专利名称：抗菌肽pmap-23单克隆抗体的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗菌肽PMAP-23单克隆抗体的制备方法，以及用这种单克隆抗体建立ELISA检测方法。
背景技术：
由于天然抗菌肽分子量小，含量低，直接提取纯化的产品纯度很低，而且成本昂贵，因此高纯度的抗菌肽免疫原难以获得，市场上缺乏抗菌肽的特异性单克隆抗体，导致对生物体内抗菌肽表达水平的研究停留在基因转录水平，难以进行翻译水平的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种单克隆抗体的制备方法，采用该方法能获得大量的特异性单克隆抗体。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种单克隆抗体的制备方法用化学合成的抗菌肽PMAP-23氨基酸片段免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗猪抗菌肽PMAP-23单克隆抗体的杂交瘤株，最终得到所需抗体。
作为本发明的单克隆抗体的制备方法的改进该抗菌肽PMAP-23的氨基酸片段为Arg-Ile-Ile-Asp-Leu-Leu-Trp-Arg-Val-Arg-Arg-Pro-Gln-Lys-Pro-Lys-Phe-Val-Thr-Val-Trp-Val-Arg。
本发明还提供了上述方法制备的单克隆抗体的用途，用于建立酶联免疫吸附剂测定法，检测乳铁蛋白对骨髓细胞分泌PMAP-23水平的影响。
本发明以人工合成的猪抗菌肽PMAP-23氨基酸片段作为免疫原，应用杂交瘤技术成功制备了抗PMAP-23的单克隆抗体，并应用制备的单克隆抗体建立酶联免疫吸附实验。此外，还可以应用制备的抗菌肽单克隆抗体建立亲和层析法，为抗菌肽的分离纯化提供了新的方法，解决了传统分离纯化方法存在的问题。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。
图1是本发明的抗菌肽PMAP-23单克隆抗体效价图； 图2是乳铁蛋白对猪抗菌肽PMAP-23基因表达的影响图。
具体实施例方式 实施例1、人工免疫原的制备 人工合成含有猪抗菌肽PMAP-23氨基酸残基的片段Arg-Ile-Ile-Asp-Leu-Leu-Trp-Arg-Val-Arg-Arg-Pro-Gln-Lys-Pro-Lys-Phe-Val-Thr-Val-Trp-Val-Arg。用碳化二亚胺(EDC)法制备免疫原PMAP-23-OVA，全波长紫外/可见光扫描分光光度计法测定偶联后PMAP-23-OVA的蛋白浓度后，分装保存于-20℃。采用同样的方法制备人工包被原PMAP-23-BSA，分装保存于-20℃。
取8-12周龄健康雌性Balb/c纯系小鼠，采用两次基础免疫和一次加强免疫的方案，直接腹腔注射进行免疫。第1天用100μl PMAP-23-OVA+100μl福氏完全佐剂进行基础免疫，第16天用100μl PMPA-23-OVA+100μl福氏不完全佐剂进行第二次基础免疫，第31天直接给小鼠腹腔注射200-250μl的PMAP-23-OVA进行加强免疫；第34天将免疫的Balb/c小鼠摘除眼球取血，收集血清作为阳性对照，放入-20℃冰箱保存备用。
颈部脱臼处死放血后的Balb/c小鼠，75％乙醇消毒后放入超净工作台取出脾脏，剪成小块，用组织研磨器制备脾细胞悬液，补加适量RPMI-1640培养液静置3-5min后，洗细胞两次，1000rpm离心5min，在用HAT培养液重悬细胞后，计数备用。
融合前两周，取出冻存于液氮中的Sp2/0骨髓瘤细胞用20％胎牛血清的RPMI1640培养液复苏培养，长成单层后传代；在准备融合的前三天更换为含20％胎牛血清的RPMI1640培养液，保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。融合前，制备成骨髓瘤细胞悬液，用RPMI1640培养液洗涤两次，1000rpm离心5min，悬浮于RPMI1640培养液中，计数备用。
将制备的脾细胞与骨髓瘤细胞按照10:1的细胞数量比例混合于50ml离心管内，0.5ml的50％PEG作为融合剂进行细胞融合。取少量HAT培养液将细胞小心吹散，然后加入96孔细胞培养板，放入37℃5％CO2培养箱中培养。一般一只小鼠免疫脾细胞能接种10块以上的96孔板。融合细胞培养3天后，用HAT培养液换掉1/2旧培养液，经过HAT培养基的选择作用，最终只有杂交瘤细胞能够生存并不断繁殖。7-10天后确认骨髓瘤细胞全部死亡后渐次换成HT培养液，以后视克隆生长情况更换新的HT培养液。
当杂交瘤细胞生长占孔底面积1/4、细胞生长良好时，建立间接ELISA方法，检测上清液中的抗体，筛选出抗PMAP-23的阳性孔。用人工包被原PMAP-23-BSA包被酶标反应板，100μl/孔，4℃包被过夜。PBST洗涤3次后用1-5％脱脂奶粉封闭，150μl/孔，37℃孵育0.5-1h。PBST洗涤1次后加入待测孔培养上清，100μl/孔，37℃孵育1-2h。PBST洗涤3次后加入检测抗体辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃孵育1-2h。PBST洗涤4次后用OPD-H2O2底物显色，10-20min后用2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪读取490nm的OD值，与阴性对照孔490nm的OD值比值大于2.1的为阳性。
通过上述方法筛选出的阳性上清含有PMAP-23氨基酸片段的特异性抗体，进一步采用天然抗菌肽PMAP-23的抑制性ELISA实验验证该阳性上清能否与PMAP-23发生特异性结合反应。猪骨髓细胞培养上清中含有天然抗菌肽PMAP-23，以骨髓细胞培养上清为抑制对象，用制备的阳性上清建立抑制性ELISA，检测阳性上清与骨髓细胞培养上清中PMAP-23的反应情况。通过穿刺从30日龄仔猪股骨抽取30ml骨髓置于RPMI1640培养液(含10％胎牛血清)中，用枪头抽吸使骨髓细胞分离为单个细胞，然后平铺于等量比重为1.077g/mL的淋巴细胞分离液上，2000rpm离心30min后，取粒细胞层到一新离心管中，用RPMI1640培养液洗涤两次以去除分离液，重新悬浮即得到骨髓粒细胞悬液。把所获细胞以5×106个/ml接种于六孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中培养48小时后，将培养孔内的细胞培养液12000rpm离心5min，上清液即为所需的猪骨髓细胞培养上清，分装冻存于-20℃冰箱备用。
用PMAP-23-BSA以每孔100μl定量包被酶标板，4℃孵育过夜；PBST洗涤后用脱脂奶粉封闭，37℃孵育0.5-1h；PBST洗涤1次后，每孔加入50μl骨髓细胞培养上清(对照孔加等量的PBS)，同时每孔加入50μl特异性阳性上清，37℃孵育1-2h，PBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1-2h；PBST洗涤后用OPD-H2O2底物显色，10-20min后用2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪读取490nm的OD值。与对照孔比较，如果试验孔的颜色深度较对照孔浅，则表明所制备的特异性阳性上清含有骨髓细胞培养上清中天然抗菌肽PMAP-23的特异性抗体。
实施例2、阳性杂交瘤细胞的克隆 用巴氏消毒管轻轻吹打要克隆的目标孔细胞，制备细胞悬液，在96孔细胞培养板中制备系列倍比细胞悬液，每孔0.2ml，细胞沉淀2-3h，倒置显微镜下挑选有合适细胞数目的孔。第一次克隆挑80-100个细胞/孔，第二次克隆挑60-80个细胞/孔。将所挑孔中的细胞转移到细胞培养瓶中，然后加入10ml HT培养液，0.1ml/孔接种96孔细胞培养板，即每孔约平均含有1个细胞。克隆9-10天后挑选单细胞克隆系，进行阳性检测，获得的阳性克隆孔进一步做第二次克隆、第三次克隆，直至克隆化后检测上清的阳性率为100％且反应程度基本一致时停止克隆。挑选形态良好，抗体活性较高的细胞克隆进行扩大培养，收集对数生长期的阳性克隆孔杂交瘤细胞，用新鲜HT培养液调整细胞密度为1×106个/ml以上，程序化冻存获得的单克隆杂交瘤细胞系。
本发明单克隆抗体的检测方法及结果如下 1、人工合成抗原的浓度。全波长紫外-可见光扫描分光光度计法测得人工免疫原PMAP-23-OVA、人工包被原PMAP-23-BSA的蛋白浓度分别为1.67mg/ml，1.81mg/ml。
2、细胞融合率。免疫的Balb/C小鼠脾细胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞在50％PEG下融合，融合后的细胞共接种了7块96孔细胞培养板。用HAT培养基筛选，7块培养板的细胞融合率均在85％以上。
3、PR-11阳性孔的筛选。以人工合成包被原PMAP-23-BSA包被酶标板，建立间接ELISA，筛选出四个抗PMAP-23的阳性孔。1A6、2E4、3C1、7E7四个孔内细胞产生的上清液与PMAP-23-BSA的反应呈阳性，初步断定这四个孔内细胞分泌人工合成肽段PMAP-23的抗体。
4、与骨髓细胞培养上清的抑制试验。应用四个阳性孔中1A6、2E4、3C1、7E7的细胞上清液，以骨髓细胞培养上清作为抑制对象，建立抑制性ELISA，检测阳性上清与骨髓细胞培养上清中PMAP-23的反应。反应内容具体如表1所示 表1、与骨髓细胞培养上清的抑制性反应 结果表明，骨髓细胞培养上清中的PMAP-23与包被原PMAP-23-BSA发生了明显的竞争性抑制反应，由此可见，阳性孔1A6、2E4、3C1、7E7内细胞所分泌的抗体为天然猪抗菌肽PMAP-23的抗体。
5、制备单抗腹水。将天然抗菌肽PMAP-23的两株阳性最强的细胞株2E4、3C1采用有限稀释法进行多次克隆化，直至阳性率为100％，即为阳性单细胞克隆系。得到的阳性单克隆细胞一部分冻存备用，一部分扩大培养用于单抗腹水制备。取8周龄左右Balb/c小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷7-10天后，将扩大培养的杂交瘤细胞用生理盐水悬浮，每只小鼠腹腔注射5-10×105个杂交瘤细胞。接种杂交瘤细胞后7-12天，小鼠腹部明显膨大时用无菌注射器针头抽取腹水。每只小鼠1次可抽取腹水5-10ml，间隔2-3天待腹水再生积聚后可同法再取2-3次；混合收集的腹水，置离心管中3000rpm离心20min后收集上清，即得到高效价的单克隆抗体腹水。
6、单克隆抗体腹水纯化。采用辛酸-硫酸铵盐析法纯化获得的腹水，可得到纯度达98％以上的单克隆抗体，分装冻存。
7、单克隆抗体浓度的测定。分别取少量经提纯后的抗体2E4、3C1，稀释100倍，用全波长紫外/可见光扫描分光光度计测定蛋白浓度。结果表明，制得的单克隆抗体2E4、3C1的质量浓度分别为14.46mg/ml和10.16mg/ml。
8、单克隆抗体效价测定。利用制备的单克隆抗体2E4和3C1，以PMAP-23-BSA作为包被原，建立间接ELISA，检测两株单抗腹水的效价，两种单抗腹水分别做1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000……稀释。将抗原PMAP-BSA按100μl/孔包被酶标板，4℃过夜；PBST洗涤后用脱脂奶粉封闭，37℃孵育0.5-1h；PBST洗涤后将单克隆抗体做倍比稀释加入包被孔，100μl/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤后加入稀释5000-8000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤后OPD-H2O2底物显色，10-20min后2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪读取490nm的OD值，以与阴性490nm的OD值比值大于2.1时的最大稀释倍数为阳性单克隆抗体的效价。测定内容如表2所示，测定结果如图1所示，2E4、3C1两株单克隆抗体在稀释8.192×105、4.096×105倍时，OD值均为阴性对照的2.1倍以上(阴性对照OD值分别为0.029、0.024)，因此效价均高于14.096×105，其中2E4的效价最高。单克隆抗体2E4在4.096×105～8.192×105倍稀释的范围内，OD值变化最显著；3C1在2.048×105～4.096×105倍稀释的范围内，OD值变化最显著，由此确定2E4、3C1分别稀释4.1×105和2.5×105倍为最佳检测浓度。
表2、腹水效价的测定 9、单克隆抗体亚类鉴定。将纯化的单克隆抗体与Sigma公司的标准抗Balb/c小鼠IgG、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体，做双向琼脂扩散试验以鉴定单克隆抗体类型及亚类。配制1％的琼脂，制备成琼脂平板，用孔径3mm-4mm的打孔器打梅花孔，孔距为4mm；在中央孔中滴加标准抗Balb/c小鼠IgG1抗体，其他六孔分别滴加适当稀释的纯化单抗腹水3H5、5H7，标准抗Balb/C小鼠IgM、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体。将琼脂平板在37℃培养箱中保湿培养，18h-20h取出观察沉淀线，判断单克隆抗体的类型及亚类。结果表明，两个细胞株分别分泌的单克隆抗体均只与IgG和IgG1的羊抗鼠标准抗血清反应，而不与其它的标准蛋白亚类发生反应，在单克隆抗体与标准蛋白IgG和IgG1亚类之间形成白色的沉淀线，即它们均为IgG类型并为IgG1亚类。
10、单克隆抗体特异性检验。抗菌肽CecropinP1与PR-39均是在猪体内发现的抗菌肽，其中PR-11是PR-39的活性中心。碳化二亚胺(EDC)法制备人工包被原CecropinP1-BSA和PR-11-BSA；用CecropinP1-BSA、PR-11-BSA包被酶标板，建立间接ELISA，检测所制备的单克隆抗体2E4、3C1与抗菌肽CecropinP1-BSA、PR-11-BSA是否有交叉反应，即对2E4、3C1进行特异性检验。分别将适量人工包被原CecropinP1-BSA和PR-11-BSA用包被液稀释，100μl/孔，4℃孵育过夜。PBST洗涤后用脱脂奶粉封闭，150μl/孔，37℃孵育0.5-1h；PBST洗涤后分别将所制备的单克隆抗体2E4、3C1按最佳检测浓度加入包被孔，100μl/孔，每组3个重复，37℃孵育1-2h；PBST洗涤后加入稀释5000-8000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃孵育1-2h；PBST洗涤后加入OPD-H2O2底物显色，10-20min后用2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪读取490nm的OD值，或直接肉眼观察2E4、3C1与上述两种包被原的反应现象。单克隆抗体特异性检验内容如表3所示，所制备的单克隆抗体2E4、3C1仅与PMAP-23发生特异性反应，而与CecropinP1、PR-11无交叉反应。说明所制得的单克隆抗体2E4、3C1对抗菌肽PMAP-23具有很强的特异性。
表3、单克隆抗体特异性检验 以上实验结果表明，本发明的两种单克隆抗体2E4、3C1的质量浓度分别为14.46mg/ml和10.16mg/ml；效价均在105以上；2E4、3C1的最佳测定浓度分别为稀释4.1×105和2.5×105倍；两株单克隆杂交瘤细胞产生的抗体均为IgG类型并为IgG1亚类。
实施例3、PMAP-23单克隆抗体的应用建立抑制性ELISA实验方法，检测乳铁蛋白对骨髓细胞分泌PMAP-23水平的影响 猪骨髓细胞培养上清中含有天然抗菌肽PMAP-23，以骨髓细胞培养上清为抑制对象，用制备的阳性上清建立抑制性ELISA，检测乳铁蛋白对骨髓细胞培养上清中PMAP-23水平的影响。通过穿刺从30日龄仔猪股骨抽取30ml骨髓置于RPMI 1640培养液(含10％胎牛血清)中，用枪头抽吸使骨髓细胞分离为单个细胞，然后平铺于等量比重为1.077g/mL的淋巴细胞分离液上，2000rpm离心30min后，取粒细胞层到一新离心管中，用RPMI1640培养液洗涤两次以去除分离液，重新悬浮即得到骨髓粒细胞悬液。把所获细胞以5×106个/ml接种于六孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中培养48小时后，换为无血清培养液，向试验孔中分别加入乳铁蛋白，使乳铁蛋白的终浓度分别为10μg/ml、100μg/ml和1000μg/ml。空白对照孔用等量的培养液代替，继续培养3小时和6小时，每孔设3个重复；在相应的时间点收集培养孔内的细胞，12000r/min离心5min取上清液，即为所需的猪骨髓细胞培养上清，冻存于-20℃冰箱备用。
用PMAP-23-BSA定量包被酶标反应板，100μl/孔，4℃过夜；PBST洗涤3次后用1-5％脱脂奶粉封闭，150μl/孔，37℃孵育0.5～1h；PBST洗涤1次后，将上述所得的骨髓细胞培养上清样品依次加入对应孔中，50μl/孔；同时加入抗猪抗菌肽PMAP-23的特异性单克隆抗体2E4(稀释2×106倍)，50μl/孔，37℃孵育1～2h；PBST洗涤3次后加入稀释5000～8000倍的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，100μl/孔，37℃孵育1～2h；PBST洗涤4次后用OPD-H2O2底物显色，10～20min后用2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪读取OD490值。检测结果如图2所示不同浓度乳铁蛋白处理的猪骨髓细胞分别培养3h、6h后，随着乳铁蛋白浓度的增加，骨髓细胞培养上清中抗菌肽PMAP-23的含量有所升高，当添加1000μg/ml乳铁蛋白时，抗菌肽PMAP-23的表达量显著升高(P<0.05)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO权利要求
1、抗菌肽PMAP-23单克隆抗体的制备方法，其特征在于用化学合成的抗菌肽PMAP-23的氨基酸片段免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗猪抗菌肽PMAP-23单克隆抗体的杂交瘤株，最终得到所需抗体。
2、根据权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征是所述抗菌肽PMAP-23的氨基酸片段为Arg-Ile-Ile-Asp-Leu-Leu-Trp-Arg-Val-Arg-Arg-Pro-Gln-Lys-Pro-Lys-Phe-Val-Thr-Val-Trp-Val-Arg。
3、如权利要求1所述方法制备的单克隆抗体的用途，其特征在于用于建立酶联免疫吸附剂测定法，检测乳铁蛋白对骨髓细胞分泌PMAP-23水平的影响。
全文摘要
本发明公开了一种抗菌肽PMAP-23单克隆抗体的制备方法，用化学合成的抗菌肽PMAP-23的氨基酸片段免疫Balb/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗猪抗菌肽PMAP-23单克隆抗体的杂交瘤株，最终得到所需抗体。本发明的单克隆抗体可用于建立酶联免疫吸附剂测定法，检测乳铁蛋白对骨髓细胞分泌PMAP-23水平的影响。
文档编号C12P21/08GK101481724SQ200910095498
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者汪以真, 刘倚帆, 单体中, 佳 郭, 张艳芳, 高彦华, 王爱苹 申请人:浙江大学