本发明涉及蛋白修饰检测的技术领域，更具体地，涉及一种用于检测组蛋白豆蔻酰化修饰的重组蛋白及其应用。
背景技术：
组蛋白是染色体的重要组成部分。组蛋白会经历100多种不同的翻译后修饰，比如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和糖基化。这些翻译后修饰是调控染色体的结构和功能的重要方式，对发育、代谢、疾病等众多生理过程均起到关键的调控作用。研究这些组蛋白修饰具有重要意义，系统地定位这些组蛋白修饰已成为众多国际性大课题的焦点。这些组蛋白修饰在基因组范围的定位需要借助针对这些组蛋白修饰的特异性抗体。赖氨酸侧链具有两种特性：电荷丰富和亲核性，适合翻译后修饰与不同的亲电底物以共价键结合。赖氨酸上可发生很多翻译后修饰，如甲基化，乙酰化，生物素化，泛素化，豆蔻酰化和sumo化修饰等，这些修饰在细胞生理和病理中有重要作用。
组蛋白上的赖氨酸可被如甲基化，乙酰化，泛素化，sumo化、核糖体化和豆蔻酰化修饰等。其中，豆蔻酰化也称十四酰化，采用豆蔻酸作为酰基进行的酰化作用，在基因转录和调节中具有重要的生物学功能。
目前，针对组蛋白不同位点赖氨酸上的豆蔻酰化，通常购买商业化的抗组蛋白特定修饰位点的多抗，但是经动物免疫获得的抗体价格昂贵，批次质量不稳定，容易发生交叉反应，满足特定位点修饰的抗体制备周期很长，产量低，严重制约了对组蛋白豆蔻酰化修饰的高通量检测。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题是针对组蛋白豆蔻酰化修饰位点的商业化抗体价格昂贵，各批次质量不稳定，交叉反应明显，特定位点修饰的抗体制备周期长，产量低。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述问题，本发明提供了一种重组蛋白，重组蛋白的氨基酸序列包括优化PHD结构域序列，其中，优化PHD结构域序列为：
a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
b)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的重组蛋白包含优化PHD结构域序列SEQ ID NO.1片段，在不影响其活性的前提下，本发明的重组蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与含有优化PHD序列的重组蛋白同等活性的由优化PHD序列衍生得到的蛋白质。
本发明通过区段优化的方法优化PHD1-PHD2结构域，利用大肠杆菌Origami2DE3重组表达和纯化含有PHD结构域的重组蛋白，得到含优化PHD结构域序列的重组蛋白，该重组蛋白包含了N端多聚组氨酸标签，提高对H3K14cr亲和力。为了得到亲和力更佳的重组蛋白，优化的PHD结构域序列选自DPF2。
在本发明一个优选实施方式中，为了得到质量稳定的重组蛋白，重组蛋白的氨基酸序列还包括融合蛋白标签的氨基酸序列。
在本发明一个实施方式中，融合蛋白标签优选为HA标签、Myc标签或FLAG标签。
在本发明一个优选实施方式中，可以利用大肠杆菌Origami2DE3重组表达和纯化含有PHD结构域的重组蛋白，该重组蛋白包含了N端多聚组氨酸标签，中间的SUMO融合蛋白，随后的PHD双结构域和C端的HA标签(Myc标签或FLAG标签可选)，即HIS8-SUMO-PHD-HA，HIS8-SUMO-PHD-Myc或HIS8-SUMO-PHD-FLAG，在实验室规模即可方便的纯化得到大量的，质量稳定的重组蛋白。
在本发明一个优选实施方式中，重组蛋白的氨基酸序列为：
a)SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或
b)SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的重组蛋白包含优化PHD结构域序列SEQ ID NO.3(HIS8-SUMO-PHD-HA)、SEQ ID No.4(HIS8-SUMO-PHD-Myc)或SEQ ID No.5(HIS8-SUMO-PHD-FLAG)片段，在不影响其活性的前提下，本发明的重组蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与上述含有优化PHD序列的重组蛋白同等活性的由上述含有优化PHD序列的片段衍生得到的蛋白质。
本发明涉及的SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5重组蛋白还分别包括了不同的免疫检测标签，方便了对后续抗体使用的兼容性，即只要含有上述3种通用标签抗体之中的任何一个，都可以完整地实现检测实验。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了编码上述重组蛋白的基因。
在本发明一个优选实施方式中，上述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了提供含有上述基因的重组表达载体，可以方便转化大肠杆菌宿主细胞，进行重组蛋白的表达。在本发明一个实施方式中，可以为载体pET28a,来源于Novagen公司。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有上述表达载体的宿主细胞。在本发明中，可以使用商业化菌株，如BL21(DE3),OrigamiB(DE3)等含DE3溶源的大肠杆菌。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，包括：
1)首先全基因优化合成HIS8-SUMO-PHD-HA核苷酸序列，翻译的氨基酸序列与SEQ ID No.3所示序列保持一致；合成的基因克隆到pUC57载体中；
2)分别合成2对引物,以Myc序列或FLAG序列替换HA标签序列，分别获得含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5基因序列的pUC57载体；
3)含SEQ ID No.3或4或5的核苷酸序列通过酶切，亚克隆到pET28a载体或同等效果的pET系列载体中，筛选得到正确的重组载体，分别可以编码SEQ ID No.3或4或5所示的氨基酸序列；
4)以步骤3)获得的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21DE3或其它DE3溶源的大肠杆菌,可以得到该重组蛋白的可溶性表达；
5)依据步骤4)，从1L液体LB诱导表达的发酵液中获得约30mgSEQ ID No.3或4或5氨基酸序列一致的重组蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有上述重组蛋白的检测试剂盒。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了使用上述重组蛋白在检测组蛋白位点豆蔻酰化修饰中的应用。
更选地是，组蛋白位点为组蛋白H3中14位赖氨酸的位点。
在本发明的实施方式中，组蛋白可以取自人、鼠、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、狗、猫、果蝇、线虫和酵母等细胞中。
在该应用中，使用上述重组蛋白与抗免疫标签通用抗体以及HRP标记的羊抗鼠IgG多抗，经过结合和信号放大，可得到高灵敏度的检测效果。
其中，根据SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5所述的重组蛋白特征，在蛋白免疫印记检测中，分别使用抗免疫标签HA或Myc或FLAG通用抗体。
在该应用中，以SEQ ID No.3所述的重组蛋白为例，检测方法具体为：
1)提取待检测蛋白质，并将其转移至硝酸纤维膜(NC)上，封闭，TBST洗涤；
2)使用PBS稀释后的重组蛋白(HIS8-SUMO-PHD-HA)孵育，加入小鼠抗HA单抗和带HRP的羊抗鼠IgG多抗孵育，观察免疫印迹结果。
其中，在检测方法的步骤1)中，通常为组织或细胞的细胞核蛋白质，提取后，先在15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，再将其转移至NC膜上。
在本发明一个优选实施方式中，检测方法的步骤2)具体为：
21)使用SEQ ID No.2制备的重组蛋白孵育NC膜,,37℃孵育,使用TBST和TBS依次洗涤；
22)加入小鼠抗HA单抗,37℃孵育,使用TBST和TBS依次洗涤；
23)加入带HRP的羊抗鼠IgG多抗孵育，加入TMB或ECL底物液，暗室反应或曝光，观察免疫印迹结果。
本发明提出的重组蛋白含有优化PHD结构域，可以提高对H3K14cr的特异性，同时，将上述优化PHD结构域与融合蛋白标签结合，在实验室规模可得到大量、特异性强且质量稳定的重组蛋白。另外，利用大肠杆菌表达系统制备重组蛋白的成本低，一次研发理论上可以无数次重复生产，容易实现标准化工艺和规模化生产，从而保证批次间同质性好，质量稳定。
使用商业化抗体时，每100次样品实验使用同样的抗体，在保证实验成功的基础上平均消耗100ug抗体，平均成本为4500元，在成千上万次的检测中，这样的抗体价格就十分昂贵。而使用PHD结构域作为替代抗体，在一个制备周期内，每毫克重组蛋白生产的平均成本不超过150元，加上使用通用抗体的市场价格,每100ug为500元，可以预期检测成本至少降低5倍。因此将上述重组蛋白替代商业化抗体，实验检测成本将显著降低。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
实施例1
重组蛋白HIS8-SUMO-PHD-HA、HIS8-SUMO-PHD-Myc、HIS8-SUMO-PHD-FLAG的制备
1)首先全基因优化合成HIS8-SUMO-PHD-HA核苷酸序列，翻译的氨基酸序列与SEQ ID No.3所示序列保持一致，合成的基因克隆到pUC57载体中，基因两端的限制性酶切位点为NcoI和XhoI。(pUC57为通用克隆载体；
2)分别合成2对引物,以Myc序列或FLAG序列替换HA标签序列，以含有SEQ ID No.1基因序列的pUC57载体为模版,PCR扩增，DpnI消化母本质粒,转化大肠杆菌感受态细胞,经测序验证,分别获得含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5基因序列的pUC57载体。翻译的氨基酸序列与SEQ ID No.4或5所示氨基酸序列保持一致；
3)以NcoI和XhoI双酶切含SEQ ID No.3或4或5基因序列的pUC57载体,回收对应的基因序列,HIS8-SUMO-PHD-HA(Myc或FLAG),亚克隆到同样双酶切以及回收后的pET28a载体中，筛选得到正确的重组载体，分别可以编码SEQ ID No.3或4或5所示的氨基酸序列；
4)以步骤3)获得的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21DE3或其它DE3溶源的大肠杆菌,单克隆菌株活化到5ml LB液体培养基中，置于37度恒温摇床中，220rpm振荡培养当菌液OD600＝0.6时，加入0.2-0.5mM IPTG,0.1mM ZnCl2，恒温16-25摄氏度诱导10h到15h,可以得到该重组蛋白的可溶性表达；
5)依据步骤4)，从1L液体LB诱导表达的发酵液中获得约30mg SEQ ID No.3或4或5氨基酸序列一致的重组蛋白。
实施例2
重组蛋白的特异性检测
ITC仪器设备：The titration was performed using MicroCal iTC200 system(GE Healthcare)
实验方法参考仪器使用说明和标准设置。
主要步骤：确定合适的反应物浓度，准备样品；滴定，收集热量数据；校正数据，拟合回归，计算热力学参数，最后分析模型。
1)所有检测样本置于恒温25℃反应。
2)合成待测的多肽10mg，使用ITC基础缓冲液溶解。母液浓度为0.5mg/ml；其中，多肽序列源于H3K14cr，为组蛋白H3第14位赖氨酸上豆蔻酰化修饰；
其中，稀释溶液：20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.5；多肽工作浓度1-1.5mM；
3)重组蛋白浓度调整为0.5mg/ml，使用上述缓冲液稀释，工作浓度0.05-0.08mM；
4)收集反应的热量数据，最终结果由Origin7拟合计算，解离常数Kd值为28.4nM。
通过ITC实验，SEQ ID No.3所述的重组蛋白，对模拟多肽的亲和常数Kd值为28.4nM。相比公开文献中，源于DPF2蛋白的PHD结构域，其Kd值为85nM，因此优化后的PHD结构域对模拟多肽的特异性提高了3倍，特异性得到了明显的提高；在实际应用中，可以减少重组蛋白的使用量或反应孵育时间。
实施例3
重组蛋白HIS8-SUMO-PHD-HA(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)的蛋白免疫印迹WB(Western Blot)检测，以人肝组织作为检测样本
3.1使用RIPA裂解液提取人肝组织细胞核蛋白.采用15％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后电转移蛋白到硝酸纤维素膜上；
3.2使用5％BSA或脱脂奶粉37度封闭1到2个小时,TBST洗涤3次，每次5min；用TBS洗涤3次，每次5min；
3.3使用重组的结构域蛋白(HIS8-SUMO-PHD-HA)，孵育NC膜,工作浓度为2-30nM或0.2-2ug/ml,37℃孵育1到2个小时,使用TBST和TBS依次洗涤3次，每次5min；
3.4加入小鼠抗HA单抗,按说明书稀释抗体(1:1000)，37度孵育2h,TBST洗涤3次，每次5min，再用TBS洗涤3次，每次5min；
3.5加入带HRP的羊抗鼠IgG多抗(1:2000)，按说明书稀释抗体，37度孵育2h,TBST洗涤3次，每次5min，用TBS洗涤3次，每次5min；
3.6加入ECL发光液，依次显影，定影，曝光1-5min。观察免疫印迹结果。
同样使用SEQ ID No.4和5分别实施同样的技术方案。
免疫印迹结果：
使用SEQ ID No.3或4和5进行免疫印记检测的最优使用浓度均可以低至5uM,依然可以得到良好的特异性条带。没有发生明显的交叉反应，说明3种重组蛋白共有的，经优化后的核心结构域PHD，对组蛋白H3K14cr有更好的特异性结合。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉博欧特生物科技有限公司
<120> 一种用于检测组蛋白豆蔻酰化修饰的重组蛋白及其应用
<130> KHP171111257.6
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 109
<212> PRT
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Thr Gly Gln Pro Glu Glu Leu Val Ser Cys Ser Asp Cys Gly Arg Ser
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35 40 45
Lys Thr Tyr Arg Trp Gln Cys Ile Glu Cys Lys Cys Cys Asn Ile Cys
50 55 60
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<212> DNA
<213> 优化PHD序列
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gaggagcttg ttagctgctc cgattgtggg cgtagcgggc atcctagctg cttacaattt 120
acgcccgtga tgatggccgc tgaaaagaca taccgttggc agtgcatcga gtgcaagtgc 180
tgtaacattt gcggtacaag cgagaatgat gaccagctga ttttctgtga tgattgtgac 240
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tcatgccact tgtgccttga tttggaa 327
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Gly Ala Thr Tyr Asn Asn Tyr Cys Asp Phe Cys Leu Gly Asp Ser Lys
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