N15多肽在制备细菌抑制剂中的用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体指N15多肽在制备细菌抑制剂中的用途。

背景技术：

人体中存在着很多种类的细菌，其中有些是有益菌，有益菌对维持人体微生环境有着重要的作用，还有些细菌则是致病菌，能引起人类疾病。细菌在人体内寄生，增殖并引起疾病的特性称为细菌的致病性或病原性(pathogenicity)。病原菌的致病作用与其毒力、侵入机体的数量、侵入途径及机体的免疫状态密切相关。例如，大肠杆菌寄居于肠道内，它的单独致病力不大，若和其他致病菌在一起时，可造成严重的混合感染，常见的致病菌还有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等。

蓝藻之所以又称蓝细菌，是因为蓝藻是最原始、最古老的藻类.其结构简单，无典型的细胞核，所以又称蓝细菌，属于原核生物。已知蓝藻约2000种，中国已有记录的约900种。蓝藻有极大的适应性，分布很广。在一些营养丰富的水体中，有些蓝藻常于夏季大量繁殖，并在水面形成一层蓝绿色而有腥臭味的浮沫，称为“水华”，大规模的蓝藻爆发，被称为“绿潮”(和海洋发生的赤潮对应)。绿潮引起水质恶化，严重时耗尽水中氧气而造成鱼类的死亡。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种多肽，该多肽能够抑制多种致病菌和蓝藻生长，具有制备细菌抑制剂的用途，它已被现有技术公开，名为N15多肽。

N15多肽是一个具有15个氨基酸的短肽，其序列为甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-脯氨酸，它具有多种生物学功能，包括调节NF-κB转录因子结合目的基因的能力，影响NF-κB目的基因产物蛋白质的转录和表达；阻断PCNA结合DNA聚合酶，从而阻止细胞DNA合成抑制细胞增殖；抑制上皮细胞增生，调节表皮增生及分化，使皮肤角化过程正常化等。

发明人发现在研究中发现N15可以对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、蓝细菌的生长产生抑制作用。经试验检测，N15多肽抑制蓝藻增殖可能是通过抑制DNA复制和异形胞分化基因的表达，起到抑制蓝藻增殖的。

本发明还提供了一种N15多肽制备的抗细菌药物，为N15多肽的水溶液，浓度大于等于100μg/mL。

本发明的有益效果：N15多肽是一种结构清晰，易于工业化生产的多肽，它可以抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、鱼腥蓝细菌等多种细菌的增殖，效果好且无毒副作用。

附图说明

图1为N15对大肠杆菌的抑菌曲线。

图2为流式细胞仪检测N15对金黄色葡萄球菌DNA含量的影响。

图3为N15对鱼腥蓝细菌PCC 7120的抑菌曲线。

图4为缺氮诱导48小时对照组和N15实验组鱼腥蓝细菌PCC7120异形胞的分化情况。

图5为荧光定量RT-PCR检测N15对蓝藻hetR基因mRNA表达量的影响。

图6为荧光定量RT-PCR检测N15对蓝藻ntcA基因mRNA表达量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实验例对本发明作进一步的论证说明，以下实验例仅是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实验例。

实验例1：N15抑制了大肠杆菌的生长

实验方法：

在液体培养基中，微生物随着培养时间的增加而不断增加，逐渐使培养基混浊，这一变化，可以用分光光度计测定，并可根据不同的时间里测定的数值而做出该种微生物的生长曲线。

以LB液体培养基作为空白，在分光光度计上调零点。从0时开始，添加N15至终浓度为500μg/mL，每隔2h测定液体LB培养液的OD600(波长600nm处的吸光度)，同时设置不添加N15的菌株作为对照。以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，制作曲线，即为N15多肽对大肠杆菌的抑菌曲线，结果如图1所示。

实验结果表明，加入N15多肽至终浓度为500μg/mL的大肠杆菌的生长和不加入N15的对照菌株比较，受N15多肽抑制大肠杆菌的生长较为缓慢，加入N15对大肠杆菌的生长具有抑制作用。

实验例2：N15对金黄色葡萄球菌的生长具有抑制作用

实验方法：

取金黄色葡萄球菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，37℃下活化培养，用接种环从斜面上挑菌到无菌水中制成菌悬液，接种培养无菌操作下，用取液器吸取100μL体积的菌液到灭菌小离心管中，充分混匀后，迅速注入到灭菌平皿中，在平板中加入N15多肽，以同体积的无菌水的混合液注入作空白，置于37℃恒温培养箱中培养48小时，观察菌落生长情况，并对菌落计数，结果见表1。

表1.N15对金黄色葡萄球菌生长抑制结果对照表

结果显示，和对照相比，加入N15多肽的平板上金黄色葡萄球菌的菌落数明显减少，N15对金黄色葡萄球菌的生长具有抑制效应。

实验例3：N15对金黄色葡萄球菌的DNA复制具有抑制效应

实验方法：

制备YEPD液体培养基，培养金黄色葡萄球菌，并加入N15到YEPD液体培养基中，同时设置不加N15多肽的金黄色葡萄球菌作为对照(control)，加入N15多肽(终浓度500μg/mL)，在处理2小时分别取样2mL金黄色葡萄球菌菌体，加入Sytox-Green染料对金黄色葡萄球菌细胞DNA染色后，使用流式细胞仪进行金黄色葡萄球菌的DNA相对含量进行测定，结果见图2。

如实验结果所示，横坐标表示单个金黄色葡萄球菌细胞内DNA的含量，纵坐标表示酵母细胞数量。在N15处理2小时内，N15处理细胞内的DNA含量和对照细胞相比没有显著性差异，而随着时间的增加，在N15处理15小时以后，N15处理细胞内的DNA含量和对照细胞相比明显减少。该结果表明N15会引起金黄色葡萄球菌细胞DNA含量的减少。

实验例4：N15对沙门氏菌的生长具有抑制作用

实验方法：

取沙门氏菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，37℃下活化培养，用接种环从斜面上挑菌到无菌水中制成菌悬液，接种培养无菌操作下，用取液器吸取100μL体积的菌液到灭菌小离心管中，充分混匀后，迅速注入到灭菌平皿中，在平板中加入N15多肽，以同体积的无菌水的混合液注入作空白，置于37℃恒温培养箱中培养48小时，观察菌落生长情况，并对菌落计数，结果见表2。

表2.N15对沙门氏菌生长抑制结果对照表

结果显示，和对照相比，加入N15多肽的平板上沙门氏菌的菌落数明显减少，N15对沙门氏菌的生长具有抑制效应。

实验例5：N15抑制了鱼腥蓝细菌的生长

实验方法：

将鱼腥蓝细菌PCC 7120在液体BG11培养基中培养至OD750(波长750nm处的吸光度)在0.3～0.4左右，添加N15至终浓度为100μg/mL，同时设置不添加N15的菌株作为对照。每隔24小时用分光光度计测定菌液的OD750，连续测定8天后根据数据绘制N15的抑菌曲线，结果如图3所示。

实验结果表明，加入N15多肽至终浓度为100μg/mL的鱼腥蓝细菌PCC 7120的生长和不加入N15的对照菌株比较，受N15多肽抑制鱼腥蓝细菌的生长较为缓慢，加入N15对鱼腥蓝细菌PCC 7120的生长具有抑制作用。

实验例6：N15推迟了鱼腥蓝细菌的异形胞分化时间

实验方法：

鱼腥蓝细菌PCC 7120是一种丝状细菌，其菌丝体能进行光合作用。在环境中缺乏氮源的条件下，会分化出具有固氮功能的异形胞。为了观察N15处理对异形胞发育的影响，本研究中在对鱼腥蓝细菌进行缺氮处理的同时，加入100ug/mL的N15，同时设置不加入N15的对照组，诱导后进行显微镜观察。

实验结果：

鱼腥蓝细菌PCC 7120的营养细胞在形成异形胞的过程中，产氧的光系统II复合物在异形胞中失活，因此在荧光显微镜下，只有营养细胞能够发红色荧光，而异形胞没有荧光。在进行缺氮诱导的同时加入100μg/mL的N15，分别在24小时、48小时候、72小时、96小时进行显微镜观察，结果显示对照组的鱼腥蓝细菌在缺氮诱导24小时就有异形胞的产生，而加入N15的鱼腥蓝细菌直到96小时以后才有异形胞生成，缺氮诱导48小时的照片如图4所示，加入N15的鱼腥蓝细菌PCC 7120没有异形胞产生，菌丝体的所有细胞在荧光显微镜下都发红色荧光，而对照组菌丝有异形胞产生，这些异形胞在荧光显微镜下也没有红色荧光。由此我们得知，N15推迟了鱼腥蓝细菌PCC7120的异形胞发育生成的时间。

实验例7：N15抑制了异形胞分化基因的表达

实验方法：

为了观察N15处理对异形胞发育的影响，本研究中在对鱼腥蓝细菌进行缺氮处理的同时，加入100μg/mL的N15，同时设置不加入N15的对照组，分别提取0hour、6hour、12hour、24hour的对照组和实验组，每个样品收集50mL菌体,提取RNA，并且用DNasel去除残余的基因组DNA。利用紫外分光光度计对总RNA定量后,使用TakaRa公司的反转录试剂盒反转录RNA合成cDNA。具体操作步骤参见产品说明书。用TakaRa公司的试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)进行实时荧光定量反转录PCR。具体操作参见产品说明书。分析软件使用ROCHE LightCycler480进行分析,定量方法为相对定量法。

实验结果：

异形胞在发育过程中需要在许多基因的参与，其中hetR和ntcA基因是异形胞发育的关键基因，与异形胞发育的多个后期基因的转录激活依赖于hetR和ntcA。我们通过实时荧光定量反转录PCR实验检测了N15对这几个异形胞分化相关基因表达的影响，实验结果如图5和6所示。

和对照组相比，N15加入6hour、12hour、24hour后，较明显的抑制了鱼腥蓝细菌中hetR和ntcA基因的表达，由此我们得知N15对蓝藻生长的抑制是通过抑制蓝细菌中异形胞分化相关基因的表达来实现的。

N15多肽的抑菌效果可作用于革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、蓝细菌，上述实施例仅为对细菌抑制剂的举例，挑选了较有代表性的细菌，无法将所有细菌种类的抑制实验例一一列出，不因此限制本发明的范围。