本发明属于生物技术领域，具体涉及一株新分离的肠杆菌及其利用l-苯丙氨酸生物转化生产β-苯乙醇的方法。
技术背景
β-苯乙醇，又名2-苯乙醇，分子式为c8h10o，常温常压下呈无色粘稠液体，天然存在于一些花和植物比如玫瑰、风信子、茉莉、水仙、黄兰、百合等的精油中。β-苯乙醇是一种具有玫瑰风味的芳香醇，不仅在食品、药品、化妆品、烟草和日化用品等行业中都有着广泛的应用，而且其衍生酯类如乙酸苯乙酯、丙酸-2-苯乙酯等都是重要芳香产品；现如今β-苯乙醇已经发展成继香兰素后的第二大香料物质。
β-苯乙醇的生产方法包括物理提取法、化学合成法和生物合成法。目前，天然β-苯乙醇主要通过植物提取或酵母以l-苯丙氨酸为底物生物转化获得。植物提取原料来源受限，且成本高；生物转化生产β-苯乙醇不仅保留了产品的天然、单纯的特性，还具有发酵周期短、原料成本低等优点，极具产业化前景。
目前，发酵生产β-苯乙醇的菌株主要为酵母，如酿酒酵母、克鲁维酵母、解脂耶氏酵母等，以l-苯丙氨酸为前体物，通过ehrlich途径合成β-苯乙醇。细菌来源的β-苯乙醇也有相关报道，但主要集中在合成途径等基础研究上，利用细菌发酵生产β-苯乙醇鲜有报道。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种生产β-苯乙醇的菌株及方法，所述的这种生产β-苯乙醇的菌株及方法要解决现有技术中生物法生产β-苯乙醇产物浓度低、生产菌株的种类选择少的技术问题。
本发明提供了一种用于生产β-苯乙醇的菌株，其分类命名为肠杆菌(enterobactersp.)，保藏号为cgmccno.15641。
本发明还提供了采用上述的菌株生产β-苯乙醇的方法，包括如下步骤：
1)一个配制液体种子培养基和发酵培养基的步骤；在所述的液体种子培养基中，各成份的浓度如下：
牛肉膏0.5-1.0g/l，
蛋白胨1.0-5.0g/l，
氯化钠0.5-5.0g/l，
溶剂为水，ph为7.2-7.5；
在所述的发酵培养基中，各成份的浓度如下：
甘油1.0-10.0g/l，
l-苯丙氨酸0.5-15.0g/l，
氯化钠0.5-15g/l，
磷酸氢二钾0.5-5.0g/l，
硫酸镁0.5-5.0g/l，
溶剂为水，ph为6.5-8.5；
2)一个菌株活化的步骤，采用无菌吸管吸取液体种子培养基，滴入冻干的保藏号为cgmccno.15641的肠杆菌菌种中，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，取菌体悬浮液，再移植于液体种子培养基内，在250-300r/min，30-37℃温度下培养24-48h；
3)一个液体发酵的步骤，将步骤2)的肠杆菌菌株的细胞液体种子培养物转接入发酵培养基中，摇瓶发酵，获得含β-苯乙醇的转化液；摇瓶发酵条件为：肠杆菌菌株的细胞液体种子培养物的接种量为发酵培养基体积的5％-20％，转化温度为25-37℃，转化速度150-250r/min，转化时间24-72h，转化培养基与容器的体积比为1:1-1:4；
4)一个上罐发酵的步骤，将步骤3)进行液体发酵培养的培养物接入发酵罐中，步骤3)进行液体发酵培养的培养物的体积为发酵罐体积的10％-40％，转化温度25-37℃，搅拌速度为250-750r/min，溶氧量为转化时间为48-96h，空气流量为2-4l/min，do值100％；
5)一个对β-苯乙醇进行提取的步骤，将二氯甲烷与步骤4)的含β-苯乙醇的发酵液按照体积比1:1-3:1的比例充分混合，室温萃取1-3h后，3000-8000r/min离心5-10min，取有机相浓缩10-15倍，即得β-苯乙醇。
本发明是针对目前市场对天然绿色产品的需要，提供了一株新分离的生产β-苯乙醇的肠杆菌，并提供用此菌株生物转化生产β-苯乙醇的方法。本发明是以肠杆菌mf024为出发菌株，以l-苯丙氨酸为底物，发酵、提取后经检测，β-苯乙醇产量最高可达到0.5g/l。本发明是以l-苯丙氨酸为唯一氮源生物转化得到β-苯乙醇。
本发明的肠杆菌(mf024)，分类命名：肠杆菌(enterobactersp.)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院(中科院微生物研究所)，保藏日期为2018年4月25日，保藏号为cgmccno.15641。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供的肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024生长速度快，遗传稳定性好，用于发酵生产β-苯乙醇具有更好的工业化应用前景。本发明的肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024菌株发酵培养基成分简单，原料成本低，发酵条件易于控制，反应条件温和、发酵周期短等优点，有良好的工业应用价值。本发明采用肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024菌株生产β-苯乙醇的提取工艺，提取效率高，所得β-苯乙醇绿色天然，工业应用具有优势。
附图说明
图1为肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024培养于lb固体培养基上的菌落形态图。
图2为肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024菌体显微形态图。
图3为β-苯乙醇产物气相图。
图4为β-苯乙醇产物质谱图。
具体实施方式
培养基的配制：
lb培养基的配制：蛋白胨3-5g/l，酵母粉4-5g/l，氯化钠8-10g/l，溶剂为水，ph7-7.5，121℃灭菌15min。
发酵培养基的配制：甘油1-10g/l，l-苯丙氨酸0.5-15.0g/l，氯化钠0.5-15g/l，磷酸氢二钾0.5-5.0g/l，硫酸镁0.5-5.0g/l，，溶剂为水，ph6.5-8.5，121℃灭菌15min。
液体细菌筛选培养基：β-苯乙醇0.5-5g/l，蛋白胨5-6g/l，酵母粉7-10g/l，氯化钠8-10g/l，氯化镁2-3g/l，硫酸钠1-2g/l，磷酸氢二钾1-2g/l，硝酸铵1-2g/l，玉米浆5-7ml/l，溶剂为水，ph7.0-7.5，121℃灭菌15min。
固体细菌筛选培养基除了加入18-20g/l的琼脂，配方中其余物质与液体细菌筛选培养基制备方法相同，配制方法也一样。
实施例1
肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024菌株的筛选
采集上海各地的森林公园玫瑰花、月季花、百合花等根部土样，分别称取0.5-1.5g溶于无菌水中，加入适量玻璃珠充分混匀后取加入液体细菌筛选培养基中。在28-37℃条件下，200-300rpm摇床振荡培养48h后以5％的接种量(v/v)转接至新鲜的液体细菌筛选培养基中培养24-48h，重复这一过程3-5次。将培养的菌液稀释10-7倍涂布在固体细菌筛选培养基上，在30℃的培养箱中培养24-72h。
显微镜下观察菌体的形态，选取长出的不同形态的单菌落在固体细菌筛选培养基划线，在30℃的培养箱中培养24-48h。反复3-6次，直至显微镜下观察到的菌体形态基本一致。
挑取单菌落(来源于上海海湾国家森林公园土壤中筛选分离)转接在ph为7.0的lb固体培养基30℃培养24h后的菌落形态如图1所示：单菌落呈白色圆形，半圆形凸起，直径约为0.1cm左右，边缘规则，表面光滑，不透明。
显微镜观察菌体形态如图2所示，其菌体形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，大小0.6-1.0×1.2-2.2μm。
将筛选所得的菌株用甘油保藏。保藏方法：60％甘油：菌液＝1:1置于保藏管中，保藏管在-80℃冻存。
上述的一株菌株，命名为：mf024，已于2018年4月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.15641。
实施例2
菌株16srdna鉴定:
将本发明获得的肠杆菌(mf024)送至上海生工生物工程有限公司进行16srdna序列的检测。获得本菌株16srdna序列如序列表seqidno:1所示。
其中，16srdna的pcr通用引物为：
27f(5’→3’)：agagtttgatcctggctcag；
1492r(5’→3’)：ggttaccttgttacgactt。
将本发明菌株(mf024)的16srdna序列(genbankno.mg554655)与genbank中的16srdna序列进行同源比较，发现与肠杆菌属的菌株最高相似度达99％，但不完全相同。
实施例3
生理生化鉴定：
挑取本发明菌株单菌落(mf024)，接种于ph为7.0的lb液体培养基，30℃、200rpm培养24h后，接入青岛高科技工业园海博生物技术有限公司的肠杆菌细菌生化鉴定条中，检测其生理生化特性。该菌株生理生化特性检测结果如下：
表1:enterobactersp.strainmf024生理生化特征结果
符号：+，90％-100％的菌株为阳性反应；-，90％-100％的菌株为阴性反应；d40％-60％的菌株为阳性反应。
生理生化特性表明此株菌符合肠杆菌属的相关性质。
实施例4:β-苯乙醇的鉴定
用lb液体培养基活化肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024菌株。将活化后的肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024菌株接种至液体种子培养基中，在摇床上培养24-48h，即制得mf024菌株的细胞液体种子培养物。
将mf024菌株的细胞液体种子培养物转接入发酵培养基中，在相应条件下摇瓶发酵，获得含β-苯乙醇转化液；摇瓶发酵条件为：接种量(v/v)为5％-20％，转化温度为25-37℃，转化速度150-250r/min，转化时间24-72h，转化培养基与容器的比例1:1-1:4。
上罐发酵条件为：接种量(v/v)为10％-40％，转化温度25-37℃，搅拌速度为250-750r/min，溶氧量为转化时间为48-96h，空气流量为2-4l/min，do值100％。
收集上述含β-苯乙醇的发酵液8000r/min离心5min，取上清发酵液与二氯甲烷体积比为：1:1-3:1充分混合，萃取1-3h后，3000-8000rpm离心5-10min，取有机相浓缩10-15倍。留二氯甲烷相，过0.22μm的微孔滤膜，装入气相瓶备用。
gc-ms检测β-苯乙醇方法：
gc条件：aglent色谱柱19091s-963(60.0m×250μm×0.25μm)；进样口温度250℃，升温程序：初始柱温50℃，以3℃/min升温至140℃，140℃保持5min，载气为氦气，载气流量1.0ml/min，分流比20:1；进样量1μl。ms条件ei离子源，电子能量70ev，离子源温度230℃，接口温度250℃，扫再描范围20–500amu，电子倍增电压1.3kv。
以上述方法鉴定产物β-苯乙醇的气相图谱如图3所示，质谱图谱如图4所示。
经检验，本发明所涉及肠杆菌(enterobactersp.strain)mf024能够在所述培养基中发酵，并生产β-苯乙醇，β-苯乙醇产量最高可达到0.5g/l。
序列表
<110>上海应用技术大学
<120>一种生产β-苯乙醇的菌株及方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1024
<212>dna
<213>肠杆菌(enterobactersp.)
<400>1
ggttaccttgttacgacttcaccccagtcatgaatcacaaagtggtaagcgccctcccga60
aggttaagctacctacttcttttgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtaca120
aggcccgggaacgtattcaccgtagcattctgatctacgattactagcgattccgacttc180
atggagtcgagttgcagactccaatccggactacgacgcactttatgaggtccgcttgct240
ctcgcgaggtcgcttctctttgtatgcgccattgtagcacgtgtgtagccctactcgtaa300
gggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccagtttatcactggcagtctcctt360
tgagttcccggcctaaccgctggcaacaaaggataagggttgcgctcgttgcgggactta420
acccaacatttcacaacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcagagttcccg480
aaggcaccaatccatctctggaaagttctctggatgtcaagagtaggtaaggttcttcgc540
gttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttga600
gttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcgacttaacgcgttagctccggaagcc660
acgcctcaagggcacaacctccaagtcgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatc720
taatcctgtttgctccccacgctttcgcacctgagcgtcagtctttgtccagggggccgc780
cttcgccaccggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctac840
ccccctctacaagactctagcctgccagtttcgaatgcagtttcccagggttgagcccgg900
ggatttcacatccgacttgacagaccgcctgcgtgcgctttacgcccagtaattccgatt960
acgcttgcaacctcgtatacgcgctgctgcacgagtagccgtgcttcttctgcgagtaac1020
gtca1024
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>肠杆菌(enterobactersp.)
<400>2
agagtttgatcctggctcag20
<210>3
<211>19
<212>dna
<213>肠杆菌(enterobactersp.)
<400>3
ggttaccttgttacgactt19