一种可抑制NF‑κB蛋白活化的多肽及检测sORF表达的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种可抑制nf-κb蛋白活化的多肽及其dna编码片段，还涉及一种用于检测sorf的dna构建体系统及检测方法。

背景技术：

小开放性阅读框(sorfs)是一类广泛存在于各种生物细胞中具有编码潜能的核酸序列，且在多种生物组织中具有高度的保守性，因此推测该类序列编码产物具有重要的生物学功能。

随着高通量测序技术的广泛应用和蛋白质组学技术的进步，人们在不同生物组织中发现了越来越多的sorfs，并且部分sorfs编码产物的生物学功能也逐步被揭示。2003年，guo团队在研究阿尔兹海默病时证实了一条由24个氨基酸组成的多肽(humannin)具有神经保护性作用；2007年，galindo团队在果蝇体内证实一段11个氨基酸的多肽能促进上皮细胞分化；2010年，maki团队在大肠杆菌体内证实一段由sorf编码的43个氨基酸的短肽能影响葡萄糖转运。然而，由于这些短肽的分子量小，且易受到体内大分子蛋白的干扰，致使常规方法检测短肽表达困难，其生物学功能的研究进展缓慢。

近年来，有研究者对短肽检测及其生物学功能研究的方法进行探索。2016年，shelley团队报道了一种t细胞翻译示踪方法，即运用免疫反应抗原呈递的方法间接证明sorf在体内可以编码产物。该方法利用已知的t细胞表面抗原肽活化t细胞，然后将该抗原肽的dna序列与sorf的编码序列构建至载体，并将转染该表达载体的细胞与活化的t细胞共孵育，最终通过复杂的化学显色反应，证实sorf在体内能够表达。该方法虽具有一定的可行性，但是由于实验操作的复杂性及示踪肽设计的困难，限制了其广泛应用。

nf-κb是一种转录因子，nf-κb调控的荧光素酶表达载体是本领域常用的荧光素酶表达载体。2000年，michael团队阐明nf-κb的活化需要ikkα/β与nemo形成κb激酶复合体，并且证实了ikkα/β与nemo相互结合的核心区域(nbd)，合成nbd多肽能抑制nf-κb活性。nf-κb作为生物体内重要的核转录因子，能够被多种炎症因子所活化，从而上调多种基因的表达。正常生理情况下，nf-κb在机体内始终保持一定活性和较高的丰度。

因此，为了促进生物体内活性小肽的研究，我们需要设计一种基于报告基因系统的方法，用来检测sorf编码多肽表达。

技术实现要素：

发明人在研究过程中发现，nf-κb蛋白活化必须使ikkα/β与nemo形成κb激酶复合体，并且其结合的核心氨基酸序列为taldwswlqte(seqidno:1)，其对应的dna序列为5’-acggccctagactggagctggttacagacggaa-3’(seqidno:2)。

基于以上研究，本发明提供了一种可抑制nf-κb蛋白活化的多肽，其包含如seqidno:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了上述可抑制nf-κb蛋白活化的多肽的dna编码片段，其包含如seqidno:2所示核苷酸序列或其同义突变体序列。

本发明还提供了一种用于检测sorf的dna构建体系统，其包括nf-κb抑制多肽表达构建体和nf-κb调控的报告基因表达载体；

所述nf-κb抑制多肽表达构建体包含启动子和连接于所述启动子下游的上述dna编码片段并且所述dna编码片段的3’末端连接有终止密码子；

所述nf-κb调控的报告基因表达构建体包含nf-κb调控的报告基因表达框。

优选地，所述nf-κb调控的报告基因表达载体含有nf-κb调控的荧光素酶i表达框，并且dna构建体系统还包括对照报告基因表达载体，所述对照报告基因表达载体包含不受nf-κb调控的荧光素酶ii表达框，并且荧光素酶i和荧光酶ii激发产生的荧光波长不同。

本发明还提供了一种用于检测序列中是否有sorf的方法，其包括以下步骤：

s1：将待检测序列插入权利要求3或4所述的dna构建体系统中nf-κb抑制多肽表达构建体上，所述待检测序列连接于所述dna编码片段的5’末端，并且保证从所述待检测序列的第一个atg开始至所述dna编码片段之间的核苷酸个数为3的倍数；

s2：将s1得到的含有所述待检测序列的nf-κb抑制多肽表达构建体和所述nf-κb调控的报告基因表达构建体导入于同一个表达宿主中；

s3：检测所述nf-κb调控的报告基因表达框所表达的报告基因的强度，如果nf-κb调控的报告基因的表达强度显著降低，则指示所述待检测序列中的sorf被表达,如果nf-κb调控的报告基因的表达强度没有显著变化，则指示所述待检测序列中的sorf未被表达。

优选地，所述nf-κb调控的报告基因表达载体含有nf-κb调控的荧光素酶i表达框，并且dna构建体系统还包括对照报告基因表达载体，所述对照报告基因表达载体包含不受nf-κb调控的荧光素酶ii表达框，并且荧光素酶i和荧光酶ii激发产生的荧光波长不同。

优选地，待检测序列的nf-κb抑制多肽表达构建体通过将所述待检测序列连接于所述编码dna片段的5’末端，并插入至质粒pcmv-3tag-1a的xhoi与hindiii位点之间得到，所述nf-κb调控的报告基因表达载体为pnf-κbluc，并且对照报告基因表达载体为phrl-tk。

优选地，s1具体包括：

s11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

s12：将所述nf-κb抑制多肽表达构建体、所述nf-κb调控的报告基因表达载体和对照报告基因表达载体转染至细胞中。

优选地，s2具体包括：

s21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

s22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶i和荧光素酶ii的活性；

s23：根据荧光素酶ii活性归一化荧光素酶i活性得到的值判断所述待检测序列中sorf是否表达，如果所述值显著降低，则指示所述待检测序列中的sorf被,如果所述值没有显著变化，则指示所述待检测序列中的sorf未被表达。

通过使用本发明的多肽、dna片段、dna构建体系统和方法，首次以简单可靠的方式实现了利用双荧光素酶报告基因系统对sorfs体内表达的检测。

附图说明

图1为xhoi与hindiii对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为分别转染有pcmv-3tag-1a空载体和pcmv-sorfx-nbd的293t细胞中的相对荧光素酶活性(nf-κb的荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图；

图3为分别转染有pcmv-3tag-1a空载体和pcmv-sorf1-nbd的pc-3细胞中的相对荧光素酶活性(nf-κb的荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建可抑制nf-κb蛋白活化的多肽的dna编码片段与待检测序列的融合片段

发明人通过研究分析，发现一种可抑制nf-κb蛋白活化的多肽，其序列为taldwswlqte(seqidno:1)，对应的dna编码序列为5’-acggccctagactggagctggttacagacggaa-3’(seqidno:2)，该dna序列仅为实例之一，其同义突变体也具有与其同等的效力和用途。

设计合成待检测的sorf引物时，将nf-κb抑制肽编码序列及终止密码子(tga)直接合成在下游引物的5’端，且在pcr产物末端加入相应的限制性内切酶位点，本例在5’端加入带保护碱基的hindⅲ酶切位点(cccaagctt)，在3’端加入带保护碱基的xhoⅰ酶切位点(gccgctcgag)。pcr反应得到包含待检测sorf及nbd的dna序列(包含xhoⅰ酶切位点和hindiii酶切位点)如seqidno:3(下文中称为sorf1-nbd)，经xhoⅰ和hindiii双酶切即可得到包含这两种酶粘性末端的产物。上述引物序列由武汉擎科生物技术有限公司合成。

2.将sorf1-nbd插入荧光素酶表达载体

选用的表达载体为pcmv-3tag-1a，用内切酶xhoi和hindiii(购自takara公司，xhoi货号为1635，hindiii货号为1615)对上述pcmv-3tag-1a空载体和之前得到的pcr产物分别进行双酶切，20μl酶切体系如下：10xquickcutgreenbuffer2μl，kpni1μl，hindiii1μl，pcmv-3tag-1a空载体/sorf1-nbd1μg，余下为ddh2o。

充分混匀后，37℃酶切反应90分钟，用2％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况，然后切胶回收(dna胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为dp209)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将酶切后的sorf1-nbd和pcmv-3tag-1a进行连接。10μl连接体系如下：dna连接酶(购自takara公司，货号为6022)5μl，分别经双酶切的sorf1-nbd与pcmv-3tag-1a载体共5μl。为促进酶连成功率，将dna片段与载体的摩尔比控制在8:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于pcr仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒转化至大肠杆菌。按照经典的热激法进行转化，具体方法如下：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞dh5α置于冰上解冻2-3分钟，加入上述连接好的重组质粒，轻轻混匀，冰上孵育20分钟后42℃热激60秒，迅速放至冰上静置2分钟，然后加入450μl不含抗生素的无菌lb液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时，复苏条件为37℃，200转/分钟。取复苏后的菌液100μl均匀涂布于直径为3.5厘米含卡那霉素的lb固体选择培养基中。吸收10分钟后，倒置于37℃恒温培养箱中过夜。次日挑取单菌落至5-7ml含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃，200转/分钟，摇菌繁殖12小时后提取质粒，2％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用内切酶xhoi和hindiii(购自takara公司，kpni货号为1618，hindiii货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道4为marker，泳道1-3显示为pcmv-sorf2-nbd阳性克隆，泳道5-7显示为pcmv-sorf1-nbd阳性克隆)。阳性组送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认dna片段已整合至pcmv-3tag-1a载体上。至此，含有待检测序列和nf-κb抑制肽(nbd)的pcmv-3tag-1a表达载体(以下均表示为pcmv-sorf1-nbd)构建成功。

3.pcmv-sorf1-nbd转染细胞

本发明实施例采用人肾上皮细胞系293t、人前列腺癌细胞系pc-3细胞进行双荧光素酶报告基因检测。分别将对数期生长的细胞均匀种植在24孔板内，每孔5-10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖dmem培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为tf20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：pgl3-basic空载体、pnf-κbluc(含有nf-κb的荧光素酶报告基因载体)、phrl-tk(携带海肾荧光素酶报告基因的质粒)，pcmv-3tag-1a空载体(均购自美国invitrogen公司)，以及上述构建的pcmv-sorf1-nbd表达载体。

4.nf-κb活性抑制率的计算

转染处理后的细胞培养24-36小时后，弃培养基上清，用1xpbs清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。

采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司，货号为gn201-01)进行检测。测定结果如图2和3所示，在转染有pnf-κb-luc的细胞中，其相对荧光素酶活性为10-14左右，而转染有pcmv-sorf-nbd的细胞中相对荧光素酶活性仅为2左右，显著低于前者，因此，待检测序列sorf能表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>一种可抑制nf-κb蛋白活化的多肽以及检测sorf的方法

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

thralaleuasptrpsertrpleuglnthrglu

1510

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acggccctagactggagctggttacagacggaa33

<210>3

<211>154

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cccaagcttatgccgacgcacggattcgaggcggggagcatgggaagaagcggccaggag60

tatgacctgatcattgcgaccaccgctaggggaagggaggagagggtgacggccctagac120

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