一种乙酰酰胺化六肽、及其纯化方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种乙酰酰胺化六肽、及其纯化方法和应用。

背景技术：

随着地球环境的不断变化，大气臭氧层也遭到较为严重的破坏，由此导致紫外线(ultraviolet，uv)辐射强度有所增强。另一方面，随着人们生活方式的变化，户外运动、日光浴机会逐渐增多，因而人们将遭受更多的的紫外线照射，这样一来造成光损害性皮肤病也逐渐增多。由于紫外线照射而对皮肤造成的日晒伤急性损伤和光老化、皮肤癌等的慢性累积性伤害，对人类健康构成潜在威胁。

当今皮肤老化问题已日益引起人们的重视，因此，开发具有保护皮肤免受光损伤、预防和延缓皮肤衰老的组分或产品，已成为目前医学研究的热点。

小分子肽是一类具有高活性的肽类物质，小分子肽可以以完整的形式被机体吸收；主动吸收、低耗或不需消耗能量的特点；能够直接进入血液循环并送到人体各个部位，广泛应用于生物医药领域。由于具有亲水性，蛋白质通常难以跨生物膜转运，因此，提高其膜渗透性改善其细胞内化率是重要的科学问题。通过对小分子肽进行修饰使其性能得以改善，也是本领域技术人员的研究方向之一。其中，多肽n-端乙酰化和c-端酰胺化是其结构修饰的主要形式。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术中存在的问题，提供一种乙酰酰胺化六肽，其具有良好的抗氧化活性和抗皮肤光老化活性，且能预防或改善uvb引起的皮肤损伤。

本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：

一种乙酰酰胺化六肽，命名为ac-gmccsr-nh2，分子量696.86da，其化学结构式如下：

其中，缩写为ac表示英文名称为acetyl，中文名称为乙酰基；nh2表示英文名为amidegroup，中文名称为酰胺基；gly表示英文名称为glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；met表示英文名称为methionine，中文名称为甲硫氨酸的氨基酸的相应残基；cys表示英文名称为cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸的相应残基；ser表示英文名称为serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；arg表示英文名称为arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基。

本发明还提供上文所述的乙酰酰胺化六肽的纯化方法，该方法包括如下步骤，

将待纯化的乙酰酰胺化六肽(为合成的乙酰酰胺化六肽的粗肽)上样至色谱柱；

以流动相a和流动相b为洗脱液进行梯度洗脱，其中流动相a为含有0.08～0.12％(体积)三氟乙酸的乙腈溶液，流动相b为含有0.08～0.12％(体积)三氟乙酸的水；梯度洗脱程序为：流动相a+流动相b的体积比之和为100％，流动相a的初始体积比例为8～12％，在上样后的第0.01min到25min内，流动相a的体积比例上升到30～40％，在25min到25.1min内，流动相a的体积比例上升为100％，保持100％运行至第30min停止，检测波长为220nm；收集目标峰的多肽溶液。

进一步的，所述色谱柱为c18色谱柱。

优选的，流动相a为含有0.1％(体积)三氟乙酸的乙腈溶液，流动相b为含有0.1％(体积)三氟乙酸的水；梯度洗脱过程中，流动相a的初始体积比例为10％，在上样后的第0.01min到25min内，流动相a的体积比例上升到35％。

本发明还提供所述的乙酰酰胺化六肽的应用，所述乙酰酰胺化六肽可在制备抗皮肤光老化、或具有皮肤保湿功效的护肤品中应用。

本发明还提供所述乙酰酰胺化六肽在制备用于预防或修复由于uvb引起的hacat细胞光损伤的制剂中应用。

本发明还提供所述乙酰酰胺化六肽在制备抗氧化制剂中应用。

本发明还提供所述乙酰酰胺化六肽在制备用于预防或改善由于uvb辐射而引起的皮肤损伤的制剂中应用。

本发明还提供一种组合物，所述组合物中含有如上文所述的乙酰酰胺化六肽。

进一步的，所述组合物为化妆品、食品或药物。

本发明采用抗氧化化学模型(abts自由基)、人表皮永生化细胞(hacat)及其uvb老化模型、昆明小鼠及其背部皮肤uvb老化模型等方法，测试本发明乙酰酰胺化六肽的抗氧化活性以及抗皮肤光老化活性。实验证实，本发明的乙酰酰胺化六肽具有较强的抗氧化活性，对uvb老化的hacat细胞的保护作用显著强于修饰前的六肽。本发明的乙酰酰胺化六肽具备在抗皮肤光老化化妆品中应用的潜力，不仅具有预防或改善uvb引起的皮肤损伤，保持皮肤水分，降低皮肤中mda含量，增强皮肤组织中sod活力、cat活力、gsh-px活力，并降低细胞质基质中mmp-1和mmp-3的表达量。

本发明提供的具有抗氧化活性和抗皮肤光老化活性的合成多肽乙酰酰胺化六肽，可应用于食品、生物制药和化妆品等领域。

附图说明

图1为乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)的纯度鉴定hplc图。

图2为乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)的esi-ms图谱。其中横坐标为m/z(质荷比值)、纵坐标为intensity(信号强度)。

图3中a-d为小鼠背部皮肤的宏观表征图；a1-d1为皮肤组织病理学切片检查结果(200x)。其中，a和a1为仅涂抹溶剂的正常对照组；b和b1为uvb老化的模型组；c和c1为加了阳性对照的保护组；d和d1为加了乙酰酰胺化六肽的保护组。

图4为皮肤表皮厚度测定图。注：*代表与正常组差异显著；#代表与模型组差异显著。

图5为皮肤水分含量测定图。注释：*代表与正常组相比差异显著；#代表与模型组相比差异显著。

图6为皮肤组织mda含量测定图。注释：*代表与正常组差异显著；#代表与模型组差异显著。

图7为皮肤组织sod活力的测定图。注释：*代表与正常组差异显著；#代表与模型组差异显著。

图8为皮肤组织cat活力的测定图。注释：*代表与正常组差异显著；#代表与模型组差异显著。

图9为皮肤组织gsh-px活力的测定图。注释：*代表与正常组差异显著；#代表与模型组差异显著。

图10为皮肤组织mmp-1含量的测定图。注释：*代表与正常组差异显著；#代表与模型组差异显著。

图11为皮肤组织mmp-3含量的测定图。注释：#代表与模型组差异显著。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

以下实施例中所用细胞或试剂若未特别说明，均为商业渠道购买获得；实施例中未特别说明的实验操作均为本领域常规实验操作。实施例中所述的六肽均为gmccsr，乙酰酰胺化六肽均为ac-gmccsr-nh2。

通过多肽固相合成法合成ac-gmccsr-nh2，采用本领域常规多肽固相合成方法，具体可以通过商业化的生物合成公司来完成该多肽的合成。氨基酸序列采用本领域常规的标准fmoc方案，下面对其进行介绍以供参考。

多肽固相合成

选用rinkamide树脂(上海杰肽生物科技有限公司)，由于rinkamide树脂自带有氨基，可以直接和氨基酸反应形成稳定的酰胺键。按照氨基酸序列ac-gly-met-cys-cys-ser-arg-nh2的特征，先将arg的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后arg的氨基和ser的羧基缩水反应，处理后，再添加cys，ser的氨基和cys的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个gly氨基酸后，再切除树脂即得到酰胺化六肽ac-gmccsr-nh2。氨基酸链合成完毕后，将活化好的乙酸在醋酸酐和吡啶的催化下与肽链n端氨基反应，进行乙酰化反应，即得乙酰酰胺化六肽。

乙酰酰胺化六肽的纯化

对通过多肽固相合成的乙酰酰胺化六肽ac-gmccsr-nh2进行纯化，以便获得纯度95％以上的产品。本发明按照如下方法纯化：采用高效液相色谱纯化乙酰酰胺化六肽ac-gmccsr-nh2，将ac-gmccsr-nh2粗肽经kromasilc18-5(4.6×250mm)色谱柱进行梯度洗脱纯化，流速为1.0ml/min。以溶剂a为流动相a，溶剂b为流动相b，其中，流动相a为含有0.1％(体积)三氟乙酸的乙腈溶液；溶剂b为含有0.1％(体积)三氟乙酸的水。梯度洗脱如下：a+b的体积总量为100％，a初始体积比例为10％，在上样后的0.01min到25min内，a的比例上升到35％，在25min到25.1min内，a的比例上升为100％，保持100％运行至30min停止，检测波长为220nm。收集目标峰的多肽溶液，液氮速冷，然后冻干。得到纯度95％以上的产品，纯度鉴定hplc结果见图1，并经esi-ms鉴定结构(如图2所示)。经鉴定，其结构式为：

多肽的抗氧化活性评价方法介绍

abts自由基清除活性测定：用pbs(ph7.4)配置5mmol/l的abts溶液，加入过量的mno2制备自由基，30℃放置12h，随后在4500r/min条件下离心10min，收集上层清液，用0.2μm尼龙膜过滤。置于-20℃备用，作为abts⁺储备液。用于测试前，需用pbs溶液将abts⁺储备液稀释至所需浓度。

采用96孔板测定abts自由基的清除活性：加入20μl水+180μlabts溶液，进行全波扫描，扫描确定最大吸收波长为736nm(酶标仪程序：振荡30s，测定波长范围500-800nm)。测试样品的abts自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到工作液。样品的测定：加入20μl不同浓度的样品(1-100μg/ml)和180μlabts工作液。样品的吸光度值记为a样品，模型组的吸光度值(20μl蒸馏水+180μlabts工作液)记为a模型，设定空白组，吸光度值记为a空白。

根据下式计算abts自由基清除率：abts自由基清除率＝(a模型-a样品)/(a模型-a空白)

实施例1abts自由基清除活性测试

参照上述方法评价乙酰酰胺化六肽及六肽的abts自由基清除活性。

采用96孔板测定abts自由基的清除活性：设定检测波长736nm，反应体系为20μl水+180μlabts溶液，测试六肽和乙酰酰胺化六肽的abts自由基清除活性时，调节体系吸光度值至0.70±0.02得到abts工作液。加入20μl浓度为1-100μg/ml的样品和180μlabts工作液，每5min采集一次数据，一共反应40min，反应完毕后，根据上式计算abts自由基清除率。另外，还设置了阳性对照组，以维生素c为测试样品。

经检测，六肽gmccsr对abts自由基的半数清除浓度(ic50值)为16.94μm，乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)对abts自由基的ic50值为17.82μm，而阳性对照维生素c的ic50值为26.18μm。结果表明，乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)和六肽gmccsr一样具备较强的抗氧化活性，且强于阳性对照，具备在食品、药品、化妆品中应用的潜力。

实施例2

取人表皮永生化细胞hacat一瓶，用含有0.25％edta的胰酶将其消化下来，离心，用完全培养基悬浮细胞，用血球计数器计数，配成浓度为5×10⁴cells/ml细胞悬液，取96孔板一块，每孔100μl，即每孔5000个细胞。在37℃、co2体积分数为5％的饱和湿度培养箱中培养48h。同时，分别配制浓度为100μg/ml的阳性对照五胜肽(matrixyl，palm-kttks)、乙酰酰胺化六肽溶液(ac-gmccsr-nh2)、六肽溶液(gmccsr)，每孔加入200μl样品溶液(正常对照组，则用完全培养基替代)，孵育48h，吸弃样品，用pbs洗1遍后，采用mtt法检测细胞存活率。实验结果见表1所示。

表1乙酰酰胺化六肽对hacat的毒性

注：小写字母a和b表示同一浓度不同样品细胞存活率之间的显著性差异，按照字母表的顺利由大到小排列，相邻字母间p＜0.05，差异显著。

由表1可知，乙酰酰胺化六肽和六肽一样对hacat细胞的毒性均显著小于阳性对照五胜肽。在合成多肽中，乙酰酰胺化六肽作用后，hacat细胞的存活率超过80％。因此，可考虑在低于该浓度的条件下，测试样品对hacat细胞的保护作用。

实施例3乙酰酰胺化六肽对uvb老化hacat细胞的保护作用

为了探究多肽对uvb老化的hacat的保护作用，建立uvb老化的hacat模型，设立uvb老化组和non-uvb正常组。在设定的uvb老化强度的基础上，通过mtt法测定hacat的存活率以及流式细胞仪测定细胞的凋亡率来确定最适的uvb剂量。结果表明，当uvb辐射强度为35mj/cm²时，模型组中hacat细胞的存活率为正常组的47.56±6.40％，差异显著，接近半数存活率。同时，流式细胞仪测定凋亡结果表明，模型组的凋亡率明显高于正常组的hacat细胞，模型组细胞g1期的比例显著小于正常组，同时，s期细胞的比例显著高于正常组。因此，uvb能将hacat细胞的生长阻滞在s期。结果表明，紫外线uvb老化的hacat模型建立成功。

在上述uvb老化的hacat模型的基础上，测试1-50μg/ml浓度范围内的乙酰酰胺化六肽对hacat的保护作用，并与六肽、阳性对照五胜肽进行比较。具体的实验结果见表2。

表2乙酰酰胺化六肽对hacat的保护作用

注：小写字母a和b表示不同样品细胞存活率之间的显著性差异，按照字母表的顺利由大到小排列，相邻字母间p＜0.05，差异显著。

由表2可知，乙酰酰胺化六肽对uvb老化的hacat的保护作用显著强于六肽和五胜肽，可见，乙酰酰胺化六肽具备在化妆品中应用的潜力，能够有效保护uvb老化的人表皮永生化细胞。

实施例4

选取spf级的昆明种小白鼠(或称km小鼠)，7-8周龄，全为雌性，体重25g，共56只，分为7组。购自广州南方医科大学实验动物中心，生产许可证：scxk(粤)2011-0015，动物质量合格证为44002100005930。

饲养环境：温度23±2℃，湿度55±10％，12h光照，12h黑暗，交替，其中没有任何紫外线照射，自由供给食物和水。进行实验前先让小鼠适应环境1个星期。然后进行随机分组。

将56只km小鼠随机分为以下4组：a为正常组(normalcontrol，nc)、b为模型组(modelcontrol，mc)、c为阳性对照组(五胜肽palm-kttks，matrixyl)、d为乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)预防组一共4组，每组8只。两笼一组，保持同种条件下，正常饲养，让其适应环境一周再进行后续实验。

首次用电推剪将所有小鼠的背部2.5×3cm²区域的毛发剪掉，短毛用全自动女士剃毛器轻柔剃光，在正式实验前，适应环境两天。从第一周至第十周对小鼠背部皮肤进行加药和uvb处理十周，每次处理前均进行脱毛处理，具体处理按如下要求操作：剃毛结束后，正常组给溶剂100μl，模型组给溶剂100μl，阳性对照组和棕榈酰化六肽组分别给样品100μl(10mg/ml)；给药结束后，给予小鼠足够的活动空间让其单独活动2h，让样品充分渗透吸收，随后，模型组、阳性对照组和棕榈酰化六肽组均用60mj/cm²的uvb照射，实验期间，若出现红斑、水泡和糜烂现象，立即停止照射2-3d，待症状消失再继续实验；各实验组给药频率为一周三次。

第10周末，仔细将各组小鼠背部脱毛(面积为2.5×3cm²)，拍照，颈椎脱臼处死小鼠，迅速取下其背部实验处全层皮肤，剥离结缔组织和皮下脂肪，快速切取1.0cmx1.0cm组织，放入4％的多聚甲醛中固定两天以上。随后，取出固定好的皮肤组织，用流水漂洗过夜，并进行石蜡包埋，切片，染色，拍照。得到200x视野下的he染色的照片后，随机取10个视野，取平均值来估算本样品所代表的小鼠皮肤表皮的平均厚度。imageproplus6.0图像分析软件被用于对受试鼠皮肤表皮厚度进行分析，实验结果参见图3-4。

皮肤含水量的测试采用皮肤组织干燥至恒重的方法测定。颈椎脱臼处死小鼠，迅速取下其背部实验处全层皮肤，剥离结缔组织和皮下脂肪，迅速剪取约0.2g皮肤，精密称其湿重，迅速被放入烘箱中，于80℃干燥至恒重。皮肤水分含量按公式(1)进行计算：

皮肤含水百分率(％)＝(湿重-干重)/湿重×100(1)

实验结果参见图5。

同时，快速切取约0.5g皮肤，用预冷生理盐水漂洗2次，拭干，称重，迅速放入预冷ep管中。用0.9％生理盐水制备10％的皮肤组织匀浆。涂片镜检，待3个以上随机视野均未见完整细胞停止匀浆，离心，去上清液备用。采用bca试剂盒测定蛋白含量，相继采用丙二醛(mda)试剂盒、超氧化物歧化酶(sod)试剂盒、过氧化氢酶(cat)试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)试剂盒等测定组织中各相关mda的含量和抗氧化相关的酶的活力，严格按照说明书进行操作，实验结果参见图6-9。

取皮肤组织0.4g，加入9倍预冷的pbs，于4℃条件下进行均质，10000rpm，20s，10％匀浆，在4℃下于3000×g离心20min。所得的上清液用于评价分泌的mmp-1和mmp-3，测定450nm处的吸光度值来获得皮肤组织中小鼠基质金属蛋白酶mmp-1和mmp-3的含量，具体测定方法严格按照酶联免疫分析(elisa)试剂盒说明书进行，实验结果参见图10-11。

图3中a-d为小鼠背部皮肤的宏观表征图；a1-d1为皮肤组织病理学切片检查结果(200×)。其中，a和a1为仅涂抹溶剂的正常对照组；b和b1为uvb老化的模型组；c和c1为加了阳性对照的保护组；d和d1为加乙酰酰胺化六肽的保护组。

由图3可知，正常组小鼠背部皮肤光滑，色泽红润、饱满、充满弹性、未见任何松弛现象，同时，h&e染色结果表明，正常组皮肤中各层结构完整，皮下毛囊和皮脂腺形态饱满、充盈，表皮较薄，表皮与真皮连接处紧密，真皮层厚度适中，浪状胶原纤维束排列有序且分布均匀，未见病理改变。模型组小鼠背部皮肤表面灰暗，外观松弛，皱纹深重，并且表面皮层出现局部老化坏死现象。初步可以看出，所有样品处理组均比模型组小鼠皮肤有一定程度上的改善。h&e染色结果表明，模型组表皮呈现不规则增厚、细胞核碎裂、局部表皮角化不完全、基底层细胞少量细胞空泡性变、并伴有炎性细胞(淋巴细胞，单核细胞)浸润等现象。阳性对照五胜肽保护组相对于模型组而言，肤色有所改善，不再那么灰暗，皮肤的光泽度和饱满度上都有不同程度的改善，但还是能看到较为明显的晒伤的斑痕。h&e染色结果表明，阳性对照组表皮基底层少量细胞空泡性变，真皮层中度水肿伴少量炎性细胞(淋巴细胞，单核细胞)浸润。乙酰酰胺化六肽保护组小鼠的背部皮肤局部皮肤损伤得到改善，相较于模型组，肤色较亮，表皮较为光滑，未见松弛和深重皱纹，结果表明，该乙酰酰胺化六肽具备在抗皮肤光老化化妆品中应用的潜力。

图4为皮肤表皮厚度测定图。注释：*代表与正常组差异显著；#代表与模型组差异显著。由图5可知，相对于正常组，uvb处理的模型组小鼠的表皮厚度显著增加；相对于模型组，阳性对照组和乙酰酰胺化六肽处理组小鼠的表皮厚度均显著降低，且乙酰酰胺化六肽处理组与正常组无显著差异。结果表明，该乙酰酰胺化六肽具备在抗皮肤光老化化妆品中应用的潜力。

图5为皮肤水分含量测定图。注释：*代表与正常组相比差异显著；#代表与模型组相比差异显著。我们在小鼠宰后，取整层皮肤中的一部分烘干至恒重后的计算皮肤中的水分含量，结果见图6。由图可知，模型组与正常组呈现显著性差异，模型组皮肤层中的水分含量显著低于正常组的皮肤，且乙酰酰胺化六肽作用组显著高于模型组，结果表明，乙酰酰胺化六肽涂抹于皮肤后，对其整层皮肤的水分含量具有保持作用。

图6为皮肤组织mda含量测定图。由图可知，模型组mda的含量显著高于正常组，乙酰酰胺化六肽作用组中mda含量显著低于模型组。由于紫外线uvb的作用会产生自由基，从而对皮肤的脂质层造成破坏，产生过量的mda，由于乙酰酰胺化六肽具有较强的抗氧化活性，能及时清除自由基，从而降低皮肤中mda的含量。结果表明，乙酰酰胺化六肽具备在抗皮肤光老化化妆品中应用的潜力。

图7为皮肤组织sod活力测定图。由图可知，模型组以及所有经uvb老化组组织中sod活力均显著下降，乙酰酰胺化六肽处理组中sod活力显著强于模型组，结果表明，乙酰酰胺化六肽具备在抗皮肤光老化化妆品中应用的潜力。

图8为皮肤组织cat活力测定图。由图可知，经uvb老化的模型组以及阳性对照组的组织中cat活力均显著下降。乙酰酰胺化六肽作用组的组织中cat活力显著高于模型组，结果表明，乙酰酰胺化六肽具备在抗皮肤光老化化妆品中应用的潜力。

图9为皮肤组织gsh-px活力测定图。由图可知，模型组中gsh-px活力显著低于正常组，阳性对照五胜肽和乙酰酰胺化六肽作用组皮肤组织gsh-px活力均显著高于模型组，说明阳性对照五胜肽和乙酰酰胺化六肽均可通过提高组织中gsh-px活力来抗皮肤光老化。

图10和图11分别为皮肤组织中mmp-1和mmp-3表达情况测定图。由图可知，相对于uvb老化的模型组，乙酰酰胺化六肽作用组中mmp-1和mmp-3的表达量显著下降，因此，乙酰酰胺化六肽通过降低细胞质基质中mmp-1和mmp-3的表达量来实现其抗光老化效果。具备在抗皮肤光老化化妆品中应用的潜力。