本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用。
背景技术：
从生态角度讲，甲酸是糖发酵的中间产物，易于在发酵过程中累积。同时，甲酸还可以作为生成下游还原性代谢产物的原料，例如，生成乙醇，甲烷，氢气等。从生物技术角度讲，甲酸可以来源于二氧化碳还原、生物质选择性氧化、天然气部分氧化及合成气的氢化。因此甲酸可以作为连接物理化学与生物领域的桥梁，研究甲酸的同化途径具有重要的意义。
自然界存在的甲酸固定反应主要有甲酸直接还原反应、甲酸激酶反应、甲酸与乙酰辅酶缩合反应、乳酸合成反应等。甲酸的直接还原反应由甲醛脱氢酶催化，将甲酸直接还原为甲醛从热力学上是不利的，因此反应效率低下。甲酸激酶反应由甲酸-四氢叶酸连接酶催化，此同化途径路线长，需在厌氧条件下反应，因此应用受到限制。用乙酰辅酶a合成酶可以实现甲酸还原为甲醛，但目前利用效率依然不高。甲酸与乙酰辅酶缩合反应丙酮酸-甲酸裂合酶催化，此反应也是热力学甲酸有利的。乳酸合成反应即甲酸与乙醛缩合反应，目前还没有在体外成功实现。
这些甲酸固定反应是甲酸同化途径的重要组成部分，目前最优的甲酸同化途径是人工合成途径：甲酸还原为甲醛，甲醛聚合生成二羟基丙酮，二羟基丙酮磷酸化直接进入中心代谢。
stacka为acetatekinase(stacka)乙酸激酶，stacka用于催化乙酸磷酸化，aspartate-semialdehydedehydrogenase(asd)天冬氨酸半醛脱氢酶，asd蛋白催化磷酸天冬氨酸生成为天冬氨酸-4-半醛。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供a和b的新用途，
所述a为stacka蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述b为asd蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。
本发明提供了a和b在催化甲酸合成甲醛中的应用；
还提供了a和b在制备催化甲酸合成甲醛产品中的应用；
所述a为stacka蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述b为asd蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。
上述应用中，所述stacka蛋白来源于salmonellatyphimurium；
或所述asd蛋白来源于streptococcuspneumoniaeserotype4。
上述应用中，所述stacka蛋白为如下1)或2)：
1)由序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；
2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能由1)衍生的多肽；
或所述asd蛋白为如下1)或2)：
1)由序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；
2)由1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能由1)衍生的多肽。
上述应用中，所述stacka蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：
1)编码区为序列3的dna分子；
2)在严格条件下与1)限定的dna分子杂交且编码具有相同功能多肽的dna分子；
3)与1)或2)限定的dna分子有大于70％同一性且编码具有相同功能多肽的dna分子；
或，所述asd蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一种：
1)编码区为序列4的dna分子；
2)在严格条件下与1)限定的dna分子杂交且编码具有相同功能多肽的dna分子；
3)与1)或2)限定的dna分子有大于70％同一性且编码具有相同功能多肽的dna分子。
本发明另一个的目的是提供一种催化甲酸合成甲醛产品。
本发明提供的产品，包括a和b；
所述a为stacka蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌；
所述b为asd蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的重组载体或重组菌。
上述产品还包括nadph、atp和mgcl2；
或，上述产品为试剂盒。
本发明第三个目的是提供一种催化甲酸合成甲醛的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：以甲酸为底物，用所述stacka蛋白和所述asd蛋白催化甲酸合成甲醛。
上述方法中，所述催化反应的条件为37℃反应2h。
上述方法中，所述催化反应的所需的ph值为ph7.4。
上述方法中，所述催化所在的体系包括nadph、atp、mgcl2、甲酸、所述stacka蛋白和所述asd蛋白。
本发明的实验证明，本发明发现stacka和asd酶的新功能可用于甲酸合成甲醛，为甲酸合成甲醛创造了一条新途径。
附图说明
图1为重组质粒pet-28a-stacka的质粒图谱示意图。
图2为重组质粒pet-28a-asd的质粒图谱示意图。
图3为甲醛检测标准曲线。
图4为不同酶催化甲酸生成的甲醛浓度示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、stacka和asd的获得
1、stacka、asd基因获得、载体构建
stacka种属来源为salmonellatyphimurium(strainlt2/sgsc1412/atcc700720)，其氨基酸序列如序列1所示；asd种属来源为streptococcuspneumoniaeserotype4(strainatccbaa-334/tigr4)，其氨基酸序列如序列2所示。在不改变stacka、asd编码的氨基酸序列的前提下，将上述野生型基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列如序列3、序列4所示。
分别将上述基因序列合成在pet-28a载体(novagen，kan+，见图1、图2)上，位于酶切位点ndei和xhoi之间，重组质粒分别命名为pet-28a-stacka、pet-28a-asd。
pet-28a-stacka为将序列3所示的car基因替换pet-28a载体的ndei和xhoi位点间的dna片段得到的载体；
pet-28a-asd为将序列4所示的car基因替换pet-28a载体的ndei和xhoi位点间的dna片段得到的载体。
2、基因的表达
为了体外检测stacka、asd酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。
(1)分别将大肠杆菌表达型重组质粒pet-28a-stacka、pet-28a-asd转入e.colibl21(de3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(kan+，100mg/ml)，37℃过夜培养；
(2)挑单克隆至5mllb液体培养基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220r/min培养至od600为0.6-0.8。将5mllb培养基中菌液转接至800ml2yt培养基中(kan+，100mg/ml)，37℃、220rpm培养至od600为0.6-0.8时，降温至16℃，加iptg至终浓度0.5mm，诱导表达16h；
(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；
(4)弃上清，用35ml蛋白缓冲液(50mm磷酸钾缓冲液，200mmnacl，5mmmgcl2，ph7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50ml离心管中，-80℃冰箱保存。
3、蛋白纯化
(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下进行破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；
(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：
a：柱平衡：挂上清前，先用ddh2o洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡ni亲和层析柱1个柱体积；
b：上样：将上清按0.5ml/min流速缓慢经过ni亲和层析柱，再重复一次；
c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，然后分别用50ml含50mm、100mm咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；
d：洗脱目的蛋白：用20ml含200mm咪唑的蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％sds-page检测。
(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mlamicon超滤管(30kda，millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1ml。加15ml不含咪唑的蛋白缓冲液，浓缩至1ml，重复该过程1次，得到纯化蛋白stacka、asd。
(4)用nondrop2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度并稀释至10mg/ml，即得到stacka、asd蛋白，其氨基酸序列分别如序列1、序列2所示。
实施例2、stacka和asd在催化甲酸生成甲醛中的应用
1、stacka/asd可以催化甲酸生成甲醛，反应方程式如下：
2、酶活性检测:
显色法检测甲醛生成量：利用《中华人民共和国国家环境保护标准hj601-2011》中的甲醛测定方法检测甲醛含量。具体流程如下：
a：配置乙酰丙酮溶液：将50g乙酸铵(ch3coonh4)、6ml冰乙酸(ch3cooh)及0.5ml乙酰丙酮(c5h8o2)试剂溶于100ml水中。此溶液在4℃冷藏可稳定保存一个月。
b：标准曲线的制备：分别配置浓度为0mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml的甲醛标准溶液。
取2.5ml各浓度甲醛标准溶液，加入0.25ml乙酰丙酮溶液，混匀。60℃水浴加热15min，冷却后414nm下检测吸光值。绘制标准曲线，如图3所示。
c:酶活性检测反应体系(200μl)：终浓度为1mm的nadph，1mmatp，5mmmgcl2，5mm甲酸，加入实施例1制备的stacka蛋白和asd蛋白各1.5mg/ml，再用ph7.4浓度为50mm磷酸钾缓冲液(0.1mk2hpo3水溶液、0.1mkh2po3水溶液、dh2o按照体积比为4:1:5混匀)补足至200ul，37℃反应2h。
用显色法检测甲醛生成量，根据甲醛浓度标准曲线计算甲醛浓度，结果如图4所示。
可以看出，在所提供反应条件下stacka和asd蛋白共同作用可以催化甲酸生成甲醛，加入5mm的甲酸可得到0.0163mm的甲醛。
自然界存在的酶是可逆反应，主要催化甲醛生成甲酸，检验此酶催化活性(以甲酸为底物)，检测甲醛，没有检测到产物。
序列表
<110>中国科学院天津工业生物技术研究所
<120>催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用
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