本发明涉及雌激素受体β抑制剂多肽及其应用，具体涉及具有抑制雌激素受体β抑制剂活性，治疗恶性肿瘤的多肽。
背景技术：
雌激素受体(ER)被作为乳腺癌的标志物。乳腺癌中存在的ER主要是ERα，当正常乳腺组织变成致瘤物时，ERα的水平增加而ERβ水平降低。雌二醇(E2)通过ER调节生长、分化和生殖等生理过程，E2也影响其它组织，如骨胳、肝、脑和心血管系统。ER也作为手术后的预后指标，ER阳性的病人的手术效果较阴性的病人更好。ER已成为乳腺癌治疗最有效的靶分子。目前研究主要集中在从分子水平阐明ER的激活，从而达到治疗的目的。不同的试剂可阻断E2和ER的相互作用。选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，如他莫昔芬(Tamoxifen)和雷洛昔芬(Raloxifene)是E2的竞争性抑制剂。纯化的抗雌激素有拮抗剂效应，在晚期乳腺癌治疗中发挥作用。芳香化酶抑制剂，如阿纳托(司)唑，能阻止雄烯二酮或睾酮向雌酮和雌二醇的转变。它是特异而有效的治疗乳腺癌的方法，相对于他莫昔芬，效果更好且副作用小。
ERβ存在于人结肠癌细胞HCT116、HCT8、DLD1、LoVo、HT29、Colo320、SW480、Colo205中。对人标本的研究发现，相对于ERβ，ERα在正常和癌变的结肠组织中的表达水平极低，在正常结肠组织中ERβ位于核内，而在结肠癌组织则位于胞质。因此，ERβ是结肠组织中主要表达的ER。大约有三分之二的妇女的卵巢癌是ER阳性。正常卵巢中的主要ER是ERβ，ERβ主要位于卵泡细胞，而ERα主要位于膜和间质细胞。ERα是卵巢癌中的主要ER。对人正常和恶变的卵巢的研究发现，相于对正常卵巢，卵巢癌中ERαmRNA水平较ERβ水平增加。雄激素及其受体AR对雄性生殖系统，以及非生殖系统器官如前列腺的发育及功能维持至关重要。在前列腺，AR表达于分泌性上皮细胞并对雄激素作用起应答效应。AR在上皮细胞来源的胶质瘤的发生中发挥关键作用。另外，一些研究发现，ERβ在前列腺中高表达。ERβ可在正常和癌变的前列腺组织被检测到。ERβ选择性配体有望被用于胶质瘤的治疗。
总之，雌激素受体在机体的生长发育、新陈代谢、细胞分化及体内许多生理过程中发挥重要作用，而雌激素受体及其调控的代谢通路的紊乱也可导致肿瘤等许多病理过程。因此，雌激素受体成为肿瘤治疗的靶点。
本专利中的雌激素受体β抑制剂多肽已证明在胶质瘤中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。
技术实现要素：
发明目的
本发明提供全新的序列，该序列为雌激素受体β抑制剂抑制剂，对恶性肿瘤具有很好的疗效。
技术方案
雌激素受体β抑制剂多肽，其特征在于其序列为SEQ ID NO：1。
雌激素受体β抑制剂多肽特异性作用于细胞表面雌激素受体β抑制剂，在治疗恶性肿瘤，如胶质瘤和前列腺癌药物中的应用。
有益效果
利用固相合成法化学合成雌激素受体β抑制剂多肽，该多肽具有全新的序列，该多肽可以抑制雌激素受体β抑制剂活性，治疗恶性肿瘤，如胶质瘤和前列腺癌。我们发现的雌激素受体β抑制剂多肽可以抑制胶质瘤细胞和前列腺癌细胞增殖活力，同时，本发明的多肽能显著性抑制肿瘤细胞ERβ的表达(p<0.05)，从而起到抑制肿瘤细胞ERβ的作用。在体内试验中提高荷瘤裸鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。
具体实施方式
实施例1
雌激素受体β抑制剂多肽对体外培养人前列腺癌细胞中ERβ表达量的影响。
将对数生长的人前列腺癌细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入实验药物雌激素受体β抑制剂多肽(上海生工合成)和阳性对照药物替莫唑胺；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，收集进入前列腺癌细胞中总蛋白进行Western-blot检测ERβ蛋白表达量。等量的大约30μg总蛋白用10％聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)进行200伏特，2小时的电泳后电转至PVDF膜上(Millipore)。5％的牛血清白蛋白室温条件下封闭1小时。加入特异性的CCRK(1∶500稀释，Santa Cruz)and GAPDH(1∶5000稀释，Sigma)一抗抗体，在4℃条件下孵育过夜。用含有1％的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分钟。加入特异性针对一抗的二抗，室温条件下孵育1小时。用含有1％的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分钟。加入ECL荧光显影液试剂(Thermo)显影。运用Image J软件进行影像条带的灰度定量分析。
结果显示：雌激素受体β抑制剂多肽处理的前列腺癌细胞中CCRK蛋白质的表达明显低于未经过雌激素受体β抑制剂多肽处理的前列腺癌细胞。可见，本发明的多肽能显著性抑制ERβ的表达(p<0.05)，从而起到抑制ERβ的作用。
实施例2
雌激素受体β抑制剂多肽对体外培养人食道癌细胞表面ERβ表达的影响。
将对数生长的人食道癌细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入实验药物雌激素受体β抑制剂多肽(上海生工合成)和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，收集细胞，PBS洗涤，70％冰乙醇固定，加入PC缓冲溶液(PC缓冲液是0.2mol Na2HPO，192ml，0.1mol柠檬酸8ml 0.2M ph＝7.8)室温低渗处理后，离心去上清，加入RNaseA消化后，加入PI(终止浓度为50mg/L)，上流式细胞仪检测细胞周期(激发波长＝488nm，发射波长＝630nm)。结果显示，经过雌激素受体β抑制剂多肽处理的人食道癌细胞的呈ERβ阳性的细胞数量占5.95％，显著性低于未经过雌激素受体β抑制剂多肽处理的人食道癌细胞(ERβ阳性的细胞数量占15.25％，p<0.05)。可见，雌激素受体β抑制剂多肽可以显著性抑制人食道癌细胞表面ERβ表达。
实施例3
雌激素受体β抑制剂多肽对体外培养人胶质瘤细胞的生长和存活IC50。
采用MTT比色法。将对数生长的人胶质瘤细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物雌激素受体β抑制剂多肽(上海生工合成)和阳性对照药物替莫唑胺；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式人胶质瘤细胞生长抑制率＝(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实验药物的IC50为25.63μM。
实施例4
雌激素受体β抑制剂多肽对体外培养人前列腺癌细胞的生长和存活IC50。
采用MTT比色法。将对数生长的人前列腺癌细胞，以1.0×105加入96孔培养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物雌激素受体β抑制剂多肽(上海生工合成)和阳性对照药物替莫唑胺；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养48h后，每孔加入MTT，作用4h后，加入DMSO，孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式人前列腺癌细胞生长抑制率＝(1-实验组吸光值/对照组吸光值)×100％。计算出实验药物的IC50为12.22μM。
实施例5
用肿瘤模型检测雌激素受体β抑制剂多肽的体内活力。
建立胶质瘤肿瘤模型，阳性对照药物替莫唑胺；空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽(上海生工合成)设3个剂量：5、10、20mg/Kg。21天后，观察裸鼠存活数量，计算存活率。结果显示，雌激素受体β抑制剂多肽可有效地保护裸鼠，提高荷瘤裸鼠的生存率，生存率达到79.1％。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种雌激素受体β抑制剂抑制剂多肽及其应用
<130>
<160> 1
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Leu Glu Xaa Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp
1 5 10 15
Arg Ser Met Glu His Pro Gly Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu
20 25 30
Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys