一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgRNA的载体及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种载体，具体涉及一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体及其应用。

背景技术：

适体核酶(aptazyme)适体核酶型核糖开关是近年出现的一种人工基因调控开关。最常见的适体核酶由锤头状核酶和适体组成，结构清晰，易于设计。作为一种顺式作用元件，适体核酶型核糖开关在特异性配体的作用下，无需蛋白分子辅助，即可通过调节自身剪切反应，调控mrna的翻译，可应用于多种细胞的基因调控。一个已经报道的适体核酶p1-f5(etal.，2010；ketzer，etal.，2014)在与茶碱结合后可以发生自身剪切，从而造成mrna的切割和降解，从而起到调控基因表达的作用。

clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)/crispr-associated(cas)9系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zincfingerendonuclease，zfn)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talen)一样可用于各种复杂基因组的编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。cas9核酸酶可以在sgrna指导下结合任何含有pam序列的dna，sgrna中20个核酸序列通过碱基互补配对靶向特定dna，稳定cas9与目的dna的结合。可以通过改变sgrna序列，使之结合到任意位点，sgrna与目标dna互补配对确保cas9作用位点特异性。但是，后续研究发现根据碱基错配数目、位置以及碱基特性差异，cas9容许grna20nt序列与靶dna之间存在不同数目的错配。引起的脱靶问题，限制cas9编辑技术在临床中的应用。已有的研究指出通过控制crispr-cas9系统的作用时间，既在达到切割编辑目的后关闭crispr-cas9系统，可以避免过度切割的脱靶效应。

经过改造的crispr/cas9也可以用于对靶基因的表达进行激活或者抑制，将cas9蛋白进行突变后得到的没有切割活性的突变体dcas9具有在sgrna序列引导下结合目标基因的但不切割的特性，研究人员将dcas9与转录激活结构域vp64融合后构建的dcas9-vp64分子成为可以靶向特定基因的转录激活因子。同理将转录抑制结构域krab融合在dcas9的3’末端，获得的dcas9-krab分子则成为了可以靶向特定基因的转录抑制因子。但在基因治疗和功能研究中，对特定基因的表达调控往往需要更精准的时间控制。所以对于dcas9-vp64或dcas9-krab介导的基因表达也需要有效的控制手段。

对crispr/cas9系统介导的基因组编辑以及dcas9-vp64或dcas9-krab介导的基因表达激活和抑制的主要调控段是通过对cas9类蛋白的转录，转录后，翻译后等水平进行调节。如davis等人对cas9蛋白进行了改造，使其在药物4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)存在时发生翻译后的蛋白编辑，产生活性的cas9蛋白，从而启动crispr/cas9系统进行基因编辑。也有研究者使用四环素调控系统调控cas9蛋白或者sgrna表达来调控crispr/cas9活性，但这样的调控系统会需要引入额外的顺式调控元件和反式调节因子。

通过不引入额外的顺式调控元件和反式调节因子的途径调控sgrna进而控制crispr/cas9活性的方法为一新的策略。申请人研究发现，通过构建一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体，在进行基因编辑和转录调控时，通过在培养基中加入适体核酶p1-f5的配体茶碱，引起该适体核酶自我剪切从而造成sgrna的断裂，使sgrna引导的crispr/cas9系统失活。这样的调控方法避免了额外的顺式调控元件和反式调节因子的引入，该载体质粒上所占体积小，同时具有受配体药物调控的特征。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体，其特征在于，在表达的sgrna-az2.0骨架的四碱基环(tetraloop)以及茎环2(stemloop2)位置插入适体核酶p1-f5；通过kpnⅰ与ecorⅰ位点和ecorⅰ与speⅰ位点，分别将u6启动子、sgrna-az2.0骨架依次连入载体puc19/ekshl中，获得载体pu6-sgrna-az2.0；使用bsaⅰ酶切载体pu6-sgrna-az2.0，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgrna序列，获得pu6-sgrna-az2.0-targetsite。

根据本发明，所述插入的适体核酶是p1-f5的序列为：

ggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcc。

上述sgrna-az2.0骨架的完整序列为：

gaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。

上述u6启动子序列如下：

ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattc

上述的载体pu6-sgrna-az2.0完整序列为：

ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。

根据本发明，所述粘性末端连入针对目标基因编辑靶点的长度为19或20个核苷酸，退火构成其sgrna片段的引物序列如下：

glrx3：accgtgaggataggtaggccaac与aaacgttggcctacctatcctca；

vegfa：accgggtgagtgagtgtgtgcgtg与aaaccacgcacacactcactcacc；

pgrnpro：accgcgtcgggacagcctcagca与aaactgctgaggctgtcccgacg。

所述的针对目标基因的sgrna序列是针对目标基因编辑靶点，它们是针对glrx3基因，vegfa基因或者pgrn基因启动子中的任意一种。但并不只限于这三种。

根据申请人的研究表明，采用本发明构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-targetsite与载体hcas9共转染hek293细胞，进行了对目标基因的编辑实验，实验结果表明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-targetsite与hcas9载体共转染细胞后，对目的基因可以进行有效编辑，并且其编辑活性受到茶碱的有效调控；采用本发明构建方法构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-targetsite与载体phageef1αdcas9-krab以及载体pgl3-pgrnpro-luc共转hek293细胞进行基因转录抑制的调控实验，实验结果表明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-targetsite与载体phageef1αdcas9-krab以及载体pgl3-pgrnpro-luc共转染细胞后，可以对人pgrn启动子启动的荧光素酶的表达起到抑制作用，并且其抑制活性受到茶碱的有效调控。

本发明所构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体，能有效介导cas9蛋白的基因组编辑作用，并使其编辑活性受到茶碱调控；且能介导dcas9-krab蛋白对目的基因的转录抑制，其抑制活性受到茶碱调控。

附图说明

图1是sgrna-az2.0骨架的结构图。

图2是pu6-sgrna-az2.0载体结构图。

图3是pu6-sgrna-az2.0-targetsite载体结构图。

图4是实施例1构建的pu6-sgrna-az2.0-glrx3载体介导的目标基因编辑效率检测图。

图5是实施例2构建的pu6-sgrna-az2.0-vegfa载体介导的目标基因编辑效率检测图。

图6是pgl3-pgrnpro-luc载体结构图。

图7是实施例3构建的pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro载体介导的目标基因转录抑制活性检测图。

下面结合附图和实施例来对本发明做进一步详细说明。

具体实施方式

本发明的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体，在表达的sgrna-az2.0骨架的四碱基环(tetraloop)以及茎环2(stemloop2)位置插入适体核酶p1-f5；通过kpnⅰ与ecorⅰ位点和ecorⅰ与speⅰ位点分别将u6启动子、sgrna-az2.0骨架依次连入载体puc19/ekshl中，获得载体pu6-sgrna-az2.0；使用bsaⅰ酶切载体pu6-sgrna-az2.0，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgrna序列，获得载体pu6-sgrna-az2.0-targetsite(图3)。

构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体，具体步骤为：

(1)合成在四碱基环(tetraloop)以及茎环2(stemloop2)位置插入适体核酶p1-f5的sgrna-az2.0骨架；

根据已知序列和发明人设计，合成5’末端带有ecorⅰ位点，3’末端带有speⅰ位点的sgrna-az2.0的骨架，这个骨架中适体核酶p1-f5分别插入在原始骨架四碱基环(tetraloop)以及茎环2(stemloop2)的位置。

(2)合成u6启动子

根据已知序列合成5’末端带有kpnⅰ，3’末端带有ecorⅰ位点的u6启动子；

(3)构建pu6-sgrna-az2.0载体

将u6启动子片段经过kpnⅰ与ecorⅰ酶切，sgrna-az2.0的片段经过ecorⅰ与speⅰ酶切，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收两片段，载体puc19/ekshl(xiao，etal.，2016)通过kpnⅰ与speⅰ酶切后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体；使用t4连接酶将片段u6启动子，sgrna-az2.0与载体puc19/ekshl连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna-az2.0。

(4)构建靶向人glrx3基因的pu6-sgrna-az2.0-glrx3载体

设计的靶向人glrx3基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

正向引物序列为：accgtgaggataggtaggccaac；

反向引物序列为：aaacgttggcctacctatcctca。

两条引物用超纯水稀释成浓度为20μm的溶液，各取20μl混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人glrx3基因的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna-az2.0经bsaⅰ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人glrx3基因的sgrna片段与经bsaⅰ酶切的载体pu6-sgrna-az2.0连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna-az2.0-glrx3。

(5)构建靶向人vegfa基因的pu6-sgrna-az2.0-vegfa载体

靶向人vegfa基因的sgrna片段由引物退火形成(fu，etal.，2013)，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

正向引物序列为：accgggtgagtgagtgtgtgcgtg；

反向引物序列为：aaaccacgcacacactcactcacc。

两条引物用超纯水稀释成浓度为20μm的溶液，各取20μl混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人vegfa基因的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna-az2.0经bsaⅰ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人vegfa基因的sgrna片段与经bsaⅰ酶切的载体pu6-sgrna-az2.0连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna-az2.0-vegfa。

(6)构建靶向人pgrn基因启动子的pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro载体

靶向人pgrn基因启动子的sgrna片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

正向引物序列为：accgcgtcgggacagcctcagca；

反向引物序列为：aaactgctgaggctgtcccgacg。

两条引物用超纯水稀释成浓度为20μm的溶液，各取20μl混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人pgrn基因启动子的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna-az2.0经bsaⅰ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人pgrn基因启动子的sgrna片段与经bsaⅰ酶切的载体pu6-sgrna-az2.0连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro。

以下是发明人给出的具体实施例，需要说明的是，以下的实施例是较佳的例子，本发明并不限于这些实施例

实施例1：

本实施例构建的表达靶向人glrx3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体如下：

表达的sgrna-az2.0骨架(骨架结构图如图1所示)中，在四碱基环(tetraloop)以及茎环2(stemloop2)位置插入适体核酶p1-f5，其中适体核酶p1-f5序列如下：

ggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcc。

sgrna-az2.0骨架的完整序列为：

gaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。

u6启动子序列如下：

ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattc。

载体pu6-sgrna-az2.0完整序列为：

ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。

在两个bsaⅰ中插入的靶向人glrx3基因的sgrna序列如下：

tgaggataggtaggccaac。

上述的表达靶向人glrx3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体构建方法步骤如下：

1、合成在四碱基环(tetraloop)以及茎环2(stemloop2)位置插入适体核酶p1-f5的sgrna-az2.0骨架；

根据已知序列和发明人设计，由江苏金唯智公司合成5’末端带有ecorⅰ位点，3’末端带有speⅰ位点的sgrna-az2.0的骨架，在sgrna-az2.0骨架中，适体核酶p1-f5分别插入在原始骨架四碱基环(tetraloop)及茎环2(stemloop2)的位置。

2、合成u6启动子

由江苏金唯智公司合成5’末端带有kpnⅰ，3’末端带有ecorⅰ位点的u6启动子。

3、构建pu6-sgrna-az2.0载体

将u6启动子片段经过kpnⅰ与ecorⅰ酶切，sgrna-az2.0的片段经过ecorⅰ与speⅰ酶切，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收两片段，载体puc19/ekshl(xiao，etal.，2016)通过kpnⅰ与speⅰ酶切后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体；使用t4连接酶将片段u6启动子，sgrna-az2.0与载体puc19/ekshl连接，连接条件为：puc19/ekshl载体0.5μl，片u6启动子段2μl，sgrna-az2.0片段2μl，2×t4dna快速连接酶缓冲液5μl，t4dna快速连接酶0.5μl，25℃反应1个小时后转化感受态细胞dh5α，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pu6-sgrna-az2.0载体，该pu6-sgrna-az2.0载体结构图如图2所示。

4、构建靶向人glrx3基因的pu6-sgrna-az2.0-glrx3载体

设计的靶向人glrx3基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

p1：accgtgaggataggtaggccaac；

p2：aaacgttggcctacctatcctca。

两条引物用超纯水稀释成浓度为20μm的溶液，各取20μl混合后于室温退火1小时。获得的片段即为靶向人glrx3基因的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna-az2.0经bsaⅰ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人glrx3基因的sgrna片段与经bsaⅰ酶切的载体pu6-sgrna-az2.0连接，连接条件为：pu6-sgrna-az2.0载体0.5μl，靶向人glrx3基因的sgrna片段2μl，2×t4dna快速连接酶缓冲液5μl，t4dna快速连接酶0.5μl，去离子水2μl，25℃反应1个小时后转化感受态细胞dh5α，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb培养液中，14小时～16小时后，经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pu6-sgrna-az2.0-glrx3。

实施例2：

本实施例构建的表达靶向人vegfa基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体如下：

实施例1中靶向人glrx3基因的sgrna序列由靶向人vegfa基因的sgrna序列替换。在两个bsaⅰ中插入的靶向人vegfa基因的sgrna序列如下：

ggtgagtgagtgtgtgcgtg。

载体的其它结构与实施例1相同。

其构建方法步骤4中，构建靶向人vegfa基因的pu6-sgrna-az2.0-vegfa载体的方法是：

靶向人vegfa基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

p3：accgggtgagtgagtgtgtgcgtg；

p4：aaaccacgcacacactcactcacc。

其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人vegfa基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-vegfa。

实施例3：

本实施例构建的表达靶向人pgrn基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体如下：

实施例1中靶向人glrx3基因的sgrna序列由靶向人pgrn基因启动子的sgrna序列替换。在两个bsaⅰ中插入的靶向人pgrn基因启动子的sgrna序列如下：

cgtcgggacagcctcagca。

载体其它结构与实施例1相同。

其构建方法步骤4中，构建靶向人pgrn基因启动子的pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro载体的方法是：

靶向人pgrn基因启动子的sgrna片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

p5：accgcgtcgggacagcctcagca；

p6：aaactgctgaggctgtcccgacg。

其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人pgrn基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro。

为了验证构建的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体的有益效果，发明人采用实施例1构建的表达靶向人glrx3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-glrx3，实施例2构建的表达靶向人vegfa基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-vegfa，实施例3构建的表达靶向人pgrn基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro进行了实验，实验情况如下：

1、表达靶向人glrx3基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体对目标基因的编辑效率和药物调控效果

发明人将实施例1中构建的载体pu6-sgrna-az2.0经过ecorⅰ与speⅰ双酶切，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，然后插连入由苏州金唯智公司合成的5’端带有ecorⅰ位点，3’端带有speⅰ位点的不带有适体核酶修饰的sgrna骨架片段，该片段序列如下：

gaattcggtctccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt。

所获得的载体命名为pu6-sgrna，该载体为表达不带有适体核酶修饰的sgrna的载体，其表达的sgrna不会受到茶碱药物的调控，在本实验中作为对照。载体pu6-sgrna中也插入了靶向人glrx3基因的sgrna序列，其方法与实施例1中构建方法步骤4相同，获得的载体命名为pu6-sgrna-glrx3。接种hek293细胞于24孔板，每孔1×10⁵个细胞，共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9(addgene，#41815)与pu6-sgrna-az2.0-glrx3进入细胞；而同时，共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9与pu6-sgrna-glrx3进入细胞，作为阳性对照。细胞培养基中加入或不加入终浓度为3mm的茶碱。48小时后提取细胞基因组dna。使用巢式pcr扩增基因组中包含编辑位点的区域。

外巢反应：

引物：

p7:actcaaactggaggctggag；

p8:gctgcacccagtaaaacacga。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：94℃，30秒，98℃，10秒70℃，30秒(每个循环下降1℃)72℃，30秒，10个循环，98℃，10秒，60℃，30秒，72℃，30秒，25个循环。

内巢巢反应：

引物：

p9:aggtaccccccagtctctgggattaca；

p10:aagatctaaaagcaaagcagatcctcca。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：94℃，30秒，98℃，10秒，60℃，30秒，72℃，30秒，30个循环。

所获得的pcr产物经过pcr仪器变性退火的程序是：

95℃，5分钟；95℃-85℃，每秒降低2℃(-2℃/s)；85℃-25℃，每秒降低0.1℃(-0.1℃/s)。

产物经过质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收后，测量含量，然后使用经典的t7endonucleasei内切酶检测法检测各组中目标基因的编辑效率。具体方法如下：每组取pcr产物dna500ng，0.5μl的t7endonucleasei(neb,m0302s)内切酶，2μl的10×buffer，补水至总体积20μl。37℃，反应20分钟。结束后进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。t7endonucleasei内切酶能够将pcr产物中不配对的部分切断，如果pcr产物被切开成两条小的条带，则说明其在目标位置发生了基因组编辑，产生了碱基突变，而两条小的条带的亮度越亮，则说明基因组编辑的效率越高。结果见图4所示，在不是加入药物茶碱时，pu6-sgrna-az2.0-glrx3与pu6-sgrna-glrx3均能介导cas9进行基因组编辑，但加入茶碱后，载体pu6-sgrna-az2.0-glrx3介导cas9进行基因组编辑的效应被明显的削弱，而pu6-sgrna-glrx3介导cas9进行基因组编辑的效应则无明显变化。此结果说明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体介导cas9对人glrx3位点基因组编辑的效应可有有效的被茶碱控制。

2、表达靶向人vegfa基因的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体对目标基因的编辑效率和药物调控效果

发明人在载体pu6-sgrna中也插入了靶向人vegfa基因的sgrna序列，其方法与实施例1中构建方法步骤4相同，获得的载体命名为pu6-sgrna-vegfa。接种hek293细胞于24孔板，每孔1×10⁵个细胞，共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9与pu6-sgrna-az2.0-vegfa入细胞；而同时，共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9与pu6-sgrna-vegfa进入细胞，作为阳性对照。细胞培养基中加入或不加入终浓度为3mm的茶碱。48小时后收取细胞提取细胞基因组dna。使用降落pcr扩增基因组中包含编辑位点的部分。

引物：

p11:tccagatggcacattgtcag；

p12:agggagcaggaaagtgaggt。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：94℃30秒，98℃10秒70℃30秒(每个循环下降1℃)72℃30秒10个循环，98℃10秒60℃30秒72℃30秒，25个循环。

所获得的pcr产物经过pcr仪器变性退火，t7e1内切酶检测法检测各组中目标基因的编辑效率。其具体方法与实验1中相同。结果见图5所示，图中显示，在不是加入药物茶碱时，pu6-sgrna-az2.0-vegfa与pu6-sgrna-vegfa均能介导cas9进行基因组编辑，但加入茶碱后，载体pu6-sgrna-az2.0-vegfa介导cas9进行基因组编辑的效应被明显的削弱，而pu6-sgrna-vegfa介导cas9进行基因组编辑的效应则无明显变化。此结果说明，本发明的表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体介导cas9对人vegfa位点基因组编辑的效应可有有效的被茶碱控制。

上述实验1和实验2说明，表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体介导cas9对目标位点基因组编辑的效应可有效的被茶碱控制。

3、表达靶向人pgrn基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体介导dcas9-krab蛋白对目标基因转录抑制效率和药物调控效果

首先，发明人构建了人pgrn启动子启动表达萤光素酶的载体pgl3-pgrnpro-luc，方法简述如下：

使用引物

p13：ggtaccaggatacttctttgttg；

p14：agatctctcctccctgcttcctct。

以人胚肾hek293细胞系的基因组为模板，扩增人pgrn启动子，其序列如下：

ggtaccaggatacttctttgttgtgggggattgttctgtgtgtcgtgtgatgtttagtgggattgctggcccttacctaccagatgccagtgtccctccaccctgagttgtgacaacccagattgtctccagacactcctaaatgtccctggccggcaaaattgccgctgctcaagaatcacggctttgacgattagactttgtgatatttgtttcagtctgtttaggttttttttcttctacctgtatttttttctggttctgggtggttgtaattagtaggttattgatcgattcacctaacatttcatgaaagtttcatgtgtgtgtgtgtttcaatagaagcataaactatactccctagtctcaagatacacaggaaggaaaataagcacaaatgtgtcaccagggcacagactagtactaggtcctcagcaggccaggtgtcttatccgctgtctgggtctgctctagctccaggcttagaacccctgccacacgactccacagctcggttggcaccctttccctcctccgacttctgctgcctcgagcttggttagccatccccctgcccctgcctcatcctcagctccagttccttgctcaggctgcagcagtctccatcccctgtgcagacactgccgttcctccacggcccagtatcaggctttccctgggcctctcctctctcctggcccatctcccatcatccatctctgcctggcccaggccctttggcaccaagcaggctgactcttgtcactggctaatctgttctgtggtacattttctctcctcaccctcccatatcaattcctcgaaggcagggccgatctggagactaggaagccacttctctttcgacagcccccaccacagcccagcccgtgccaggcacccagcagctcctgaagcccactggcattgaacatggcattcaatccctgccaagcctgcccttcccatctggtttcccagggctcttcccaacacctcctcctccacctgccagttaaaatcttcccagactcagctcaaggagatgctcctaaggtggaatgaaatctcttcttccccacctggagacaatctacttcctctccctacacctggcaactggcgcacaaccttgtatcttaaattagattcagcctgagactgtctcccaccaatccctgctccctgtcctgctgagcaccttgaggaaagggctttggggctgtttatctttgtcctggaaaccatccttcaactcactctggggcctgcctagcatgtcaaccgagtttggagaatagggcagaatagggcaggacaggacaggacaagacagggcaggataggataggagcgagccagctcagtagctcacatttgtaatcccagcgccttggggggctgcggtaggagaatcgctttgggagcaggagttgcaggccgcagtgagctatgatcagcttgggcgactgagcgagaccctgtctctaaaacaaacacacaagtccgggcgcggtggctcatgcctgtaatcttagcactttgggaggccgaggtgggcggatcacgaggtcaagaaatcgagaccatcctggccaacatggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagctgggcgtggtggtgcgcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcgcttgaacccgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctggcgacagagtgagactccgtctcagaacaaacaaacaaaaggatagaaaggcgagcacaaatattcccaattcataacactccctcgcactgtcaatgccccagacacgcgctatcatctctagcaaactcccccaggcgcctgcaggatgggttaaggaaggcgacgagcaccagctgccctgctgaggctgtcccgacgtcacatgattctccaatcacatgatccctagaaatggggtgtggggcgagaggaagcagggaggagagatct。

将pcr产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收，克隆至pgemt-easy载体，测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pgemt-easy-pgrnpro；将载体pgemt-easy-pgrnpro经过kpnⅰ与bglⅱ双酶切后，经过1％的琼脂糖凝胶电泳后回收pgrnpro片段，将其连接入经同样酶切的pgl3-basic载体上，经转化后，挑取克隆，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pgl3-pgrnpro-luc(载体结构如图6所示)。

发明人在已有载体pu6-sgrna中也插入了靶向人pgrn基因启动子的sgrna序列，其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pu6-sgrna-pgrnpro。

接种hek293细胞于24孔板，每孔1×10⁵个细胞，共同转染表达dcas9-krab的蛋白的载体phageef1αdcas9-krab(addgene，#50919)，pgl3-pgrnpro-luc与pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro入细胞；而同时，共同转染载体phageef1αdcas9-krab，pgl3-pgrnpro-luc，pu6-sgrna-pgrnpro进入细胞，作为阳性对照。细胞培养基中在不同时间点加入浓度为3mm的茶碱。24小时后收取细胞，使用试剂盒测试不同时间点加入茶碱后，各组细胞的荧光素酶表达变化，结果由实验组值与对照组值之间的比值来呈现。pgl3-pgrnpro-luc上的pgrn启动子的活性会被靶向其启动子的sgrna和具有转录抑制作用的dcas-krab9蛋白所抑制，而加入茶碱后pu6-sgrna-az2.0-pgrnpro表达的靶向人pgrn基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna中包含的适体核酶会发生自剪切，使整个系统对pgrn启动子的抑制活性解除，所以实验结果中荧光素酶活力比值扩大，说明实验组中pgrn启动子的活性提高，即说明药物加入解除了该系统中的转录抑制的作用。结果见图7，结果表明，加入茶碱后的2个小时荧光素酶报告基因的活力就开始快速上升。

上述实验3说明，本发明的表达靶向人pgrn基因启动子的受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体介导dcas9-krab的转录抑制作用可以被茶碱有效调控。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>陕西师范大学

<120>一种表达受茶碱调控的适体核酶修饰型sgrna的载体及应用

<160>

<210>1

<211>108

<212>适体核酶p1-f5

<213>dna

<220>

<400>1

ggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcc

<210>2

<211>309

<212>sgrna-az2.0骨架:

<213>

<220>

<400>2

gaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt

<210>3

<211>284

<212>u6启动子

<213>

<220>

<400>3

ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattc

<210>4

<211>587

<212>pu6-sgrna-az2.0

<213>

<220>

<400>4

ggtaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttttagagctaggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggcctagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttggccctgagatgcaggtacatccagctgatgagtcccaaataggacgaaagccataccagccgaaaggcccttggcagggttcctggattccactgctatccacggccaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt

<210>5

<211>23

<212>glrx3正向引物

<213>

<220>

<400>5

accgtgaggataggtaggccaac

<210>6

<211>23

<212>glrx3反向引物

<213>

<220>

<400>6

aaacgttggcctacctatcctca

<210>7

<211>24

<212>vegfa正向引物

<213>

<220>

<400>7

accgggtgagtgagtgtgtgcgtg

<210>8

<211>24

<212>vegfa反向引物

<213>

<220>

<400>8

aaaccacgcacacactcactcacc

<210>9

<211>23

<212>pgrnprosgrna正向引物

<213>

<220>

<400>9

accgcgtcgggacagcctcagca

<210>10

<211>23

<212>pgrnprosgrna反向引物

<213>

<220>

<400>10

aaactgctgaggctgtcccgacg

<210>11

<211>101

<212>sgrna骨架片段

<213>

<220>

<400>11

gaattcggtctccgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt

<210>12

<211>20

<212>glrx3编辑区域扩增外巢引物p7

<213>

<220>

<400>12

actcaaactggaggctggag

<210>13

<211>21

<212>glrx3编辑区域扩增外巢引物p8

<213>

<220>

<400>13

gctgcacccagtaaaacacga

<210>14

<211>27

<212>glrx3编辑区域扩增内巢引物p9

<213>

<220>

<400>14

aggtaccccccagtctctgggattaca

<210>15

<211>28

<212>glrx3编辑区域扩增内巢引物p10

<213>

<220>

<400>15

aagatctaaaagcaaagcagatcctcca

<210>16

<211>20

<212>vegfa编辑区域扩增引物p11

<213>

<220>

<400>16

tccagatggcacattgtcag

<210>17

<211>20

<212>vegfa编辑区域扩增引物p12

<213>

<220>

<400>17

agggagcaggaaagtgaggt

<210>18

<211>23

<212>pgrn启动子扩增引物p13

<213>

<220>

<400>18

ggtaccaggatacttctttgttg

<210>19

<211>24

<212>pgrn启动子扩增引物p14

<213>

<220>

<400>19

agatctctcctccctgcttcctct

<210>20

<211>2033

<212>pgrn启动子

<213>

<220>

<400>20

ggtaccaggatacttctttgttgtgggggattgttctgtgtgtcgtgtgatgtttagtgggattgctggcccttacctaccagatgccagtgtccctccaccctgagttgtgacaacccagattgtctccagacactcctaaatgtccctggccggcaaaattgccgctgctcaagaatcacggctttgacgattagactttgtgatatttgtttcagtctgtttaggttttttttcttctacctgtatttttttctggttctgggtggttgtaattagtaggttattgatcgattcacctaacatttcatgaaagtttcatgtgtgtgtgtgtttcaatagaagcataaactatactccctagtctcaagatacacaggaaggaaaataagcacaaatgtgtcaccagggcacagactagtactaggtcctcagcaggccaggtgtcttatccgctgtctgggtctgctctagctccaggcttagaacccctgccacacgactccacagctcggttggcaccctttccctcctccgacttctgctgcctcgagcttggttagccatccccctgcccctgcctcatcctcagctccagttccttgctcaggctgcagcagtctccatcccctgtgcagacactgccgttcctccacggcccagtatcaggctttccctgggcctctcctctctcctggcccatctcccatcatccatctctgcctggcccaggccctttggcaccaagcaggctgactcttgtcactggctaatctgttctgtggtacattttctctcctcaccctcccatatcaattcctcgaaggcagggccgatctggagactaggaagccacttctctttcgacagcccccaccacagcccagcccgtgccaggcacccagcagctcctgaagcccactggcattgaacatggcattcaatccctgccaagcctgcccttcccatctggtttcccagggctcttcccaacacctcctcctccacctgccagttaaaatcttcccagactcagctcaaggagatgctcctaaggtggaatgaaatctcttcttccccacctggagacaatctacttcctctccctacacctggcaactggcgcacaaccttgtatcttaaattagattcagcctgagactgtctcccaccaatccctgctccctgtcctgctgagcaccttgaggaaagggctttggggctgtttatctttgtcctggaaaccatccttcaactcactctggggcctgcctagcatgtcaaccgagtttggagaatagggcagaatagggcaggacaggacaggacaagacagggcaggataggataggagcgagccagctcagtagctcacatttgtaatcccagcgccttggggggctgcggtaggagaatcgctttgggagcaggagttgcaggccgcagtgagctatgatcagcttgggcgactgagcgagaccctgtctctaaaacaaacacacaagtccgggcgcggtggctcatgcctgtaatcttagcactttgggaggccgaggtgggcggatcacgaggtcaagaaatcgagaccatcctggccaacatggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaattagctgggcgtggtggtgcgcgcctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcgcttgaacccgggaggcagaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctggcgacagagtgagactccgtctcagaacaaacaaacaaaaggatagaaaggcgagcacaaatattcccaattcataacactccctcgcactgtcaatgccccagacacgcgctatcatctctagcaaactcccccaggcgcctgcaggatgggttaaggaaggcgacgagcaccagctgccctgctgaggctgtcccgacgtcacatgattctccaatcacatgatccctagaaatggggtgtggggcgagaggaagcagggaggagagatct