专利名称：：一种检测马凡综合症的试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种产前诊断马凡综合症的方法，特别是一种利用多重聚合酶链式反应(PCR)和单碱基延伸反应的马凡综合症的产前诊断方法，还涉及一种用于本发明诊断方法的试剂盒。
背景技术：
：马凡综合症(Marfansyndrome;MFS)是最常见的遗传性结缔组织疾病之一，主要累及骨骼、眼部和心血管系统。其临床特征为躯体异常，如体格细高，四肢及指(趾)细长，被称为蜘蛛样指(趾)；眼部晶状体脱位；关节松弛；心脏大血管病变，如主动脉根及升主动脉瘤样扩张以及急性或慢性主动脉内膜破裂，形成夹层动脉瘤。另外，还有硬脑脊膜扩张、高腭弓、漏斗胸或鸡胸以及肺和神经系统畸形等一系列综合征象。但是，这一综合症的临床表现也可以是不完全显性的，如缺少心脏大血管的典型表现者，常被称为隐性马凡综合症。马凡综合症是一种常染色体显性遗传性疾病，人群发病率大约为1/10000，按此比例推算，中国有马凡综合症病例13万之多。马凡综合症多有家族史，约15%25%为散发病例，在种族和性别上，发病没有明显差异。马凡综合症患者的父母中有75%可诊断出患有该病，马凡综合症患者子女的发生率约为50%。当父母均不是患者的情况下，如果第一个子女是马凡综合症患者，那么他们再生育一小孩时，由于存在种群镶嵌现象，该小孩的发病率会高于人群的平均水平。据报道，有1/3的马凡综合症患者死于32岁以前，2/3死于50岁左右，其平均年龄仅40岁；其死亡的主要原因绝大多数是心血管病变造成的。最常见的症状是主动脉瘤破裂、心包压塞或主动脉瓣关闭不全和二尖瓣脱垂而致的心力衰竭或心肌缺血。为了能在孕早期或孕中期对异常儿做出诊断，及时治疗或处理。目前，可以进行产前诊断的疾病类型主要有染色体病(300多种)，X连锁遗传病(70余种)，先天性代谢缺陷病(新生儿先天性代谢病的发生率约8%。)和先天畸形。其中，染色体异常的遗传病，比如唐氏综合症，特纳综合症等，一般表现为染色体片段的重复和缺失，以及染色体的非整倍性(如多一条额外的染色体，如唐氏综合症者多一条额外的21号染色体，故亦称为21三体综合症)。通过多种方法对染色体染色，可以检测出以上染色体缺陷。目前这些方法已经应用于临床，通过检测胎儿是否带有异常染色体来迸行优生，为患染色体遗传病的家系带去了福音，也大大减轻了社会的经济负担。然而，对于马凡综合症，其基因缺陷是在碱基水平的，表现为碱基的点突变，无义突变，剪接位点突变，终止密码子的突变等，用染色体的方法是无法达到检测目的的。而常规的产前B超检査也难以发现胎儿的异常，这给优生带来了很大的挑战。一个患儿的出生不仅给家庭，还给社会带来了沉重的负担。因此，寻找一种检测马凡综合症的试剂盒具有重要的意义。国内外目前也还未见切实有效制备该试剂盒的方法的报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服上述
背景技术：
的不足，提供一种操作简便、设备简单、结果准确度高的检测马凡综合症的试剂盒；同时，本发明还提供一种利用多重聚合酶链式反应(PCR)和单碱基延伸反应制备该试剂盒的方法。本发明采用的技术方案是-一种检测马凡综合症的试剂盒，其特征在于包括特异性引物、多重PCR反应扩增液、洁净液、单碱基延伸反应液，所述的特异性引物包括每条含18-25个碱基的六对或六对以上多重PCR扩增引物和与检测位点相匹配的含40—45个碱基的突变检测引物，其中突变检测引物由5'端的地址序列和3'端的突变检测区组所述的多重PCR引物序列如下1、TTTTTGTTTTAGACCCAATGTCT，GACAATACACTGATTTCCGCC;2、AAATAACTACAGATCMCTCCTGTGAG，TTTCTGGCATAGACACTGATCG;3、TGGCTGTCTCAATGGAGG，ATTTTAAAMCCATTACCTCTTTCAC;4、TTGATTTTAGACATTGATGAGTGTT，CGCATTACACACGCMTGAAA;5、TMTAAGTGCCTTTCTCTGCCA，GGGAAGCATTCACATCTGTAG;6、AAGATTCTGCCTGATGCTTTT，TATCTCCATTGTCTCCTCGAG。所述的突变检测引物如下1、GGATCATGTTATAATGCTTACTGTT;2、TTTTCAAGTACMCACTGCMTATT;3、GTGTGTGGCCCCAAATCGATGTGCA;4、GAATGGCCGGATATGCAATMTGGA;5、AACCCCTGGGATCTGCATGAATGGG;6、TGTTTGTATATGGTAAATAGATACC。所述的多重PCR反应扩增液由lx的多重PCR缓冲液，5mM的氯化镁溶液，75uM的单脱氧核苷三磷酸(其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度均为75uM)，每种多重PCR引物各50nM，胎儿基因组DNA2ng/5ul，金牌DNA聚合酶0.1U/ixl构成，最后用分子生物学级别的水配至5ul体系；所述的洁净液由单碱基延伸反应的洁净酶和与其配套lx的工作液组成(为美国GEHealthcare公司产品，货号78260);所述的单碱基延伸反应液包括单碱基延伸反应缓冲液3.76u1,5uM的突变检测引物0.06n1，2.5mM的荧光标记的双脱氧核苷三磷酸对(ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP)0.2yl，分子生物学级别水2.96ul和单碱基延伸反应的DNA聚合酶O.02ti1。所述的检测马凡综合症的试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)从有胎细胞的样品中分离胎细胞并提取胎细胞的基因组DNA;2)设计六对或六对以上多重PCR引物和突变检测引物；3)先用六对或六对以上多重PCR引物，以胎细胞DNA为模板，多重PCR扩增得到六组或六组以上的待检测序列，再用已设计好的突变检测引物对待检测序列进行单碱基延伸反应，使突变检测引物的末端加入一个用于检测的荧光标记碱基；4)将单碱基延伸反应产物杂交至芯片后，进行双通道扫描检测分析，检测单碱基延伸反应延伸的碱基。所述的多重PCR扩增反应是用六对或六对以上PCR引物配成多重PCR反应扩增液后在PCR仪上进行的，其中扩增反应液包括由lx的多重PCR缓冲液，5mM的氯化镁溶液，75uM的单脱氧核苷三磷酸(其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度均为75uM)，每种多重PCR引物各50nM,胎儿基因组DNA2ng/5u1，金牌■聚合酶0.1U/p1构成，最后用分子生物学级别的水配至5y1体系。所述的多重PCR反应，由下列步骤构成9步骤温度时间第一步94。C1min第二步94。C30s第三步55°C30s第四步72°C1min第五步返回第二步，重复39次第六步保持反应温度为4°C所述的扩增后的待检测序列还需进行洁净反应，该洁净反应是将单碱基延伸反应的洁净酶加入多重PCR的扩增产物中。所述的单碱基延伸反应是用突变检测引物配成单碱基延伸反应液后在PCR仪上进行，其中单碱基延伸反应液包括单碱基延伸反应缓冲液3.76u1，5uM的突变检测引物0.06ul，2.5mM的荧光标记的双脱氧核苷三磷酸对(ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP)0.2ii1，分子生物学级别水2.96iU和单碱基延伸反应的DNA聚合酶0.02n1，最后得到15u1的单碱基延伸反应体系。所述的单碱基延伸反应，由下列步骤构成:步骤温度时间第一步96°C3min第二步94°C20s第三步40°Clis第四步返回第二步，重复45次第五步保持反应温度为4°C所述的多重PCR的扩增产物在用突变检测引物単碱基延伸反应后杂交至芯片，包括-a、芯片杂交前洗板用稀释好的1号杂交洗液(美国BeckmanCoulter公司试剂盒，货号A16997)清洗384孔的芯片板孔2次；b、芯片杂交将杂交液(美国BeckmanCoulter公司试剂盒，货号A16997)和杂交添加剂(美国BeckmanCoulter公司试剂盒，货号A16997)溶液以18:l混合配制成杂交液后，与单碱基延伸反应体系混合，混匀后取10pl加入已预洗的384孔芯片板相应的孔中，将板置于保湿环境中42r杂交2小时；c、芯片杂交后洗板用稀释好的2号杂交洗液(美国BeckmanCoulter公司试剂盒，货号A16997)清洗384孔的芯片板孔。所述的含有胎细胞的样品选自血液、尿液、组织样品和羊水。本实用新型的有益效果是该检测马凡综合症的试剂盒具有操作简便、结果准确度高的特点，能在孕早期或孕中期对患有马凡综合症的异常儿做出诊断，从而达到及时治疗或处理。该试剂盒应用于临床，通过检测胎儿是否带有基因突变来进行优生，减轻了社会的经济负担。同时，本发明所提供一种利用多重聚合酶链式反应(PCR)和单碱基延伸反应制备该试剂盒的方法，该方法具高通量和操作简单的特点。图1为本发明中从有胎细胞的样品中分离胎细胞并提取胎细胞的基因组DNA的方法。图2为本发明利用双通道荧光扫描显色及计算机整合来检查基因突变的原理图。图3为本发明通过双通道扫描荧光显色及计算机整合来检测待检测样本实例图。具体实施例方式下述具体实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。本实施例中使用了下列试剂1、胎儿基因组DNA提取通用基因组DNA提取试剂盒(由宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)提供，货号DV811A)。2、PCR试剂引物(由上海英骏生物工程有限公司合成)含六对扩增引物(序列见序列表)，扩增出待测序列；金牌DNA聚合酶(为美国AppliedBiosystem公司产品)；10xPCR缓冲液(为美国AppliedBiosystem公司产品)；氯化镁(为美国AppliedBiosystem公司产品)；分子生物学级别水(为美国Invitrogen公司产品)；96孔PCR反应板(为美国Corning公司产品)。3、PCR产物洁净单碱基延伸反应的洁净酶(为美国GEHealthcare公司产品，货号78260);4、单碱基延伸反应试剂引物(由上海英骏生物工程有限公司合成)六条突变检测引物(序列见序列表)；单碱基延伸反应的DNA聚合酶(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997);带有不同荧光基团的双脱氧核苷三磷酸对(ddATP和ddGTP(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号10104400);ddATP和ddCTP(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号10104600);ddATP和ddTTP(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号:10104800);ddGTP和ddCTP(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号10106600);ddGTP和ddTTP(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号10106500);ddCTP和ddTTP(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号10104500);缓冲液(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997);分子生物学级别水(为美国Invitrogen公司产品)。5、基因芯片杂交杂交试剂盒(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997);384孔的芯片板(为美国BeckmanCoulter公司产品)。—种检测马凡综合症的试剂盒，包括特异性引物、多重PCR反应扩增液、洁净液、单碱基延伸反应液、杂交缓冲液，所述的特异性引物包括每条含18-25个碱基的六对或六对以上PCR扩增引物和与检测位点相匹配的含40—45个碱基的突变检测引物，其中突变检测引物由5'端的地址序列和3'端的突变检测区组成。12所述的PCR引物序列如下-1、TTTTTGTTTTAGACCCAATGTCT，GACMTACACTGATTTCCGCC;2、AAATAACTACAGATCAACTCCTGTGAG，TTTCTGGCATAGACACTGATCG;3、TGGCTGTCTCAATGGAGG，ATTTT楊AACCATTACCTCTTTCAC;4、TTGATTTTAGACATTGATGAGTGTT，CGCATTACACACGCAATGMA;5、TAATAAGTGCCTTTCTCTGCCA，GGGAAGCATTCACATCTGTAG;6、AAGATTCTGCCTGATGCTTTT,TATCTCCATTGTCTCCTCGAG。所述的突变检测引物如下-1、GGATCATGTTATAATGCTTACTGTT;2、TTTTCAAGTACAACACTGCAATATT;3、GTGTGTGGCCCCAAATCGATGTGCA;4、GAATGGCCGGATATGCAATMTGGA;5、AACCCCTGGGATCTGCATGAATGGG;6、TGTTTGTATATGGTAMTAGATACC。上述的用于检测马凡综合症的试剂盒的制备方法，包括以下步骤1、从有胎细胞的样品中分离胎细胞并提取胎细胞的基因组DNA;(1)用常规腹壁穿刺的方法获取羊水5—10ml(—般选择在孕满15周以后实施穿刺)；(2)取2ml羊水放入容量为2ml的离心管内，离心(转速为10，000rpm)20秒。倒掉上清液；(3)用Takara公司的通用基因组DNA提取试剂盒(UniversalGenomicDNAExtractionKit货号DV811A)从离心沉淀出来的胎儿脱落细胞内提取胎儿DNA;具体步骤如下a.在2ml离心管内加入150ix1的灭菌蒸馏水悬浮细胞；b.加入500n1溶液A和0.8nl的RNA酶A1，激烈振荡15秒钟，然后室温静置1分钟；c.加入4001的溶液B，振荡混合；cl.加入lml的4"预冷的溶液C，充分混匀后，12000rpm离心2分钟；e.弃去上层有机相，再加入lml的4'C预冷的溶液C，充分混匀后，12000rpm离心2分钟；f.弃去上层有机相，然后将水相溶液(无色下层)转移至收集管上的滤过杯中，12000rpm离心1分钟；(注有机相(上层)带有颜色，务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上，上下层间的沉淀不必考虑，在过滤时将被除去)g.弃滤过杯，在滤液中加入400lU的DB缓冲液，混合均匀；h.将试剂盒中的旋转柱安置在收集管上，将上述操作g混合液转移至旋转柱中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；i.将500Pl冲洗液A加入至旋转柱中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液；j.将700ul冲洗液B加入至旋转柱中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液；(注沿管壁四周加入冲洗液B，这样有助于完全冲洗粘附于管壁上的盐分)k.重复操作步骤j;1、将旋转柱安置于新的1.5ml的离心管上，在旋转柱膜的中央加入50200Ul的灭菌蒸馏水或者洗脱液，室温静置l分钟；(注把灭菌蒸馏水或者洗脱液加热至65。C使用时有利于提高洗脱效率)12000rpm离心1分钟洗脱DNA即可得到胎儿的DNA溶液。(4)如果标本不马上使用，放置在一2(TC冰箱中保存。2、设计六对多重PCR引物和相应的突变检测引物；根据待检测突变位点及其相关序列，用Autoprimer软件(http:〃www.autoprimer.com/)设计相关的六对多重PCR引物及其相应的突变检测引物，该引物的合成由上海英骏生物工程有限公司完成，需要时可按需求情况进行购买。3、用上述设计好的六对多重PCR引物，以胎细胞DNA为模板，多重PCR扩增得到六组待检测序列，具体步骤为用六对或六对以上PCR引物配成多重PCR反应扩增液后在PCR仪上进行的，其中扩增反应液包括由1x的多重PCR缓冲液，5mM的氯化镁溶液，75uM的单脱氧核苷三磷酸(其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度均为75uM)，每种多重PCR引物各50nM，胎儿基因组DNA2ng/5u1，金牌DNA聚合酶0.1U/nl构成，最后用分子生物学级别的水配至5ul体系。分别加至96孔板的反应样孔中。多重PCR引物扩增反应，包括以下6步第一步将PCR仪的温度调至94匸，反应l分钟；第二步保持PCR仪内温度为94'C，再反应30秒；第三步将PCR仪的温度调至55'C，反应30秒；第四步将PCR仪的温度调至72t:，反应l分钟；第五步返回到第二步，重复进行39次；第六步保持PCR仪内温度为4"C。反应结束后，取出PCR产物板，离心(1000rpmlmin)，至于冰上。4、扩增后的待检测序列进行洁净反应，该洁净反应是将单碱基延伸反应的洁净酶加入六组或六组以上经扩增的PCR产物中。具体操作方法是将美国GEHealthcare公司出售的SBE酶试剂用配套的稀释液稀释成1x的工作液，在每个5n1的96孔板的反应样孔中加3u1工作液，混匀，重新封膜，在MJ-225PCR仪上执行下述程序第一步将MJ-225PCR仪的温度调至37r，反应30分钟；第二步将MJ-225PCR仪的温度调至96。C，再反应10分钟；第三步保持MJ-225PCR仪内温度为4°C。5、用已设计好的突变检测引物对待检测序列进行单碱基延伸反应，使突变检测引物的末端加入一个荧光标记的碱基。该单碱基延伸反应的具体操作方法是用分子生物学级别水溶解突变检测引物，配成每种突变检测引物各5uM浓度的混合液。按照反应的样本数配制下述反应体系(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997):在上述每孔8u1的体系中加入每孔7n1的单碱基延伸反应液，混匀。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>单碱基延伸的DNA聚合酶0.02U1总和7li1按照下述步骤在MJ—225PCR仪上进行延伸反应:第一步将MJ—225PCR仪的温度调至96。C，反应3分钟；第二步保持MJ—225PCR仪内温度为94t:，再反应20秒；第三步将MJ—225PCR仪的温度调至40。C，反应11秒；第四步返回到第二步，重复进行45次；第五步保持PCR仪内温度为4"C。5、将上述的六组待检测序列在用突变检测引物単碱基延伸后杂交至芯片，该芯片杂交反应包括如下步骤a、芯片杂交前洗板用双蒸水将l号杂交洗液(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997)稀释成lx的工作液，倒入加样槽，用排枪从加样槽中取10ul加入384孔的芯片板孔中，手指轻轻叩打板的边缘，使洗液充分覆盖整个孔底面积。板上覆盖一张无尘纸巾，倒置放入离心机中，1000rpm离心l分钟去除洗液。此步骤再重复两次。b、芯片杂交将杂交液(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997)和杂交添加剂(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997)溶液以18:l混合配制成杂交液后，在上述15ul的单碱基延伸反应体系混合，混匀后取10y1加入已预洗的384孔芯片板相应的孔中，将板置于保湿环境中42。C杂交2小时；C、芯片杂交后洗板杂交好的芯片板上覆盖一张无尘纸巾，倒置放入离心机中，1000rpm1分钟离心去除杂交反应溶液。将2号杂交洗液(为美国BeckmanCoulter公司产品，货号A16997)稀释成lx的工作液，倒入加样槽，用排枪从加样槽中取10til加入384孔的芯片板孔中，手指轻轻叩打板的边缘，使洗液充分覆盖整个孔底面积。板上覆盖一张无尘纸巾，倒置放入离心机中，1000rpm离心1分钟去除洗液。此步骤再重复两次。6、数据扫描及分析(1)用甲醇洁净384芯片板的背面玻璃。将板放入SNPstream仪器(为美国BeckmanCoulter公司产品)进行数据双通道扫描及分析，检测单碱基延伸反应延伸的荧光标记碱基。双通道扫描的机理是将12框的384芯片置于SNPstream仪器上，分别用两种不同的荧光进行扫描，得到两个显色结果。再用计算机对两个通道的扫描结果进行整合，得到一个最终的显色图。其中若待测标本在两个通道的荧光扫描中出现两种不同的颜色，便可判断待测标本的单碱基延伸产物为杂合子，即待检测标本存在基因突变。(2)芯片验证我们选用了6个病人样本和6个正常人的标本，对基因芯片进行了验证。经过图纸分析纯合子只在单个通道(通道1)显色；而杂合子可在两个通道显色。1号位置为双通道均显色的双阳性对照(杂合子)，4号位置为通道1显色的单阳性对照(纯合子)；13号位置为通道2显色的阳性对照(纯合子)，16号位为双通道均不显色的阴性对照。2号位、5号位，7号位，9号位，ll号位，14号位均为检出突变的杂合子样本；3号位，6号位，8号位，IO号位，12号位，15号位均为正常个体对照，显示纯合子。用基因芯片的方法，6个突变样本在双通道均有不同显色，提示为杂合子。样本全部被检出(检出率为6/6);而正常的样本均只在单通道显色，也全部被检出(检出率为6/6)。序列表SEQUENCELISTING<110><120><130><160><170><210><211><212><213>浙江大学医学院附属第二医院一种检测马凡综合症的试剂盒及其制备方法18Patentlnversion3.323DNAHomosapiens<400>1tttttgttttagaccca3tgtct23<210>2<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>2ggatc3tgttataatgcttsctgtt25<210>3<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>3gacaatacactgatttccgcc21<210>4<211>27<212>DNA<213>Homosapiens<400>4ssiataactacagatcaatctcctgtgag27<210>5<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>5ttttcasgtaicsacsctgcaatatt<210>6<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>6tttctggcatagacactgateg<210>7<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<400>7tggctgtctcaatggagg<210〉8<211〉25<212〉DNA<213>Homosapiens<400>8gtgtgtggccccaaatcgatgtgca<210>9<211>26<212>DNA<213>Homosapiens<400>9attttaasasccattscctctttcsc<210>10<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>10ttgattttagacattgatgagtgtt<210>11<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>11gastggccggststgcsatastgga25<210>12<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>12cgcsttac3cacgcaatgss321<210>13<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>13taataagtgcctttctctgcca22<210>14<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>14aacccctgggstctgcatgaatggg25<210>15<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>15ggg3sgcsttC3cstctgt3g21<210>16<211>21<212>DNA<213>Homosapiens21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>权利要求1、一种检测马凡综合症的试剂盒，其特征在于包括特异性引物、多重PCR反应扩增液、洁净液、单碱基延伸反应液，所述的特异性引物包括每条含18-25个碱基的六对或六对以上多重PCR扩增引物和与检测位点相匹配的含40—45个碱基的突变检测引物，其中突变检测引物由5’端的地址序列和3’端的突变检测区组成。2、根据权利要求1所述的检测马凡综合症的试剂盒，其特征在于所述的多重PCR引物序列如下-1、TTTTTGTTTTAGACCCAATGTCT，GACAATACACTGATTTCCGCC;2、AAATAACTACAGATCMCTCCTGTGAG，TTTCTGGCATAGACACTGATCG;3、TGGCTGTCTCAATGGAGG，ATTTTAAAAACCATTACCTCTTTCAC;4、TTGATTTTAGACATTGATGAGTGTT，CGCATTACACACGCAATGAAA;5、TAATAAGTGCCTTTCTCTGCCA，GGGAAGCATTCACATCTGTAG;6、AAGATTCTGCCTGATGCTTTT，TATCTCCATTGTCTCCTCGAG;所述的突变检测引物如下1、GGATCATGTTATAATGCTTACTGTT;2、TTTTCAAGTACMCACTGCMTATT;3、GTGTGTGGCCCCAAATCGATGTGCA;4、GAATGGCCGGATATGCMTAATGGA;5、AACCCCTGGGATCTGCATGAATGGG;6、TGTTTGTATATGGTAAATAGATACC。3、根据权利要求2所述的检测马凡综合症的试剂盒，其特征在于所述的多重PCR反应扩增液由lx的多重PCR缓冲液，5mM的氯化镁溶液，75uM的单脱氧核苷三磷酸，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度均为75uM，每种多重PCR引物各50nM，胎儿基因组DNA2ng/5ti1，金牌DNA聚合酶0.1U/ul构成，最后用分子生物学级别的水配至5Pl体系；所述的洁净液由单碱基延伸反应的洁净酶和与其配套lx的工作液组成；所述的单碱基延伸反应液包括单碱基延伸反应缓冲液3.76"1，5uM的突变检测引物0.06ul，2.5mM的荧光标记的双脱氧核苷三磷酸对，其中ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP各0.2ixl，分子生物学级别水2.96ixl和单碱基延伸反应的DNA聚合酶O.02u1。4、制备权利要求1所述的检测马凡综合症的试剂盒的方法，包括以下步骤:1)从有胎细胞的样品中分离胎细胞并提取胎细胞的基因组DNA;2)设计六对或六对以上多重PCR引物和突变检测引物；3)先用六对或六对以上多重PCR引物，以胎细胞DNA为模板，多重PCR扩增得到六组或六组以上的待检测序列，再用已设计好的突变检测引物对待检测序列进行单碱基延伸反应，使突变检测引物的末端加入一个用于检测的荧光标记碱基；4)将单碱基延伸反应产物杂交至芯片后，进行双通道扫描检测分析，检测单碱基延伸反应延伸的碱基。5、制备权利要求4所述的检测马凡综合症的试剂盒的方法，包括以下步骤:所述的多重PCR扩增反应是用六对或六对以上PCR引物配成多重PCR反应扩增液后在PCR仪上进行的，其中扩增反应液包括由lx的多重PCR缓冲液，5mM的氯化镁溶液，75uM的单脱氧核苷三磷酸，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度均为75uM，每种多重PCR引物各50nM，胎儿基因组DNA2ng/5u1，金牌DNA聚合酶0.1U/u1构成，最后用分子生物学级别的水配至5y1体系。6、制备权利要求5所述的检测马凡综合症的试剂盒的方法，包括以下步骤:所述的多重PCR反应，由下列步骤构成步骤温度时间第一步94。C1min第二步94°C30s第三步55。C30s第四步72。C1min第五步返回第二步，重复39次第六步保持反应温度为4°C7、制备权利要求6所述的检测马凡综合症的试剂盒的方法，包括以下步骤:所述的扩增后的待检测序列还需进行洁净反应，该洁净反应是将单碱基延伸反应的洁净酶加入多重PCR的扩增产物中。8、制备权利要求7所述的检测马凡综合症的试剂盒的方法，包括以下步骤:所述的单碱基延伸反应是用突变检测引物配成单碱基延伸反应液后在PCR仪上进行，其中单碱基延伸反应液包括单碱基延伸反应缓冲液3.76yl，5uM的突变检测引物0.06iU，2.5mM的荧光标记的双脱氧核苷三磷酸对，其中ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP各0.2tU，分子生物学级别水2.96ii1和单碱基延伸反应的DNA聚合酶0.02iU，最后得到15iil的单碱基延伸反应体系。9、制备权利要求8所述的检测马凡综合症的试剂盒的方法，包括以下步骤:所述的单碱基延伸反应，由下列步骤构成:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>10、制备权利要求9所述的检测马凡综合症的试剂盒的方法，包括以下步骤所述的多重PCR的扩增产物在用突变检测引物単碱基延伸反应后杂交至芯片，包括-a、芯片杂交前洗板用稀释好的1号杂交洗液清洗384孔的芯片板孔2次;b、芯片杂交将杂交液和杂交添加剂溶液以18:1混合配制成杂交液后，与单碱基延伸反应体系混合，混匀后取10u1加入已预洗的384孔芯片板相应的孔中，将板置于保湿环境中42'C杂交2小时；c、芯片杂交后洗板用稀释好的2号杂交洗液清洗384孔的芯片板孔。全文摘要本发明涉及一种产前诊断马凡综合症的方法，具体是利用多重聚合酶链式反应(PCR)和单碱基延伸反应的马凡综合症的产前诊断方法，还涉及一种用于本发明诊断方法的试剂盒。本发明提供一种操作简便、设备简单、结果准确度高的检测马凡综合症的试剂盒和制备该试剂盒的方法。技术方案是一种检测马凡综合症的试剂盒，其特征在于包括特异性引物、多重PCR反应扩增液、洁净液、单碱基延伸反应液，所述的特异性引物包括每条含18-25个碱基的六对或六对以上多重PCR扩增引物和与检测位点相匹配的含40-45个碱基的突变检测引物，其中突变检测引物由5’端的地址序列和3’端的突变检测区组成。文档编号C12Q1/68GK101481743SQ20091009556公开日2009年7月15日申请日期2009年1月22日优先权日2009年1月22日发明者克姚,孙朝晖,金冲飞申请人:浙江大学医学院附属第二医院