四型胶原作为靶点在早期诊断主动脉瘤/夹层中的应用的制作方法

本发明涉及血管疾病的诊断和治疗领域，具体涉及一种新的主动脉瘤靶向分子以及用于早期诊断并靶向治疗胸主动脉瘤夹层和腹主动脉瘤发生的方法和试剂。

背景技术：

主动脉瘤(aorticaneurysm)，是指主动脉壁局部或弥漫性的异常扩张超过正常直径50％以上。一旦发生，破裂率高达80％以上。主动脉瘤好发于大动脉，包括升主动脉主动脉弓、胸部降主动脉、胸腹主动脉和腹主动脉。由于大动脉血压以及流速过快，极容易在应激情况下迅速扩张，甚至撕裂形成夹层，威胁病人生命。传统的主动脉瘤的诊断依靠影像学与临床症状相结合的方法，其中cta和mri更是作为诊断的金标准在临床中广泛应用。

近年来流行病大数据的研究发现在主动脉瘤极早期临床症状隐匿，且管腔并未出现明显扩张；但此时管壁内皮及中层已经出现明显病生理改变，此时若发生应激、突然血压升高，则容易撕裂出现夹层，而流行病数据也证实管腔直径与破裂风险之间无线性关系，一些管径较小的动脉瘤反而具有更高的破裂风险。由于主动脉夹层发生破裂后高致死率以及发病年龄的前移，迫切需要一种在早期特异、灵敏的方法对其进行检测，从而提高患者的生存率和生活质量。

随着对动脉瘤发病机制的深入研究，发现动脉瘤形成过程中存在多种比直径变化更早更特异的病理改变，如内皮的活化，平滑肌细胞的凋亡，中层弹力板的降解和炎症细胞的浸润。在此过程中，最先出现的是内皮细胞的活化，包括细胞间隙的扩大，细胞皱缩和内皮的脱落。四型胶原是一种内皮下基底膜的主要成分，在内皮细胞出现活化后可以暴露，从而被检测；在正常情况下四型胶原主要参与基底膜的形成与稳定性，而在病理过程中则促进细胞的迁移。分子病理学的发展为微观检测提供了可能性，可以通过选取病理过程中合适的分子作为靶点，通过与其特异性结合，特异性监测该病理过程的发生发展；并且可以通过靶向载药这一方式，提高病变部分的血药浓度，并且降低其他器官的毒性。

荧光成像技术作为一种优秀的检测和示踪手段被广泛应用于生命科学领域。荧光成像技术一般通过设计合理有效的荧光分子，辅以功能化的修饰，从而实现在细胞或者动物体内发光成像。其具备可选择性强，灵敏度高，可视化效果强，重复性较好等特点，现被充分的利用于疾病的检测和诊断，纳米材料的示踪，新型药物效果的评价等方面。通常的荧光探针需要具备一定的优异的生物相容性和光学特性，即需要有较高的荧光量子产率和摩尔消光系数，同时，其又要规避与生物基质有同样激发波长的情况下能有被有效的在细胞或者动物体内检测。现有的大部分荧光探针基本分为生物荧光探针和化学合成探针，其中生物荧光探针一般为固有的生物蛋白如基因编码的荧光蛋白等等，而化学荧光探针，包括人工合成的异硫氰酸荧光素，罗丹明b，花青染料荧光标记等等，都被广泛的使用于现在科学的研究中。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是针对现有诊疗技术的问题，研究四型胶原作为分子靶点，是否可作为诊断标志物应用于动脉瘤的精准诊断中。

本发明首先涉及四型胶原(coliv)作为诊断检测靶标，在早期诊断主动脉夹层/瘤中的应用。

本发明还涉及四型胶原(coliv)作为诊断检测靶标，在研发/筛选主动脉夹层/瘤早期诊断标识物中的应用。

进一步的，本发明还涉及靶向四型胶原的多肽(coliv-peptide)，所述的多肽的序列如seqidno.1所示，

seqidno.1：cgggkplvwlk。

本发明还涉及编码所述靶向四型胶原的多肽的核苷酸片段。

进一步的，本发明还涉及所述靶向四型胶原的多肽(coliv-peptide)或其衍生物在制备主动脉夹层/瘤早期诊断标志物中的应用，所述的诊断包括但不限于，经超声下检测、经mri下检测、经cta下检测、经荧光成像下检测中的任意一种或几种。

本发明还涉及所述靶向四型胶原多肽(coliv-peptide)或其衍生物在制备治疗或预防主动脉夹层/瘤药物中的应用，所述的药物包括但不限于，经胃肠消化道道给药的药物、经静脉注射给药的药物、经皮下包埋给药方式给药的药物。

所述的靶向四型胶原的多肽的衍生物包括但不限于，所述的靶向四型胶原的多肽被荧光标识物，mri标识物或其他可用化学发光检测的标记物或电信号检测的标记物中的一种或多种修饰/络合/共价偶联后的产物。。

优选的，所述靶向四型胶原的多肽(coliv-peptide)的衍生物为所述的靶向四型胶原的多肽被罗丹明b通过共价键修饰得到的coliv-rhb，所述的衍生物的化学结构如下式1所示：

更优选的，所述靶向四型胶原的多肽(coliv-peptide)的衍生物为所述的靶向四型胶原的多肽被两分子的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,,4,7,10-四羧酸钆通过酰胺键偶联得到的coliv-gb，其结构如式2所示：

最优选的，所述的靶向四型胶原的多肽(coliv-peptide)的衍生物为所述的多肽被罗丹明b通过共价键修饰后进一步被两分子的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,,4,7,10-四羧酸钆通过酰胺键偶联的产物(collageniv-targetedcontrastagent,c4tca)，其结构如式2所示

更进一步的，本发明还涉及所述的coliv-rhb、coliv-gb、c4tca在制备早期诊断主动脉瘤的制剂中的应用。

更进一步的，本发明还涉及所述的c4tca的制备方法，其步骤包括，

(1)充分盐化n-羟基琥珀酰亚胺活化过的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(nhs-dota)的羧基；

(2)使用n-羟基琥珀酰亚胺修饰过的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,,4,7,10-四羧酸(nhs-dota，化合物1)和六水合氯化钆络合，获得用n-羟基琥珀酰亚胺修饰过的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,,4,7,10-四羧酸钆(nhs-dota-gd，化合物2)；

(2)使用coliv-rhb(化合物3)和nhs-dota-gd反应，获得c4tca(化合物4)。

优选的，所述的合成步骤为：

(1)取12.7mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化过的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)，即nhs-dota，溶解于1ml的去离子水中，向其中加入8mg的碳酸氢钠，室温磁力搅拌10-20分钟，使其羧基充分盐化。

(2)取9.4mg的六水合氯化钆溶解于200μl的去离子水中，将所得的溶液缓慢的滴加入实例4(1)的溶液中，室温磁力搅拌12小时，使其充分络合。

(3)取20mg的罗丹明b修饰的四型胶原的靶向多肽(rhb-coliv)在避光的环境下溶解于800μl的水中，将所得的溶液加入实例4(2)最终得到的溶液里，避光环境下室温磁力搅拌12小时，所得的混合液通过1000mw的透析膜超滤提纯，最终溶液通过冻干的方式得到红色絮状固体，所有的后处理全程避光。

所述的合成路线为

附图说明

图1、动脉瘤进程中内皮细胞活化与中层弹力板断裂出现的时间图

图2、四型胶原在正常/病理下血管的表达部位示意图

图3、c4tca在小鼠主动脉瘤早期mri及荧光成像检测效果图

具体实施方式

实验动物

胸主动脉夹层/主动脉瘤模型：3周龄雄性野生型小鼠(c57bl/6)；apoe-/-小鼠(c57bl/6j)均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。所有动物均在北京市心肺血管疾病研究所spf级环境动物房进行饲养繁殖。野生小鼠需为达到3周龄，体重在10g左右的雄性小鼠。apoe-/-小鼠要求6w左右，体重在20～22g左右的雄性小鼠。所有实验操作均根据nih与1996年制定的《实验动物管理及使用指南》和首都医科大学实验动物管理委员会规定的实验流程进行。所有实验动物按照随机方法进行分组。

实施例1、胸主动脉夹层/主动脉瘤小鼠模型(小鼠tad模型)的构建

bapn喂水组小鼠tad模型的构建及评价

取3周龄c57bl/6背景雄性小鼠给予正常饮食，

bapn喂水组(n＝16)：将bapn以1g/kg/day剂量溶于饮水中。

喂bapn第14天，随机选择5只小鼠进行胸主动脉超声，判断是否已经存在胸主动脉的增宽/夹层。经多次重复实验，14天时部分小鼠已经形成主动脉夹层/主动脉瘤，并开始陆续死亡。

实施例2、小鼠tad模型组织切片检测

1.冰冻切片：

在实验结束时用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉处死小鼠，采用肝素化生理盐水进行心脏灌流，去除心脏残留血液。用4％多聚甲醛继续灌注，使血管组织形态原位固定。在体视显微镜下分离剪取主动脉弓部和降部，在4％多聚甲醛中浸泡固定2小时，后转移至30％蔗糖溶液中4℃过夜，充分脱水。第二天从蔗糖溶液中取出血管，用滤纸充分吸干组织水分，将血管竖直包埋于oct包埋剂中，锡箔纸包绕后于液氮中缓慢冻凝，可贮存于-80℃冰箱。进行连续冰冻组织切片，厚度5μm，用多聚赖氨酸涂层玻片贴片。

2.石蜡切片：

在实验结束时用戊巴比妥(100mg/kg)麻醉处死小鼠，采用肝素化生理盐水进行心脏灌流，去除心脏残留血液。在体视显微镜下分离剪取主动脉弓部，放于10％甲醛溶液中固定；将正常主动脉和tad组织放于10％甲醛溶液中固定。至少24小时后取出血管进行脱水处理，并用石蜡包埋组织(血管竖直向下)。切片时采用连续切片，厚度5μm，用多聚赖氨酸涂层玻片贴片。

实施例3、小鼠tad模型组织病理学检测：

i.通过弹力纤维染色观察弹力板情况，

具体操作如下：

1.1.冰冻切片：

(1)冰冻切片pbs中洗去oct；

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(试剂a)孵育5分钟，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸钠(试剂b)处理5分钟；

(4)用流水冲洗5分钟，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品红染液(试剂c)，进行染色10分钟，用70％酒精浸洗2次(每次约30秒，至切片不再脱色为止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黄g染液(试剂d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脱水5min；

(8)无水酒精脱水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

2.石蜡切片：

(1)石蜡切片常规用二甲苯脱蜡，经各级不同浓度的乙醇将石蜡切片脱蜡至水：二甲苯i(20min)→二甲苯ii(20min)→二甲苯iii(20min)→100％酒精(5min)→95％酒精(5min)→80％酒精(5min)→自来水洗去酒精。

(2)加入1滴(100μl)lugol碘液(试剂a)孵育5分钟，稍加水洗；

(3)加入1滴(100μl)硫代酸钠(试剂b)处理5分钟；

(4)用流水冲洗5分钟，70％酒精稍洗；

(5)加入1滴(100μl)醛品红染液(试剂c)，进行染色10分钟，用70％酒精浸洗2次(每次约30秒，至切片不再脱色为止)，稍水洗；

(6)加入1滴(100μl)橙黄g染液(试剂d)染色10秒，稍水洗；

(7)95％酒精脱水5min；

(8)无水酒精脱水5min；

(9)二甲苯透明5min，封片；

采用nikoneclipse90i显微镜观察，弹力纤维呈蓝紫色，背景呈不同程度黄色。弹力板内侧为新生内膜部分。

结果显示，bapn诱导后，小鼠tad模型在2周后已经出现内皮损伤，而在三周时候虽然已出现夹层，但是大体上仍无明显变化。我们对比大体情况，弹力蛋白和内皮损伤后发现，相比于前者，内皮损伤出现最早也最灵敏(图1)，提示我们关注内皮下结构，从而为早期诊断提供潜在靶点。

ii.通过免疫荧光染色染色观察血管壁结构，具体如下：

1.检测不同胶原的管壁定位：

(1)冰冻切片pbs中洗去oct；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，pbs洗3遍。

(3)血清封闭30min

(4)一抗固定，过夜。

(coli，兔，1：500，图2上，左1)

(coliii，兔，1：500，图2上，左2)

(coliv，兔，1：500，图2上，左3)

(ec，大鼠，1：500，图2上全部)

(5)室温平衡30min，pbs洗三遍。

(6)二抗40min，pbs洗三遍。

(抗兔，红色，1：1000)

(抗大鼠，绿色，1：1000)

(7)dapi封片。

(8)显微镜下观察标本形态。

2.检测造模不同时期coliv表达量的变化：

(1)冰冻切片pbs中洗去oct；

(2)4％的多聚甲醛固定10min，pbs洗3遍。

(3)血清封闭30min

(4)一抗固定，过夜。

(coliv，兔，1：500，图2中)

(a-sma,，鼠，1：500，图2中)

(5)室温平衡30min，pbs洗三遍。

(6)二抗40min，pbs洗三遍。

(抗兔，绿色，1：1000)

(抗鼠，红色，1：1000)

(7)dapi封片。

(8)显微镜下观察标本形态。

3.天狼星红(siriusred)苦味酸染色，辅助定位各型胶原

(1)石蜡切片厚4～6μm，脱蜡至水。

(2)入天青石蓝液5～10min。

(3)蒸馏水冲洗3次。

(4)天狼星红饱和苦味酸液15～30min；(可用harris苏木素液淡染细胞核)。

(5)直接用无水乙醇分化与脱水。

(6)二甲苯透明、光学树胶封固。

偏振光显微镜下观察：

ⅰ型胶原纤维：红色或黄色，排列紧密，具强双折光性。

ⅱ型胶原纤维：多种色彩，疏松网状、弱双折光性。

ⅲ型胶原纤维：绿色、细纤维、弱双折光性。

ⅳ型胶原纤维：淡黄色、弱双折光性(基膜成分)。

结果显示，相比于其他两种血管中含量丰富的胶原(coli，coliii)，coliv特异性定位于血管内皮下基底膜，是血管损伤后第一层暴露的部分，可以在极早期发现动脉损伤；此外，在sham,bapn1w,2w,3w,4w这几个时间点分别对coliv进行染色发现，coliv内皮下表达量随着模型时间而逐渐增加(图2)，以上证明coliv可以作为早期胸主动脉夹层/主动脉瘤的分子靶点。

实施例4、四型胶原靶向材料c4tca的构建

为进一步在活体的情况下检测早期胸主动脉夹层/主动脉瘤，使用mri核磁标记物进一步标记coliv-rhb，合成c4tca，所述的c4tca的合成步骤为：

(1)取12.7mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化过的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(dota)，即nhs-dota溶解于1ml的去离子水中，向其中加入8mg的碳酸氢钠，室温磁力搅拌10-20分钟，使其羧基充分盐化。

(2)取9.4mg的六水合氯化钆溶解于200μl的去离子水中，将所得的溶液缓慢的滴加入实例4(1)的溶液中，室温磁力搅拌12小时，使其充分络合。

(3)取20mg的罗丹明b修饰的四型胶原的靶向多肽(rhb-coliv)在避光的环境下溶解于800μl的水中，将所得的溶液加入实例4(2)最终得到的溶液里，避光环境下室温磁力搅拌12小时，所得的混合液通过1000mw的透析膜超滤提纯，最终溶液通过冻干的方式得到红色絮状固体c4tca，所有的后处理全程避光。

实施例5、靶向材料c4tca在mri在体条件和病理切片下早期诊断主动脉瘤

使用如上所述bapn喂水2周小鼠进行试验。

1)将小鼠气麻下眶静脉注射实施例4制备的c4tca材料1.5mg。

2)静置30min，使材料充分经过血液循环后再次进行气麻

3)接入心电、呼吸门控，放入7tmri仪器

4)使用tise序列对于整段主动秒弓降部，腹主动脉肾上部进行断层扫描。

5)将小鼠血管病变部分提取并制成冰冻切片，晾干后直接dapi封片，镜下观察材料荧

光并与mri结果比对分析，确定mri信号增强部分是否确实出现病生理改变。

结果显示，在动脉瘤模型第14天，部分小鼠出现主动脉弓降部信号增强，而在病理切片下正是此时血管确实出现内皮损伤；而那些并未出现信号增强的血管并未看到内皮/中层病生理改变(图3)，说明基于coliv为靶点的mri、荧光双探针c4tca可以在早期特异性发现内皮损伤，从而监测tad的发生。

实施例6、coliv-gb在mri在体条件下早期诊断主动脉瘤

使用如上所述bapn喂水2周小鼠进行试验。

1)将小鼠气麻下眶静脉注射实施例4制备的coliv-gb材料1.3mg。

2)静置30min，使材料充分经过血液循环后再次进行气麻

3)接入心电、呼吸门控，放入7tmri仪器

4)使用tise序列对于整段主动秒弓降部，腹主动脉肾上部进行断层扫描。

结果显示，针对同样的小鼠bapn模型在单独使用coliv-gb时，在在体mri诊断条件下，能够取得和c4tca相似的诊断结果，表明coliv-gb和c4tca一样，也能够在早期特异性发现内皮损伤，从而监测tad的发生。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，不用做对本发明保护范围的限定。

sequencelisting

<110>北京市心肺血管疾病研究所

<120>四型胶原作为靶点在早期诊断主动脉瘤/夹层中的应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>prt

<213>coliv-peptide

<400>1

cysglyglyglylysproleuvaltrpleulys

1510