主动脉瘤的标志物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及血管疾病的诊断和治疗领域，具体涉及了一种主动脉瘤的标志物以及用于辅助诊断主动脉瘤的试剂盒。相对于健康人对照组，主动脉瘤病人血清中miR663a含量明显升高。且miR663a与发病时间存在相关性，发病时间越短，miR663a含量越高。因此miR663a可作为主动脉瘤标志物，用于辅助诊断主动脉瘤。本发明所述主动脉瘤辅助诊断的试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于临床辅助诊断主动脉瘤，为临床医生快速准确掌握患者病情及评价治疗效果奠定基础。
【专利说明】
主动脉瘤的标志物
技术领域
[0001] 本发明设及血管疾病的诊断和治疗领域，具体设及一种新的主动脉瘤标志物W及 用于辅助诊断主动脉瘤的发生的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 主动脉瘤(aorticaneurysm)，是指主动脉壁局部或弥漫性的异常扩张，压迫周围 器官而引起症状，瘤状破裂为其主要危险。常发生在升主动脉主动脉弓、胸部降主动脉、胸 腹主动脉和腹主动脉。主动脉瘤发病缓慢，早期多无症状和体征，至后期由于动脉瘤压迫周 围组织而产生症状，其临床表现由于动脉瘤的大小、形状、部位和生长方向而有不同。如主 动脉瘤压迫气管和支气管可引起咳嗽、气急、肺炎和肺不张，压迫食管引起吞咽困难，压迫 喉返神经引起声音嘶哑。压迫隔神经引起隔肌麻搏，压迫上腔静脉和头臂静脉可引起上肢 及颈部、面部、上胸部浮肿，压迫胸骨可引起胸痛。传统的主动脉瘤的检查方法主要为胸、腹 部X线照像、超声波、CT血管造影(CTA)和磁共振血管造影(MRA)检查、动脉造影等。
[0003] 近年来随着免疫学和分子生物学技术的发展而提出的一类与细胞生长增殖有关 的物质-生物标记物(biomarker)。它可W标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能 的改变或可能发生的改变的生化指标，生物标记物不仅可从分子水平探讨发病机制，而且 在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警，很大程度 上为临床医生提供了辅助诊断的依据。
[0004] 目前，最常用的主动脉瘤生物标志物是D-二聚体化-dimer),特别是急性主动脉夹 层，灵敏度可高达99%。如果D-dimer不升高，几乎可排除主动脉夹层的可能性。然而特异度 很低，肺栓塞和冠状动脉血栓形成等状态下，D-dimer也会升高。并且，D-dimer的升高发生 在夹层发生之后，并不能作为预测使用。此外，C反应蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、肌巧蛋白 等也都作为临床辅助诊断主动脉瘤的生物标志物，但灵敏度和特异度都并不高，仍然需要 进一步深入研究探讨。
[0005] 大量研究表明，很多miRNA参与了主动脉瘤的病理过程。但还不清楚如何利用 miRNA快速准确诊断主动脉瘤，及其在主动脉瘤发生中的预测作用。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的问题，提供一种新的主动脉瘤的标志 物W及用于辅助诊断主动脉瘤的试剂盒。
[0007] 在一些实施方案中，本发明收集临床样本，检测健康人和主动脉瘤血清中的miRNA (microRNA)含量，分析差异表达的miRNA在各不同特征人群（性别、危险因素、病情严重程 度、疾病进展程度等）中表达量与该特征之间的相关性。结果显示miR663a表达差异最大，相 对于健康人对照组，主动脉瘤病人血清中miR663a含量明显升高。且miR663a与发病时间存 在相关性，发病时间越短，miR663a含量越高。
[000引因此本发明提供了miR663a在制备主动脉瘤标志物中的应用。
[0009] 本发明所述应用中所述主动脉瘤的受检样品可W采用本领域技术人员公知的任 何一种样品，包括但不限于血液、唾液、尿液。优选的，所述主动脉瘤的受检样品为血清或血 浆。
[0010] 本发明还提供了 miR663a在制备主动脉瘤辅助诊断试剂盒中的应用。
[0011] 本发明还提供了一种主动脉瘤辅助诊断的试剂盒，包括miR663a的引物。 [0012]作为优选，所述11111?663曰的引物序列如沈9 10齡.1和沈9 10齡.2所示。
[OOU]在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。如逆转录 酶、Taq酶、dNTPs、MgCl 2、DEPC水和缓冲液等。
[0014] 进一步的，在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括对照品和标准品。
[0015] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种主动脉瘤的标志物W及用于辅助诊断主 动脉瘤的试剂盒。相对于健康人对照组，主动脉瘤病人血清中miR663a含量明显升高。且 miR663a与发病时间存在相关性，发病时间越短，miR663a含量越高。因此miR663a可作为主 动脉瘤标志物，用于辅助诊断主动脉瘤。本发明所述主动脉瘤辅助诊断的试剂盒可W快速、 灵敏、特异的用于临床辅助诊断主动脉瘤，为临床医生快速准确掌握患者病情及评价治疗 效果奠定基础。
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0017] 图1示实施例1主动脉瘤病人和健康人miR663a表达量的t检测结果图；
[001引图2示实施例1主动脉瘤病人和健康人miR663a表达量的ROC曲线图；
[0019] 图3示实施例2急、慢性主动脉瘤病人miR663a表达量的t检测结果图；
[0020] 图4示实施例2不同病程的主动脉瘤病人miR663a表达量的线性相关分析结果图。
【具体实施方式】
[0021] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0022] 实施例1、
[0023] 1、收集主动脉瘤病人和健康人血清，于-80°C保存
[0024] 2、匹配性别和年龄，挑选37例健康人做对照，主动脉瘤病人50例；
[0025] 3、使用QIAGEN公司的microRNA提取试剂盒，按照说明书提取血清中的microRNA， 送至公司，使用液态忍片检测microRNA表达量。分别采用两独立样本t检验和ROC曲线的统 计学方法进行检测。
[00%]结果显示，其中miR663a表达差异最大，相对于健康人对照组，主动脉瘤病人血清 中miR663a含量明显升高(表1、图1和图2)。健康人对照组平均表达量为-0.051，主动脉瘤组 平均表达量为2.624,且受试者曲线下面积(Area = O. 879)最优。表明血清中miR663a含量与 主动脉瘤有关。
[0029]
[0030] 实施例2、
[0031] 将实施例1所述主动脉瘤病人按照急慢性进行分组，分组依据如下:慢性为无症状 或症状出现超过2周，急性为急性起病且病程在2周内。分析miR663a表达量，两独立样本t检 验进行统计，结果见(表2、图3)。
[0032] 表2主动脉瘤病人按照急慢性分组miR663a表达情况
[0033]
[0034]
[00对结果发现，相较于对照组或慢性组，急性起病组miR663a表达量更高，差异具有统 计学意义。
[0036] 进一步将实施例1所述主动脉瘤病人病程细分为如下几组:发病时间超过5年，1-5 年，2个月-1年，1个月-2个月，7天-1个月，1-7天，小于1天。分析miR663a表达量，采用线性相 关分析，结果见(表3、图4)。
[0037] 表3丰动脉漓病人按照发病时间分组miR663a表试信况 [00；3 引
[0039]
[0040] 结果发现，miR663a与发病时间存在相关性，即发病时间越短，miR663a含量越高。 [0041 ] 上述结果表明miR663a与主动脉瘤急慢性起病相关。
[0042] 实施例3、主动脉瘤检测试剂盒
[0043] 包括miR663a上游引物（SEQ ID No.l)和miR663a下游引物（SEQ ID No.2)，Taq DNA 聚合酶，MgCbSYBRGreen 等。
[0044] 实施例4、主动脉瘤检测方法
[0045] 1、使用血清/血浆miRNA提取试剂盒提取miRNA，具体操作为：
[0046] (1)血清/血浆+加入裂解液(血清/血浆:裂解液=1:5)，室溫提取5min;
[0047] (2)加入 3. 对照内参，miR39;
[004引（3)加入氯仿(血清/血浆:氯仿=1:1)，振荡15s，室溫放置3min;
[0049] (4) 12000g，4°C离屯、15min，上清转移至新的收集管，加入1.5倍体积的无水乙醇， 混匀；
[0050] (5)吸取7(K)化混合液加入新的收集管后，^SOOOg室溫离屯、15s，剩余液体重复此 步；
[0化1] (6)加入700化洗脱液RWT，^SOOOg室溫离屯、15s;
[0化2] (7)加入500化洗脱液RPE，^SOOOg室溫离屯、15s;
[0化3] (8)加入50化L80 %乙醇，^ SOOOg室溫离屯、2min; (9)换新的收集管，开盖全速离屯、 Smin ；
[0054] (10)换新的收集管，加入1化L无RNA酶的水，全速离屯、Imin;
[0055] (11 )Nano化OP测样品浓度，RNA样品可置于-20 r长期保存；
[0056] 2、RT-PCR 检测 miR663a 表达。
[0057] (1 )miRNA反转录:使用miRNA反转试剂盒，对包含miRNA的总RNA进行逆转录；
[0〇5 引（2)RT-PCR:利用 SYBR Green 和 miR663a 特异性引物（SEQ ID No.l 和 SEQ ID 齡.2)检测11111?66：3曰的表达。
【主权项】
1. miR663a在制备主动脉瘤标志物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述主动脉瘤的受检样品为血清或血浆。 3 .miR663a在制备主动脉瘤辅助诊断试剂盒中的应用。4. 一种主动脉瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包括miR663a的引物。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述miR663a的引物序列如SEQ ID No. 1 和SEQ ID No.2所示。6. 根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应常用的酶和试剂。
【文档编号】C12Q1/68GK105925705SQ201610424000
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】杜杰, 李玉琳, 刘璐鑫
【申请人】北京市心肺血管疾病研究所