本发明属于生化制药领域，具体涉及一种源自苦瓜的天然降糖药物，特别涉及苦瓜多组分提取物的复合制剂。
背景技术：
糖尿病是一种慢性病，难以根治并引发多种并发症，例如临床上常见的糖尿病并发肾病、糖尿病并发心脏病、非创伤性下肢切除、以及失明等。糖尿病分为I型和II型，其中II型糖尿病最常见，一般认为II型糖尿病是由于机体不能产生足够量的胰岛素或者对胰岛素的敏感度降低导致的新陈代谢疾病。除了注射胰岛素外，目前已经有几种临床上用于治疗胰岛素的药物，例如双胍类、葡萄糖苷酶抑制剂类、磺脲类等，然而上述药物都具有一定的缺陷，长期服用副作用明显或产生抗药性。
苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属植物，现代药理研究结果表明，苦瓜具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、免疫调节等多种药理活性，其中降血糖活性最为显著。苦瓜在哺乳动物模型和人体中的降血糖活性已经得到证实，但其中的降血糖成分及作用机理还不完全清楚。关于苦瓜在降血糖中的用途，目前主要是以苦瓜为原料，利用水提、醇提等方法制备含有降血糖活性的提取物，也有一些研究利用苦瓜酶解物制备膳食纤维用于调节血糖。然而按照通常的研究方法从苦瓜中提取、纯化降糖活性成分时，往往发现相对单一的提取物或纯的成分丧失了降糖功能。例如，目前从苦瓜中成功分离纯化的活性成分——苦瓜苷虽有清热、解毒、利尿的功效，但降血糖的效果并不稳定。
苦瓜膳食纤维对糖尿病有一定的治疗作用，现有技术膳食纤维的提取通常是化学法和两步酶解法。化学法不可避免的导致提取的膳食纤维残留有化学药物，带来潜在的食品安全隐患；两步酶解法步骤复杂，成本高，提取效率不高，目前两步酶法提取膳食纤维主要使用木瓜蛋白酶及淀粉酶，特别是对于具有降糖活性的可溶性膳食纤维提取率通常仅在10％左右。
技术实现要素：
本发明针对苦瓜单组分提取物降糖效果不佳的技术问题，将现代药材活性成分提取技术和传统中药复配原则相结合，一方面，根据基于目前已有的研究和不同的提取方法，优化提取条件，提取苦瓜中不同的降血糖活性组分。另一方面，根据苦瓜中各种降糖活性组分的天然含量，对提取的降糖活性组分进行复配，使复配后的复合制剂最大程度的接近各组分在苦瓜中的天然比例。本发明以苦瓜中各降糖组分的天然含量为配比依据，从而使各活性成分达到协同降糖的作用。蜗牛酶是一种从蜗牛内脏中提取的一种复合酶系，本发明将蜗牛酶用于处理苦瓜渣生产膳食纤维，提高了可溶性膳食纤维的产量。
一方面，本发明提供一种苦瓜降糖提取物复合制剂，降糖活性成分包括活性肽提取物、耐热活性提取物、可溶性膳食纤维提取物，其特征在于所述复合制剂中活性肽提取物、耐热活性提取物和可溶性膳食纤维提取物三者的比例与苦瓜中三种组分的天然含量一致。
本发明所述苦瓜降糖提取物复合制剂，其中活性肽提取物：耐热活性提取物：可溶性膳食纤维提取物按干物质含量计为1∶5-10∶500-1000。
本发明所述的苦瓜降糖提取物复合制剂，其中所述活性肽提取物的制备方法包括：取新鲜苦瓜，洗净，加入5-10倍生理盐水4℃匀浆，匀浆液15000×g离心30min，上清液依次经过4层纱布过滤、watman滤纸、0.22μm滤膜三级过滤，0.22μm过滤的滤液过10kDa的截留膜，取分子量小于10kDa的级分浓缩，得活性肽。
本发明所述的苦瓜降糖提取物复合制剂，其中耐热活性提取物的制备方法包括：将水浸提法制备苦瓜活性肽产生的沉淀和滤渣合并用5-10倍体积50-90％的乙醇加热回流提取3次，每次提取时间为0.5-4小时，过滤取上清，合并上清液，减压浓缩，得耐热活性提取物。
本发明所述的苦瓜降糖提取物复合制剂，其中可溶性膳食纤维提取物的制备方法包括：将经过水提取、醇提取后产生的苦瓜渣烘干，加入pH4-6.5的醋酸缓冲溶液中，然后加入0.4-1％重量份的蜗牛酶37℃恒温水浴酶解1-3h，酶解完成后加热至100℃灭酶5min，抽滤取滤液，向滤液中加入2-5倍体积的无水乙醇、搅拌均匀、静置过夜，离心取沉淀，得可溶性苦瓜膳食纤维。
第二方面，本发明提供所述苦瓜降糖提取物复合制剂在制备治疗糖尿病药物中的应用，例如，所述苦瓜降糖提取物复合制剂在制备降低空腹血糖药物中的应用、所述苦瓜降糖提取物复合制剂在制备提高糖耐量药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种综合利用苦瓜生产降糖复合提取物的方法，特征在于包括以下步骤：
(1)取新鲜苦瓜，洗净，加入5-10倍生理盐水4℃匀浆，匀浆液15000×g离心30min，上清液依次经过4层纱布过滤、watman滤纸、0.22μm滤膜三级过滤，将离心沉淀与滤渣合并，0.22μm过滤的滤液过10kDa的截留膜，取分子量小于10kDa的级分浓缩，得活性肽；
(2)将步骤(1)中离心沉淀与过滤滤渣的混合物用5-10倍体积50-90％的乙醇加热回流提取3次，每次提取时间为0.5-4小时，过滤取上清，合并上清液，减压浓缩，得耐热活性提取物；
(3)将步骤(2)中过滤后的苦瓜渣烘干，加入pH4-6.5的醋酸缓冲溶液中，然后加入0.2-1％(w/w)蜗牛酶酶解1-3h，酶解完成后加热至100℃灭酶5min，抽滤取滤液，向滤液中加入2-5倍体积的无水乙醇、搅拌均匀、静置过夜，离心取沉淀，得可溶性膳食纤维；
(4)将活性肽、耐热活性提取物、可溶性膳食纤维按干物质含量计以1∶5-10∶500-1000的量混合得苦瓜活性提取物。
本发明所述综合利用苦瓜生产降糖复合提取物的方法，其特征在于步骤(3)中酶解条件为酶解温度50℃，pH为5.5，料液比为1∶30，蜗牛酶添加量为0.4％，酶解时间为1.5h。
与现有技术相比，本发明取得了以下有益的技术效果：
1、提高了苦瓜的利用率，除了无药理活性的植物纤维(包括木质素、难以降解的纤维素)以外，对苦瓜中各种活性成分几乎都进行了充分利用。
2、根据苦瓜中各降糖组分的天然含量，将各组分进行复配取得了降糖的协同作用。
3、现有技术中苦瓜可溶性膳食纤维的提取效率不高，通常低于原料干重的10％，本发明发现蜗牛酶能充分释放苦瓜渣中可溶性膳食纤维，进一步通过优化提取条件，使苦瓜SDF提取率占原料干重13.5％，同时提高了SDF的品质。
4、无需对提取物中的活性成分进行成本高昂的提取和纯化，工艺简单、对设备要求低、成本投入小、易产业化。
附图说明
图1为苦瓜渣SDF溶解性曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：苦瓜热不稳定活性成分的提取
将新鲜成熟的苦瓜果实洗净，加入5-10倍生理盐水4℃匀浆，匀浆液用盐酸调pH值至1.5静置30min，15000×g离心10min，上清液依次经过4层纱布、watman滤纸、0.22μm滤膜三级过滤，经过三级过滤后的滤液再过10kDa的截留膜，取分子量小于10kDa的级分，真空浓缩，得热不稳定活性提取物。将离心产生的沉淀和三级过滤产生的滤渣合并，备用。所述水浸提的热不稳定活性提取物中主要成分为苦瓜活性肽，也含有部分水溶性多糖或寡糖。
实施例2：耐热活性组分的提取
将实施例1所述苦瓜水溶性热不稳定活性成分的提取工艺中产生的离心沉淀和过滤滤渣合并，第一次加入5倍湿重的90％乙醇，搅拌混匀，加热回流提取2小时；第二次加入3倍湿重的90％乙醇，加热回流提取1.5小时；第三次加入2倍湿重的90％乙醇，加热回流提取1小时。将乙醇提取液过滤取上清，合并上清液，减压浓缩，得耐热活性提取物。收集乙醇提取液过滤产生的苦瓜渣备用。
实施例3：木瓜可溶性膳食纤维的提取
将经过实施例1所述水提取、实施例2所述醇提取后产生的苦瓜渣烘干，按照料液比1∶30加入pH5.5的醋酸缓冲溶液中，然后加入苦瓜渣干重0.4％重量份的蜗牛酶50℃恒温水浴酶解1.5小时，酶解完成后加热至100℃灭酶5min，抽滤取滤液，向滤液中加入4倍体积的无水乙醇、搅拌均匀、静置过夜，10000×g离心10min取沉淀，加适量的水复溶即得可溶性苦瓜膳食纤维。
实施例4：蜗牛酶提取SDF工艺的优化
在蜗牛酶酶解单因素试验的基础上进一步选取酶解温度、料液比、蜗牛酶添加量和酶解时间四因素，每个因素选取3个水平，以SDF提取率为评价指标，采用L9(34)正交试验优化蜗牛酶的酶解工艺。正交实验因素水平表如表1所示。
表1正交试验因素水平表
按照以下公式计算SDF提取率
SDF提取率/％＝得到的SDF的质量(g)/果肉渣总质量(g)×100
采用SPSS19.0软件处理，实验数据以表示，多组间比较使用方差分析。
表2 L9(34)正交试验结果
表3正交试验结果方差分析
正交试验结果如表2、3所示，影响蜗牛酶法提取苦瓜渣中膳食纤维得率各因素主次顺序为酶解温度、酶解时间、料液比和蜗牛酶添加量。因素A的P值＜0.01，且极差R值大于其他三因素，说明酶解温度对指标影响最大。各主次指标最高水平，组成较优工艺条件为A1B2C1D2，即酶解温度50℃、料液比1∶30，蜗牛酶添加量0.4％，酶解时间1.5h。
酶解温度50℃、pH为5.5、料液比1∶30，蜗牛酶添加量0.4％，酶解时间1.5h时进行3次平行试验进行验证，苦瓜渣膳食纤维得率为13.44％、13.56％和13.48％，平均得率为13.49％，因此确定酶解条件为酶解温度50℃、pH为5.5、料液比1∶30，蜗牛酶添加量0.4％，酶解时间1.5h。
实施例5
蜗牛酶提取法获得苦瓜SDF理化性质
1.持水力测定
称取4g样品于50mL的离心管中，加入30mL蒸馏水，室温搅打30min，2500r/min离心10min，弃去上清液并用滤纸吸干离心管壁残留水分，称重，按以下公式计算持水力。
持水力/(g·g-1)＝(样品湿重-样品干重)/样品干重
2.膨胀力测定
准确称取0.3g样品，置于10mL量筒中，移液管准确移取5.00mL蒸馏水加入其中。振荡均匀后室温(203℃)放置24h，读取液体中膳食纤维的体积，按以下公式计算持水力。
膨胀力/(mL·g-1)＝[(膨胀后的体积(mL)-干品体积(mL)]/样品干重(g)
3.黏度的测定
称取适量的样品，加入蒸馏水，配成质量分数10％的溶液，用黏度计进行测定。
表4 SDF持水力、膨胀力和粘度测定结果
注：★与苦瓜原渣相比P＜0.05；★★与苦瓜原渣相比，P＜0.01
苦瓜原渣和SDF持水力、膨胀力和粘度测定结果如表4所示，SDF持水力和膨胀力较苦瓜原渣分别呈上升趋势，黏度在27℃、溶液浓度为10％的条件下呈下降趋势，由此可得知蜗牛酶可以增加膳食纤维持水力和膨胀力，降低膳食纤维溶液的表观黏度。
4.溶解性测定
准确称取2.5g样品，加入50mL蒸馏水，用磁力搅拌器分散均匀转入250mL容量瓶并定容，将容量瓶置于恒温水溶锅中保温20min，趁热抽滤，准确移取50mL滤液于恒重的100mL烧杯中，60℃下干燥5h后，再于105℃干燥至恒重得m2，计算得样品的溶解度。
图1表明，常温下SDF的溶解度较高，可达65.5％，随着温度升高，溶解度不断增大，其中在70℃之前，曲线上升趋势明显，当升高至70℃后，曲线上升趋势缓慢，溶解性基本保持在97％左右稳定不变，提示由蜗牛酶提取苦瓜渣得到的SDF溶解性好，适于制药。
实施例6
小鼠造模、分组和给药
选取健康昆明种小鼠80只，雌雄各半，适应性饲养5d后腹腔注射四氧嘧啶160mg/kg给药7d后禁食3～5h，眼眶取血测血糖值，选取50只血糖值10～25mmol/L小鼠为病理模型。将50只糖尿病小鼠随机分为模型对照组、阳性药物对照组、活性肽提取物组、耐热组分的提取物组、膳食纤维提取物组、以及提取物复配组。实验期间给予各组小鼠普通饲料喂养，阳性药物对照组每天灌胃吡格列酮8mg/kg(以片重计)，活性肽提取物组每天给药10mg/kg体重，耐热组分的提取物组每天给药50mg/kg体重，膳食纤维组每天给药1g/kg体重；复配组每天给药2mg/kg体重的活性肽提取物+10mg/kg体重的耐热组分提取物+500mg/kg体重的SDF。连续4周。实验结束时禁食12h，测定小鼠空腹血糖值。测定空腹血糖后经口灌胃2.0g/kg葡萄糖，分别测定小鼠服糖后0、0.5、2h的血糖值。曲线下面积计算法：S(mol/L)＝1/4(A+4B+3C)(A、B、C分别为给药后0、0.5、2.0h的血糖值)血糖曲线下面积越大，表面小鼠糖耐量越高。
表5对实验性糖尿病小鼠空腹血糖的影响
注：★与模型组相比P＜0.05；★★与模型组相比，P＜0.01；#与阳性药物对照物组相比，P＜0.05；##与阳性药物对照物组相比，P＜0.01。
表6对糖尿病小鼠糖耐量的影响
注：★与模型组相比P＜0.05；★★与模型组相比，P＜0.01；#与阳性药物对照物组相比，P＜0.05；##与阳性药物对照物组相比，P＜0.01。
表5、6的实验结果表明，活性肽、耐热成分、SDF单一提取物对于降低糖尿病小鼠空腹血糖、提高糖耐量均有一定的应用潜力，而复配组在大幅度降低三种提取物用药量的情况下，却显著的提高了降低空腹血糖、提高糖耐量的效果。说明三种提取物按照上述比例复配对于降低空腹血糖、提高糖耐量取得了协同作用。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。