本发明涉及一种基于mgb探针的qpcr进行虎物种特异性鉴定的方法，涉及分子生物学领域。本发明检测方法特异性好、灵敏度高、重复性好。
背景技术：
虎(pantheratigris)被列入cites附录i，为我国一级保护动物。虎文化是中华文明不可或缺的一部分。中国传统医学认为虎骨具有祛风通络、强筋健骨的功效。由于虎制品的药用价值和对于虎的文化崇拜，中国成为世界上虎制品消费最主要的国家之一。中国在1993年宣布全面禁止虎贸易，但是在巨大经济利益的驱动下，虎制品和仿冒的假虎皮、虎骨、虎牙、虎爪、虎鞭等的非法贸易屡禁不止。另外，野外保护中，时常发现疑似虎毛、虎粪等需要鉴别。所以，迫切需要一种虎物种特异的、高效、准确的检测方法。
传统的虎制品分子检测手段，一般为普通pcr或结合测序，需要获得较长的有效dna片段，但是由于大多数虎制品中dna降解和片段化较为严重，经常难以提取出有效的dna，无法扩增出满足测序分析的长序列。与此同时，随着现代造假技术的发展，传统的形态学鉴定变得更加困难。
实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)是一种在dna聚合酶链式反应(pcr)中，以荧光化学物质检测每次扩增循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中特定dna序列进行定性定量分析。该方法通过荧光信号的分析，对pcr进程进行实时检测。探针法是qpcr中一种常见方法，在反应体系中加入化学修饰的寡聚核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，无法检测到荧光信号。而当pcr扩增时，taq酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物的形成完全同步。mgb探针是在传统taqman水解探针基础上的改进，通过在探针的3’端加入mgb基团，从而提高探针的退火温度，缩短探针的长度，提高探针的特异性和灵敏度。
本发明建立了一种对疑似虎制品的虎物种特异性的实时荧光定量pcr检测方法，利用mgb探针，能够高效、准确和更快速的检测疑似虎制品的真伪。cytb基因是目前国内外广泛认可的用于物种鉴别的dna序列，本发明针对cytb基因设计引物和mgb探针。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是设计针对虎的引物和探针。
本发明的第二个目的是为了克服现有分子生物学检测技术的不足之处，建立一种使用方便、快捷、准确的虎制品真伪鉴别的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
1、dna的提取体系
样品的dna提取参照axygen动物基因组提取试剂盒说明书进行，取20mg虎的肌肉组织以及动物制品的样品，放置于2ml离心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea，用剪刀温和的剪碎组织30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将dna制备管至于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心一分钟。将dna制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的tris-hcl洗脱液100μl洗脱、制备管中dna，-20℃冷冻备用。
2、引物和探针的设计
选取genbank上已发表的虎(af053019)线粒体cytb序列，利用blast进行比对后，选择物种特异的dna序列，利用abiprimerexpress3.0设计引物与mgb探针，primer6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。
引物和探针设计结果：
3、本发明中qpcr检测方法的建立
在taq-hsprobeqpcrpremix的基础上，建立20μl反应体系，其中上下游引物和mgb探针的量从0.3μl到1.5μl，以0.1μl为梯度递加。反应体系中加入模板2μl其余用水补足。根据荧光定量pcr的结果，选择最大的荧光增量和最好的曲线走势作为判定标准，选择引物和探针的最适量。
最佳反应体系：
pcr反应程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
判图原则：ct值小于等于30并有明显扩增曲线判为阳性；ct值大于等于35判为阴性；ct值介于30～35之间判为可疑，重复实验，如果实验结果相同且拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
4、本发明中qpcr特异性实验
利用虎引物和探针，分别加入东北虎、孟加拉虎、华南虎、印支虎、非洲狮、白狮、金钱豹、雪豹、漠猫、猞猁、豹猫、家猫、水牛、狗、骆驼、棕熊、黑熊、马来熊、马鹿、小灵猫、梅花鹿、塔里木兔、家猪、野猪、绵羊、狐狸、羊驼的dna模板进行特异性实验，反应体系按照荧光定量pcr检测方法所确定的最佳反应体系建立。
5、本发明中qpcr灵敏度实验
将虎dna提取液原液按照10倍的梯度倍比稀释，得到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的dna溶液。用本发明中设计的虎引物和探针进行检测。
6、重复性实验
将虎dna模板按照5倍比例进行倍比稀释。利用虎引物和探针，针对虎dna原液和稀释液每个浓度点进行重复检测，用于验证各浓度下的重复性。同时计算回判率。
7、盲测实验
随机准备10份样品，其中一份为虎的样品，而另外9份为其它物种样品。对此10份样品进行盲测实验，通过该盲测试验对本方法的有效性进行检验。
附图说明
图1为虎引物探针的特异性实验结果
图2为虎梯度灵敏度实验
图3为虎各浓度点重复性实验结果
图4盲测实验
具体实施方式
实施例1
疑似虎鞭的检测
1、dna的提取体系
取疑似虎鞭20mg，放置于2ml离心管中，加入350μlpbs和0.9μlrnasea，用剪刀温和剪碎组织30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶k，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将dna制备管至于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，离心一分钟。将dna制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的tris-hcl洗脱液100μl洗脱制备管中dna，-20℃冷冻备用。
2、体系和程序
对于待测样品，用20μl含有虎探针引物的反应体系进行检测分析。
20μl反应体系：
pcr反应程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
判图原则：ct值小于等于30并有明显扩增曲线判为阳性；ct值大于等于35判为阴性；ct值介于30～35之间判为可疑，重复实验，如果实验结果相同且拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
结果表明，疑似虎制品的dna提取液，经过qpcr扩增，出现明显的虎扩增曲线。检测结果显示，本方法对于虎制品真伪的检测结果是准确、可靠、有效的。
基于探针法qpcr的虎物种特异性检测方法
序列表
1
24
dna
人工序列
1
ggctcctacaccttctcagaaaca
2
21
dna
人工序列
2
ggctgtagccatgaccgtaaa
3
15
dna
人工序列
3
cgggattgtgctatt