SEQ.ID.NO11），

shP2:GCAGGTGCTAAAGCAGCTT（SEQ.ID.NO12）；

B、制备敲减P4HA2的慢病毒颗粒，感染弥散性大B淋巴瘤细胞株。将敲减P4HA2的shRNA构建入慢病毒载体pLVX-shRNA-GFP，然后与pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞，48小时后收获上清，0.45µM滤膜过滤。将过滤后的带病毒颗粒的上清感染弥散性大B淋巴瘤细胞株SU-DHL-4，72小时后观察GFP绿色荧光表达情况；

C、分选稳定敲减P4HA2的阳性细胞。因为敲减P4HA2的shRNA慢病毒质粒表达时会发GFP绿色荧光，以此作为流式细胞仪筛选标记。感染的SU-DHL-4培养一段时间后，通过流式细胞仪筛选GFP表达的阳性细胞，并用Western Blot验证P4HA2的敲减效率（图4(A)）。

操作方法：将筛选出来敲减P4HA2基因的SU-DHL-4细胞接种于96孔板，密度为6000个/孔，接种后第1、2、3、4、5天分别用Alamar blue法检测细胞相对数量，绘制细胞增殖曲线。

结果：如图4(B)所示，敲减P4HA2后的弥散性大B淋巴瘤细胞增殖速率降低，结果具有显著性差异。

实施例9、抑制P4HA2的表达后裸鼠体内致瘤能力大幅下降

检测材料及其制备：裸鼠皮下接种细胞。选取4周龄的雌性裸鼠（斯莱克公司），提前饲养一周适应环境。将5*10⁶个细胞重悬于100µl PBS溶液中，与100µl Matrigel（BD公司）混合后接种于裸鼠皮下。

操作方法：观察接种细胞处长出瘤体后，每隔一天测量瘤体体积和裸鼠重量。当裸鼠带瘤生长21天，瘤体体积不超过2cm³时安乐处死裸鼠。将瘤体剥离、称重，拍照记录。

结果：如图5所示，敲减P4HA2表达后，瘤体相对对照组显著减小，瘤体体积增长显著减慢，瘤体重量也较轻。可见P4HA2与肿瘤发生发展密切相关，可作为弥散性大B淋巴瘤治疗靶标。

实施例10、蛋白免疫印迹分析Carabin蛋白在弥散性大B淋巴瘤中的表达

检测材料及其制备：收集9例弥散性大B淋巴瘤组织样本和3例正常人PBMC分选出来的B细胞，裂解后用SDS上样缓冲液混匀，沸水浴处理（980C）8分钟。

操作方法：利用微量上样针将制备好的蛋白样品依次加到 SDS-PAGE 胶的加样孔 中,80V 恒压电泳 30min 左右,当溴酚蓝标记的样品进入分离胶后,将电泳 调至 110V 恒压继续电泳,直至溴酚蓝完全离开分离胶进入电泳液后结束电泳。利用 Bio-Rad 湿法转移系统将蛋白从 SDS-PAGE 胶转移至硝酸纤维素 膜(NC 膜)上,冰水浴中 220mA 恒流转移1.5hr。将印有蛋白印迹的 NC 膜放置于封闭缓冲液中,放置于摇床,室温孵育45min。用抗体稀释液进行稀释,加到 NC 膜上, 放置于摇床,室温孵育 2hr 或者4℃过夜。用1xTBST 洗脱缓冲液洗膜 3 次,每次 10min。二抗按照说明书推荐比例用抗体稀释液进行稀释,加到 NC 膜上,放置于摇床,室温孵育 1hr。用 1xTBST 洗脱缓冲液洗膜 3 次,每次 10min。ECL 显色 A/B 液按照 1:1 比例混合均匀,均匀加在 NC 膜上,反应 1min 后吸去,暗房压片, 显影并定影。X 光片晾干后进行扫描存片。

结果：如附图6所示，Carabin在正常人PBMC分选出来的B细胞中高表达，而在弥散性大B淋巴瘤组织样本中低表达。

实施例11、抑制Carabin的表达后裸鼠体内致瘤能力大幅提高

检测材料及其制备：按实施例8所述构建稳定敲减Carabin（敲减序列shC，GGCGGTACAAGAAGGTAAA,(SEQ.ID.NO13)）的B淋巴瘤细胞株，裸鼠皮下接种细胞。选取4周龄的雌性裸鼠（斯莱克公司），提前饲养一周适应环境。将5*10⁶个细胞重悬于100µl PBS溶液中，与100µl Matrigel（BD公司）混合后接种于裸鼠皮下。

操作方法：观察接种细胞处长出瘤体后，每隔一天测量瘤体体积和裸鼠重量。当裸鼠带瘤生长21天，瘤体体积不超过2cm³时安乐处死裸鼠。将瘤体剥离、称重，拍照记录。

结果：如图7所示，敲减Carabin表达后，瘤体相对对照组显著增大，瘤体体积增长显著加快，瘤体重量增重。可见Carabin与B淋巴瘤发生发展密切相关。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> B淋巴瘤和白血病的检测标记物、试剂盒及其应用

<130> 001

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213>

<400> 1

atgaaactct gggtgtctgc attgctgatg gcctggtttg gtgtcctgag ctgtgtgcag 60

gccgaattct tcacctctat tgggcacatg actgacctga tttatgcaga gaaagagctg 120

gtgcagtctc tgaaagagta catccttgtg gaggaagcca agctttccaa gattaagagc 180

tgggccaaca aaatggaagc cttgactagc aagtcagctg ctgatgctga gggctacctg 240

gctcaccctg tgaatgccta caaactggtg aagcggctaa acacagactg gcctgcgctg 300

gaggaccttg tcctgcagga ctcagctgca ggttttatcg ccaacctctc tgtgcagcgg 360

cagttcttcc ccactgatga ggacgagata ggagctgcca aagccctgat gagacttcag 420

gacacataca ggctggaccc aggcacaatt tccagagggg aacttccagg aaccaagtac 480

caggcaatgc tgagtgtgga tgactgcttt gggatgggcc gctcggccta caatgaaggg 540

gactattatc atacggtgtt gtggatggag caggtgctaa agcagcttga tgccggggag 600

gaggccacca caaccaagtc acaggtgctg gactacctca gctatgctgt cttccagttg 660

ggtgatctgc accgtgccct ggagctcacc cgccgcctgc tctcccttga cccaagccac 720

gaacgagctg gagggaatct gcggtacttt gagcagttat tggaggaaga gagagaaaaa 780

acgttaacaa atcagacaga agctgagcta gcaaccccag aaggcatcta tgagaggcct 840

gtggactacc tgcctgagag ggatgtttac gagagcctct gtcgtgggga gggtgtcaaa 900

ctgacacccc gtagacagaa gaggcttttc tgtaggtacc accatggcaa cagggcccca 960

cagctgctca ttgccccctt caaagaggag gacgagtggg acagcccgca catcgtcagg 1020

tactacgatg tcatgtctga tgaggaaatc gagaggatca aggagatcgc aaaacctaaa 1080

cttgcacgag ccaccgttcg tgatcccaag acaggagtcc tcactgtcgc cagctaccgg 1140

gtttccaaaa gctcctggct agaggaagat gatgaccctg ttgtggcccg agtaaatcgt 1200

cggatgcagc atatcacagg gttaacagta aagactgcag aattgttaca ggttgcaaat 1260

tatggagtgg gaggacagta tgaaccgcac ttcgacttct ctaggaatga tgagcgagat 1320

actttcaagc atttagggac ggggaatcgt gtggctactt tcttaaacta catgagtgat 1380

gtagaagctg gtggtgccac cgtcttccct gatctggggg ctgcaatttg gcctaagaag 1440

ggtacagctg tgttctggta caacctcttg cggagcgggg aaggtgacta ccgaacaaga 1500

catgctgcct gccctgtgct tgtgggctgc aagtgggtct ccaataagtg gttccatgaa 1560

cgaggacagg agttcttgag accttgtgga tcaacagaag ttgactga 1608

<210> 2

<211> 2588

<212> DNA

<213>

<400> 2

agcgttgttt ttccttggca gctgcggaga cccgtgataa ttcgttaact aattcaacaa 60

acgggaccct tctgtgtgcc agaaaccgca agcagttgct aacccagtgg gacaggcgga 120

ttggaagagc gggaaggtcc tggcccagag cagtgtggtg agcgctgtgc tggaagggaa 180

tgcgggcagt gggtacttgg tagagcactg actgcctccg gccagaggac ttcccggagg 240

aggtgaccca tgagctggag tggtcagagg aaggctggca aaagggcatc gtggacagag 300

gaacagccta tgtgagtggg agcagagacc ttggccaatg ccattcctta tggccttgta 360

gtggaagcaa ggtgatgggg aaggaacact gtaggggata gctgtccacg gacgctgtct 420

acaagaccct ggagtgagat aacgtgcctg gtactgtgcc ctgcatgtgt aagatgccca 480

gttgaccttc gcagcaggag cctggatcag ggcacttcct gcctcaggta ttgctggaca 540

gcccagacac ttccctctgt gaccatgaaa ctctgggtgt ctgcattgct gatggcctgg 600

tttggtgtcc tgagctgtgt gcaggccgaa ttcttcacct ctattgggca catgactgac 660

ctgatttatg cagagaaaga gctggtgcag tctctgaaag agtacatcct tgtggaggaa 720

gccaagcttt ccaagattaa gagctgggcc aacaaaatgg aagccttgac tagcaagtca 780

gctgctgatg ctgagggcta cctggctcac cctgtgaatg cctacaaact ggtgaagcgg 840

ctaaacacag actggcctgc gctggaggac cttgtcctgc aggactcagc tgcaggtttt 900

atcgccaacc tctctgtgca gcggcagttc ttccccactg atgaggacga gataggagct 960

gccaaagccc tgatgagact tcaggacaca tacaggctgg acccaggcac aatttccaga 1020

ggggaacttc caggaaccaa gtaccaggca atgctgagtg tggatgactg ctttgggatg 1080

ggccgctcgg cctacaatga aggggactat tatcatacgg tgttgtggat ggagcaggtg 1140

ctaaagcagc ttgatgccgg ggaggaggcc accacaacca agtcacaggt gctggactac 1200

ctcagctatg ctgtcttcca gttgggtgat ctgcaccgtg ccctggagct cacccgccgc 1260

ctgctctccc ttgacccaag ccacgaacga gctggaggga atctgcggta ctttgagcag 1320

ttattggagg aagagagaga aaaaacgtta acaaatcaga cagaagctga gctagcaacc 1380

ccagaaggca tctatgagag gcctgtggac tacctgcctg agagggatgt ttacgagagc 1440

ctctgtcgtg gggagggtgt caaactgaca ccccgtagac agaagaggct tttctgtagg 1500

taccaccatg gcaacagggc cccacagctg ctcattgccc ccttcaaaga ggaggacgag 1560

tgggacagcc cgcacatcgt caggtactac gatgtcatgt ctgatgagga aatcgagagg 1620

atcaaggaga tcgcaaaacc taaacttgca cgagccaccg ttcgtgatcc caagacagga 1680

gtcctcactg tcgccagcta ccgggtttcc aaaagctcct ggctagagga agatgatgac 1740

cctgttgtgg cccgagtaaa tcgtcggatg cagcatatca cagggttaac agtaaagact 1800

gcagaattgt tacaggttgc aaattatgga gtgggaggac agtatgaacc gcacttcgac 1860

ttctctagga atgatgagcg agatactttc aagcatttag ggacggggaa tcgtgtggct 1920

actttcttaa actacatgag tgatgtagaa gctggtggtg ccaccgtctt ccctgatctg 1980

ggggctgcaa tttggcctaa gaagggtaca gctgtgttct ggtacaacct cttgcggagc 2040

ggggaaggtg actaccgaac aagacatgct gcctgccctg tgcttgtggg ctgcaagtgg 2100

gtctccaata agtggttcca tgaacgagga caggagttct tgagaccttg tggatcaaca 2160

gaagttgact gacatccttt tctgtccttc cccttcctgg tccttcagcc catgtcaacg 2220

tgacagacac ctttgtatgt tcctttgtat gttcctatca ggctgatttt tggagaaatg 2280

aatgtttgtc tggagcagag ggagaccata ctagggcgac tcctgtgtga ctgaagtccc 2340

agcccttcca ttcagcctgt gccatccctg gccccaaggc taggatcaaa gtggctgcag 2400

cagagttagc tgtctagcgc ctagcaaggt gcctttgtac ctcaggtgtt ttaggtgtga 2460

gatgtttcag tgaaccaaag ttctgatacc ttgtttacat gtttgttttt atggcatttc 2520

tatctattgt ggctttacca aaaaataaaa tgtccctacc agaagcctta aaaaaaaaaa 2580

aaaaaaaa 2588

<210> 3

<211> 535

<212> PRT

<213>

<400> 3

Met Lys Leu Trp Val Ser Ala Leu Leu Met Ala Trp Phe Gly Val Leu

1 5 10 15

Ser Cys Val Gln Ala Glu Phe Phe Thr Ser Ile Gly His Met Thr Asp

20 25 30

Leu Ile Tyr Ala Glu Lys Glu Leu Val Gln Ser Leu Lys Glu Tyr Ile

35 40 45

Leu Val Glu Glu Ala Lys Leu Ser Lys Ile Lys Ser Trp Ala Asn Lys

50 55 60

Met Glu Ala Leu Thr Ser Lys Ser Ala Ala Asp Ala Glu Gly Tyr Leu

65 70 75 80

Ala His Pro Val Asn Ala Tyr Lys Leu Val Lys Arg Leu Asn Thr Asp

85 90 95

Trp Pro Ala Leu Glu Asp Leu Val Leu Gln Asp Ser Ala Ala Gly Phe

100 105 110

Ile Ala Asn Leu Ser Val Gln Arg Gln Phe Phe Pro Thr Asp Glu Asp

115 120 125

Glu Ile Gly Ala Ala Lys Ala Leu Met Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Arg

130 135 140

Leu Asp Pro Gly Thr Ile Ser Arg Gly Glu Leu Pro Gly Thr Lys Tyr

145 150 155 160

Gln Ala Met Leu Ser Val Asp Asp Cys Phe Gly Met Gly Arg Ser Ala

165 170 175

Tyr Asn Glu Gly Asp Tyr Tyr His Thr Val Leu Trp Met Glu Gln Val

180 185 190

Leu Lys Gln Leu Asp Ala Gly Glu Glu Ala Thr Thr Thr Lys Ser Gln

195 200 205

Val Leu Asp Tyr Leu Ser Tyr Ala Val Phe Gln Leu Gly Asp Leu His

210 215 220

Arg Ala Leu Glu Leu Thr Arg Arg Leu Leu Ser Leu Asp Pro Ser His

225 230 235 240

Glu Arg Ala Gly Gly Asn Leu Arg Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Glu Glu

245 250 255

Glu Arg Glu Lys Thr Leu Thr Asn Gln Thr Glu Ala Glu Leu Ala Thr

260 265 270

Pro Glu Gly Ile Tyr Glu Arg Pro Val Asp Tyr Leu Pro Glu Arg Asp

275 280 285

Val Tyr Glu Ser Leu Cys Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Thr Pro Arg

290 295 300

Arg Gln Lys Arg Leu Phe Cys Arg Tyr His His Gly Asn Arg Ala Pro

305 310 315 320

Gln Leu Leu Ile Ala Pro Phe Lys Glu Glu Asp Glu Trp Asp Ser Pro

325 330 335

His Ile Val Arg Tyr Tyr Asp Val Met Ser Asp Glu Glu Ile Glu Arg

340 345 350

Ile Lys Glu Ile Ala Lys Pro Lys Leu Ala Arg Ala Thr Val Arg Asp

355 360 365

Pro Lys Thr Gly Val Leu Thr Val Ala Ser Tyr Arg Val Ser Lys Ser

370 375 380

Ser Trp Leu Glu Glu Asp Asp Asp Pro Val Val Ala Arg Val Asn Arg

385 390 395 400

Arg Met Gln His Ile Thr Gly Leu Thr Val Lys Thr Ala Glu Leu Leu

405 410 415

Gln Val Ala Asn Tyr Gly Val Gly Gly Gln Tyr Glu Pro His Phe Asp

420 425 430

Phe Ser Arg Asn Asp Glu Arg Asp Thr Phe Lys His Leu Gly Thr Gly

435 440 445

Asn Arg Val Ala Thr Phe Leu Asn Tyr Met Ser Asp Val Glu Ala Gly

450 455 460

Gly Ala Thr Val Phe Pro Asp Leu Gly Ala Ala Ile Trp Pro Lys Lys

465 470 475 480

Gly Thr Ala Val Phe Trp Tyr Asn Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gly Asp

485 490 495

Tyr Arg Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Val Gly Cys Lys Trp

500 505 510

Val Ser Asn Lys Trp Phe His Glu Arg Gly Gln Glu Phe Leu Arg Pro

515 520 525

Cys Gly Ser Thr Glu Val Asp

530 535

<210> 4

<211> 1341

<212> DNA

<213>

<400> 4

atggcccagg ccctggggga ggacctggtg cagcctcccg agctgcagga tgactccagc 60

tccttggggt ccgactcaga gctcagcggg cctggcccat atcgccaggc cgaccgctat 120

ggattcattg ggggcagctc agcagagcca gggccgggcc acccacctgc agacctcatc 180

cgccaacggg agatgaagtg ggtggagatg acctcgcact gggagaaaac catgtcccgg 240

cggtacaaga aggtaaagat gcagtgccgg aaaggcatcc cgtctgccct gcgcgcccga 300

tgctggcccc tgttgtgtgg ggcccatgtg tgccagaaga acagccctgg cacctatcag 360

gagctggcag aggcccctgg agacccacag tggatggaga ccattggcag ggacctgcac 420

cgtcaattcc ctctgcacga gatgtttgtg tcgcctcagg gccacgggca gcaggggctc 480

ctgcaggtgc tcaaggccta caccctgtat cgaccggagc agggctactg ccaggcccag 540

gggcccgtgg ctgctgtgct gctcatgcac ctgcccccag aggaggcctt ctggtgcctg 600

gtgcagatct gtgaggtcta cctccctggg tactacgggc cccacatgga ggctgtgcgg 660

ctggacgccg aggtgttcat ggccctgctg cggcggctgc ttccgcacgt gcacaagcac 720

ctgcagcagg tgggcgtcgg acccctgctg tacctgcccg agtggttcct gtgcctcttc 780

gcccgctccc tgcccttccc cacagtgctg cgtgtctggg atgccttcct cagtgagggt 840

gccagagtac tgttccgtgt ggggctgaca ctggtgcgcc tggcgctggg cactgcagag 900

cagcgagggg cctgccctgg cctcctggag acactgggag cccttcgagc catccccccc 960

gcgcagctgc aggaggaggc cttcatgtca caggtgcaca gcgtggtgct gtcagagcgg 1020

gacctgcagc gggagatcaa ggcccagctg gcccagctgc ccgattccgc gccgggaccc 1080

ccgccccggc cacaggtccg cctcgccggg gcccaagcca tctttgaggc ccagcagctg 1140

gcaggagtgc gacgaggcgc caagcctgag gtgcctcgga ttgtggtgca gcccccggag 1200

gagcccagac caccgcggcg gaaaccccag acccgcggca agactttcca tgggctcctg 1260

actcgggccc ggggcccccc catcgagggg ccccccaggc cccaacgagg ctccacctcc 1320

ttcctggaca cccgcttctg a 1341

<210> 5

<211> 1752

<212> DNA

<213>

<400> 5

gaggaggagg aggaagtgag aggaggaggt gaggtgctgc gggaggcccc gggcaccatg 60

gcccaggccc tgggggagga cctggtgcag cctcccgagc tgcaggatga ctccagctcc 120

ttggggtccg actcagagct cagcgggcct ggcccatatc gccaggccga ccgctatgga 180

ttcattgggg gcagctcagc agagccaggg ccgggccacc cacctgcaga cctcatccgc 240

caacgggaga tgaagtgggt ggagatgacc tcgcactggg agaaaaccat gtcccggcgg 300

tacaagaagg taaagatgca gtgccggaaa ggcatcccgt ctgccctgcg cgcccgatgc 360

tggcccctgt tgtgtggggc ccatgtgtgc cagaagaaca gccctggcac ctatcaggag 420

ctggcagagg cccctggaga cccacagtgg atggagacca ttggcaggga cctgcaccgt 480

caattccctc tgcacgagat gtttgtgtcg cctcagggcc acgggcagca ggggctcctg 540

caggtgctca aggcctacac cctgtatcga ccggagcagg gctactgcca ggcccagggg 600

cccgtggctg ctgtgctgct catgcacctg cccccagagg aggccttctg gtgcctggtg 660

cagatctgtg aggtctacct ccctgggtac tacgggcccc acatggaggc tgtgcggctg 720

gacgccgagg tgttcatggc cctgctgcgg cggctgcttc cgcacgtgca caagcacctg 780

cagcaggtgg gcgtcggacc cctgctgtac ctgcccgagt ggttcctgtg cctcttcgcc 840

cgctccctgc ccttccccac agtgctgcgt gtctgggatg ccttcctcag tgagggtgcc 900

agagtactgt tccgtgtggg gctgacactg gtgcgcctgg cgctgggcac tgcagagcag 960

cgaggggcct gccctggcct cctggagaca ctgggagccc ttcgagccat cccccccgcg 1020

cagctgcagg aggaggcctt catgtcacag gtgcacagcg tggtgctgtc agagcgggac 1080

ctgcagcggg agatcaaggc ccagctggcc cagctgcccg attccgcgcc gggacccccg 1140

ccccggccac aggtccgcct cgccggggcc caagccatct ttgaggccca gcagctggca 1200

ggagtgcgac gaggcgccaa gcctgaggtg cctcggattg tggtgcagcc cccggaggag 1260

cccagaccac cgcggcggaa accccagacc cgcggcaaga ctttccatgg gctcctgact 1320

cgggcccggg gcccccccat cgaggggccc cccaggcccc aacgaggctc cacctccttc 1380

ctggacaccc gcttctgaga ggaccatgga cttagtgtcc cccagtctca attgcctgat 1440

ggctgatgcc agcccggcaa ataggcaccg cactttactc ttgggactcg gggacttggc 1500

ttccttcctg gcaaggacca ggcagtgggg aaggaggagg tcctccgtgg tacatactgg 1560

gtcaggcact agcatggagg agggtcacag agtggggcac gtgaggaccc atggaaccgt 1620

cctggtgccc aggccctcac aagtaccaaa gccagcacca aaggagtcag ggaaggggtt 1680

ggctgagtca agggacccca gagggcacca ggaataaaat cttcttgaac agataaaaaa 1740

aaaaaaaaaa aa 1752

<210> 6

<211> 446

<212> PRT

<213>

<400> 6

Met Ala Gln Ala Leu Gly Glu Asp Leu Val Gln Pro Pro Glu Leu Gln

1 5 10 15

Asp Asp Ser Ser Ser Leu Gly Ser Asp Ser Glu Leu Ser Gly Pro Gly

20 25 30

Pro Tyr Arg Gln Ala Asp Arg Tyr Gly Phe Ile Gly Gly Ser Ser Ala

35 40 45

Glu Pro Gly Pro Gly His Pro Pro Ala Asp Leu Ile Arg Gln Arg Glu

50 55 60

Met Lys Trp Val Glu Met Thr Ser His Trp Glu Lys Thr Met Ser Arg

65 70 75 80

Arg Tyr Lys Lys Val Lys Met Gln Cys Arg Lys Gly Ile Pro Ser Ala

85 90 95

Leu Arg Ala Arg Cys Trp Pro Leu Leu Cys Gly Ala His Val Cys Gln

100 105 110

Lys Asn Ser Pro Gly Thr Tyr Gln Glu Leu Ala Glu Ala Pro Gly Asp

115 120 125

Pro Gln Trp Met Glu Thr Ile Gly Arg Asp Leu His Arg Gln Phe Pro

130 135 140

Leu His Glu Met Phe Val Ser Pro Gln Gly His Gly Gln Gln Gly Leu

145 150 155 160

Leu Gln Val Leu Lys Ala Tyr Thr Leu Tyr Arg Pro Glu Gln Gly Tyr

165 170 175

Cys Gln Ala Gln Gly Pro Val Ala Ala Val Leu Leu Met His Leu Pro

180 185 190

Pro Glu Glu Ala Phe Trp Cys Leu Val Gln Ile Cys Glu Val Tyr Leu

195 200 205

Pro Gly Tyr Tyr Gly Pro His Met Glu Ala Val Arg Leu Asp Ala Glu

210 215 220

Val Phe Met Ala Leu Leu Arg Arg Leu Leu Pro His Val His Lys His

225 230 235 240

Leu Gln Gln Val Gly Val Gly Pro Leu Leu Tyr Leu Pro Glu Trp Phe

245 250 255

Leu Cys Leu Phe Ala Arg Ser Leu Pro Phe Pro Thr Val Leu Arg Val

260 265 270

Trp Asp Ala Phe Leu Ser Glu Gly Ala Arg Val Leu Phe Arg Val Gly

275 280 285

Leu Thr Leu Val Arg Leu Ala Leu Gly Thr Ala Glu Gln Arg Gly Ala

290 295 300

Cys Pro Gly Leu Leu Glu Thr Leu Gly Ala Leu Arg Ala Ile Pro Pro

305 310 315 320

Ala Gln Leu Gln Glu Glu Ala Phe Met Ser Gln Val His Ser Val Val

325 330 335

Leu Ser Glu Arg Asp Leu Gln Arg Glu Ile Lys Ala Gln Leu Ala Gln

340 345 350

Leu Pro Asp Ser Ala Pro Gly Pro Pro Pro Arg Pro Gln Val Arg Leu

355 360 365

Ala Gly Ala Gln Ala Ile Phe Glu Ala Gln Gln Leu Ala Gly Val Arg

370 375 380

Arg Gly Ala Lys Pro Glu Val Pro Arg Ile Val Val Gln Pro Pro Glu

385 390 395 400

Glu Pro Arg Pro Pro Arg Arg Lys Pro Gln Thr Arg Gly Lys Thr Phe

405 410 415

His Gly Leu Leu Thr Arg Ala Arg Gly Pro Pro Ile Glu Gly Pro Pro

420 425 430

Arg Pro Gln Arg Gly Ser Thr Ser Phe Leu Asp Thr Arg Phe

435 440 445

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 7

cggtgttgtg gatggagcag gtgc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 8

ctgctccatc cacaacaccg tatg 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213>

<400> 9

gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 10

gaagatggtg atgggatttc 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213>

<400> 11

gcggtacttt gagcagtta 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213>

<400> 12

gcaggtgcta aagcagctt 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213>

<400> 13

ggcggtacaa gaaggtaaa 19