本发明涉及一种非对称双特异性抗体。
背景技术：
最近，开发了很多重组抗体类型，例如，通过融合例如igg抗体类型和单链结构域得到的四价双特异性抗体。也开发了一些其它的新类型，其中不再保留抗体的核心结构(iga，igd，ige，igg或igm)，例如能够结合两个或多个抗原的双抗体、三抗体或四抗体、微型抗体(minibody)和一些单链抗体(scfv，bis-scfv)。
双特异性抗体能够同时结合2种不同的靶标，迄今为止，已经描述了特异性针对某些细胞靶标的双特异性抗体。
肿瘤是当前引起人类死亡的主要疾病之一。肿瘤的常规治疗手段是依靠手术、化疗和放疗，但大多数患者化疗后产生耐药、复发。手术结合化疗和放疗虽然能延长病人的生存时间，但许多肿瘤病人最后仍然发生肿瘤转移而死亡。单克隆抗体药物特异性高、毒副作用小、具有独特的生物学效应、在肿瘤靶向治疗领域具有越来越重要的地位。美国fda已经批准上市了几十种治疗性抗体药物。在这些药物中，以rituxan、avastin、herceptin等为代表的抗体药物，在治疗乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中表现出了好的疗效。
目前公认的抗体抗肿瘤机制包括抑制关键信号传导、抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)、和补体依赖性细胞毒性(complementdependentcytotoxity，cdc)等。其中，抗体介导的细胞毒作用，即adcc，是抗体杀死肿瘤细胞的主要机制之一。当抗体结合到肿瘤细胞表面的抗原以后，抗体的fc段就与免疫效应细胞表面的fc受体结合，继而引发效应细胞(例如nk细胞)对靶细胞的杀伤。许多单克隆抗体药物主要通过adcc发挥抗肿瘤作用。
普通igg抗体的adcc作用往往具有局限性，iggfc招募效应细胞的能力有限，而且抑制性iggfc受体的存在可以减弱对效应细胞的招募。双特异性抗体分子(bispecificantibodies，bsab)是增强adcc的一个有效途径，已经在肿瘤免疫治疗中得到研究应用。例如美国fda批准上市的blinatumomab是一个抗cd19和抗cd3的单克隆抗体，其结构特点是将抗cd19单链抗体(scfv)和抗cd3scfv以连接序列直接相连接，成为所谓bite(bispecifictcellengager)技术平台。但blinatumomab或者bite技术制备的双特异性抗体在体内的半衰期非常短，影响药物的效果。
为了获得具有良好药学和药物动力学特性的双特异性抗体，研究者设计了许多不同的双特异性抗体，他们绝大多数都有种种缺陷，主要表现为：1)难以进行大规模生产，2)半衰期过短，3)双价结合免疫效应细胞，导致免疫效应细胞间互相杀伤。因此尽管双特异抗体是抗体药物研究的一个热点，但被批准进入临床应用的双特异抗体品种很少，期待在技术上进行创新。
技术实现要素：
本发明人设计了一种全新结构的非对称双特异性抗体，其能够表现出更好的抗肿瘤效果，并且显著改善现有双特异性抗体的缺陷。
特别地，本发明的一个目的在于构建能与免疫效应细胞通过单价结合的双特异抗体，它们一方面与肿瘤细胞的表面蛋白质结合，另一方面与免疫效应细胞单价结合，即一个双特异抗体分子只与一个免疫效应细胞结合，从而避免效应细胞之间的互相杀伤。同时，还必须保证该种双特异性抗体具有良好的体内半衰期。
t细胞免疫应答反应是人体免疫系统中重要的环节，因此构建对t细胞和肿瘤细胞表面抗原的双特异的抗体可激活静止的t细胞对靶向肿瘤的杀伤，从而达到治疗恶性肿瘤的目的，可以用t细胞表面抗原cd3作为靶标。除此以外，其他免疫效应细胞的表面标志也可以作为双特异抗体的靶标。研究表明，iga的受体fcαri(cd89)表达在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞和树突状细胞(dc)上，介导iga和中性粒细胞、单核巨噬细胞等髓性细胞之间发的多种免疫效应过程。而中性粒细胞是数量最多的白细胞，成年人血液中中性粒细胞的数量约占白细胞总数的55％～70％。中性粒细胞可以更有效地介导肿瘤杀伤反应。因此我们也感兴趣于以cd89细胞为效应细胞的双特异抗体。
肿瘤表面抗原cd19、cd20都是一种非糖基化的跨膜蛋白，具高度的保守性。cd19、cd20在大多数b淋巴细胞中表达，而在浆细胞，淋巴干细胞以及其它组织中均无表达，超过95％的b细胞淋巴瘤上都有cd19、cd20的表达且没有显著的内吞和脱落，这些特征使得cd19、cd20成为治疗b细胞淋巴瘤的理想靶抗原。
通过构建双特异性抗体，可以靶向肿瘤细胞的同时募集表达cd3等标志的髓性效应细胞，从而达到更有效地杀死肿瘤细胞的目的。
除了肿瘤免疫治疗，双特异抗体还可以用于其他疾病，例如通过靶向病毒抗原和cd3，可以引导t细胞杀死病毒，用于治疗病毒感染或病毒导致的疾病。根据靶标的性质，双特异抗体可以有不同的功能，从而达到治疗不同疾病的目的。
尽管研究者已经设计了许多种双特异抗体，但它们仍然无法满足药物研发的需要。本发明的主要内容是设计了一种新型双特异性抗体，它们具有非对称的结构，因此称为非对称双特异抗体(asymmetricbispecificantibody，asbsab)，它们在体内有较长的半衰期，可以较好地从细胞表达，更为重要的是，这种双特异抗体能与免疫效应细胞通过单价结合，即一个抗体分子只结合一个免疫效应细胞上的表位，可以防止免疫效应细胞间发生偶联而互相杀伤。
本发明提供了一种分离的非对称双特异性抗体，其包含：
第一链，其从n端至c端依次包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)；
第二链，其从n端至c端依次包含重链可变区、重链恒定区和单链抗体(scfv)区，其中所述第一链的vl和cl与所述第二链重链vh和ch1共同组成针对第一抗原或表位的抗原结合片段(fab)；所述第二链的重链恒定区包含抗体重链的ch1和fc区；所述第二链的scfv区从n端至c端依次包含针对第二抗原的重链可变区和轻链可变区，或者从n端至c端依次包含针对第二抗原或表位的轻链可变区和重链可变区；和
第三链，其包含第三链的重链fc区，其中所述第三链的重链fc区包含抗体铰链区、ch2和ch3。
特别地，所述第二链包含位于ch1结构域和ch2结构域之间的铰链区，以及所述第三链从n端至c端依次包含第三链的铰链区和重链fc区。
特别地，所述第三链包含铰链区、ch2结构域和ch3结构域。
特别地，所述第一链的轻链恒定区末端和所述第二链的重链恒定区末端之间具二硫桥相连。
特别地，所述第二链的铰链区与所述第三链的铰链区具有二硫桥，如天然抗体中所存在的。
特别地，所述第一链的轻链恒定区与所述第二链的重链恒定区之间具有二硫键连接，和/或其中第二链的ch3结构域和第三链的ch3结构域之间具有0、1或2个二硫桥，优选地其中通过在所述第二链的第二重链可变区和所述第二链的轻链可变区和/或所述第二链的ch3结构域和第三链的ch3结构域的相应位置处引入半胱氨酸来引入二硫桥。
为了制备这样的双特异抗体，我们设计了一个三载体抗体表达系统。在这个系统中，双特异抗体有三条多肽链构成。第一条多肽链是抗体轻链，有完整的抗体可变区和恒定区序列；第二条多肽链是一条完整的抗体重链和另一个单链抗体(scfv)的融合蛋白链，该链的从n端到c端分别是重链可变区、重链恒定区、和另一个抗体的scfv；第三条多肽链只含有重链铰链区和fc片段。这三条多肽链在细胞内表达过程中，第一条多肽链(第一个抗体的轻链)与第二条多肽链的n端(第一个抗体的重链)配对，形成一个抗体fab结构，可以结合一个抗原表位；第二条多肽链的c端含有一个抗体的scfv，可以结合另一个抗原表位；第三条多肽链与第二条多肽链在铰链区形成二硫键，形成fc二聚体。这样，这种双特异抗体分子是一种非对称结构的三链分子，该三链抗体通过n端的一个fab片段与一个抗原结合，再通过c端的scfv与另一个抗原结合，达到双特异抗体的目的。
本发明设计的双特异抗体的特点是抗体fc的非对称结构。该双特异抗体含两条包含fc的蛋白链，其中一条含fc的蛋白链较长，从n端开始包括：(1)第一个抗体的重链可变区和重链ch1，(2)fc区(铰链区、ch2、ch3)，(3)位于c端的另一个抗体的scfv，例如在一个实施方案中，该蛋白质链的分子量大约是77kd；另一条含fc的蛋白链是含铰链区的fc，例如在一个实施方案中该蛋白质链的分子量是29kd。为了实现长链和短链fc形成异源配对，我们在该两条fc序列设计了凹凸配对结构，通过fc区域的氨基酸突变，减少同源二聚体fc形成，增加长链和短链fc异源配对，达到单价、双特异功能的目的。由于两条含fc片段的多肽的分子量差别较大，即使有少量fc形成同源二聚体也可以通过后续纯化去除。
本发明非对称双特异性抗体的基本结构可参见图1。这一结构可用于多种不同目的的双特异抗体的表达。其中，该双特异抗体结构中的两个抗原结合区域，即fab和scfv结合不同的抗原，fab可以结合肿瘤抗原，可以结合免疫效应细胞的表面抗原，也可以结合其他抗原表位；scfv可以结合肿瘤抗原，可以结合免疫效应细胞的表面抗原，也可以结合其他抗原表位。本发明抗体的结构尤其适用于肿瘤/癌症治疗，例如b细胞相关肿瘤等。当此类双特异抗体的fab和scfv分别结合一个肿瘤抗原和免疫效应细胞表面抗原时，即可将免疫效应细胞与肿瘤细胞偶联，进而杀死肿瘤细胞，达到免疫治疗作用。
可用于本发明的肿瘤抗原包括但不限于afp、bcma、cea、claudin、ca19-9、ca125、dr5、emp2、gpa33、egfr、folate、her2、her3、fgfr1、c-met、pdgfr、vegfr、cd16、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd47、cd123、cd133、cd137、cd138、psma、tag72、tim-3、trop-2、p-cadherin、gp100、pd-l1、和epcam。
可用于作为本发明所描述的双特异抗体的效应细胞表面抗原也很多，包括但不限于：fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b)、fcαri(cd89)、cd3、和pd1。常用的是t淋巴细胞，以cd3作为可选用的细胞表面标志，也可以用其他t细胞表面标志。除了t细胞，其他很多细胞也具有免疫效应作用，例如嗜中性粒细胞、单核细胞等，可以用不同的细胞标志物结合这些细胞。尤其特别的是，cd89是表达于嗜中性粒细胞和单核细胞的表面标志物，在本发明的双特异抗体中，其中一个例子是通过一方面靶向cd89，另一方面靶向cd19可以实现效应细胞对cd19阳性细胞的杀伤，包括cd19阳性肿瘤细胞。
此外，值得指出的是，本发明的双特异抗体也可以结合两个肿瘤抗原，分别结合到两个靶分子，或者结合到同一个靶分子的不同表位，实现对肿瘤信号的阻断、或者通过其他机制实现对肿瘤细胞的杀伤。进而，本发明的双特异抗体也可以用于肿瘤治疗以外的疾病，例如同时结合两个非肿瘤相关的靶标，根据作用机制，实现其生物学功能。这些结构或功能的双特异抗体都在本发明技术的应用范围。
编码有上述三条多肽链的双特异抗体载体可以通过基因克隆构建载体，载体可以是质粒、病毒、dna片段等，用常规分子生物学技术可以实现。常用的方法是可以将三条多肽链用pcr扩增合成，克隆到细菌质粒。许多质粒，例如pcdna3.1等都可以用于此目的。质粒通过基因测序确定后可用于转染细胞表达。多种细胞可以用来表达本发明的双特异抗体，例如哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母细胞、细菌细胞等。哺乳动物细胞中常用的是cho细胞(chinesehamsterovarycell)，也可使用hek293细胞、骨髓瘤细胞等表达。本发明的双特异性抗体涉及三条多肽链，他们可以克隆到一个、两个、或者三个载体中，进行表达。以hek293细胞为例，可以分别将编码三条多肽的dna克隆到三个质粒中，三种质粒分别纯化，用共转染技术转染细胞。转染方法可以用dna转染试剂盒。转染方法分瞬时转染和稳定转染。瞬时转染可以在较短的时间获得相对少量的蛋白质，稳定转染可以获得稳定细胞株，可以实现较大规模的蛋白质表达。
附图说明
图1显示了本发明非对称双特异性抗体的示例性结构图，图中为本发明的非对称双特异性抗体和正常(normal)形式抗体两种。
图2显示了菌落pcr检测目的基因电泳图。
图3显示了抗cd3-cd19双特异抗体蛋白的sds-page电泳图。
图4显示了流式细胞术检测抗cd89-抗cd20双特异抗体对pmn、raji细胞的结合力。
图5显示了流式细胞术检测抗cd19-抗cd3双特异抗体对raji、jurkat细胞的结合力。
图6显示了抗cd89-抗cd20双特异性抗体对肿瘤细胞的杀伤能力。
图7显示了抗cd19-抗cd3双特异性抗体介导的t细胞体外杀伤能力。
图8显示了双特异性抗体在小鼠体内血清半衰期。
图9显示了抗cd89-抗cd20双特异性抗体对肿瘤的体内治疗实验。
图10显示了抗cd19-抗cd3双特异性抗体对肿瘤的体内治疗实验。
具体实施方式
本发明提供了一种分离的非对称双特异性抗体，其包含：
第一链，其从n端至c端依次包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)；
第二链，其从n端至c端依次包含重链可变区、重链恒定区和单链抗体(scfv)序列。其中所述第一链的vl和cl与所述第二链重链vh和ch1共同组成第一个抗体的抗原结合片段(fab)；所述第二链的重链恒定区包含抗体重链的ch1和fc区；所述第二链的scfv区从n端至c端依次包含第二个抗体的重链可变区和轻链可变区，两者以适当的连接序列相连，或者从n端至c端依次包含第二个抗体的轻链可变区和重链可区，两者以适当的连接序列相连；和
第三链，其包含第三链的重链fc区，其中所述第三链的重链fc区包含第三链的ch2结构域和ch3结构域。
在一些具体的实施方案中，对第二链的ch3结构域和第三链的ch3结构域相接触之界面进行修饰，以减少同二聚体的形成，其中所述修饰为：
a)将所述第二链的ch3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在所述界面的第二链一侧生成凸起，
b)将所述第三链的ch3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在所述界面的第三链一侧生成凹洞，
其中，所述凸起定位于所述凹洞中。
在一些具体的实施方案中，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自：精氨酸(r)，苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，和色氨酸(w)。优选地，所述将所述第二链的ch3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基为t366w突变(对应于本申请seqidno：5中的146位氨基酸的位置)。
在一些具体的实施方案中，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自：丙氨酸(a)，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)，和缬氨酸(v)。优选地，所述将所述第二链的ch3结构域中位于上述界面内氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基为t366s、l368a和y407v突变(对应于本申请seqidno：4中的146、148和187位氨基酸的位置)。
在一些具体的实施方案中，第二链的铰链区和第三链的铰链区之间具有1、2或3个二硫桥。
如果该双特异抗体所用fc序列具有天然fc与fcγr结合的特性，则有可能导致nk等效应细胞结合该双特异抗体，并诱导adcc效应，这种adcc效应可能通双特异抗体与肿瘤靶标的结合，提高双特异抗体对肿瘤细胞的杀伤能力，但也可能通过双特异抗体与cd3等效应细胞靶标的结合，杀伤效应细胞，从而降低抗肿瘤效果。在一些具体的实施方案中，为了防止adcc对双特异抗体疗效的影响，我们将第二链的fc区和第三链的重链fc区进行进一步修饰，以去除adcc效应功能，例如将297位asn突变为ala。
在一些具体的实施方案中，所述第一链的轻链可变区与所述第二链的重链可变区能够特异性结合第一抗原或表位。
在一些具体的实施方案中，所述第二链的scfv区能够特异性结合第二抗原或表位。
在一些具体的实施方案中，所述第一抗原或表位不同于所述第二抗原或表位。在另一些具体的实施方案中，所述第一抗原或表位和所述第二抗原或表位相同。
在一些具体的实施方案中，所述第一抗原或表位是肿瘤细胞表面抗原或表位并且所述第二抗原或表位是免疫效应细胞表面抗原或表位。在另一些具体的实施方案中，所述第一抗原或表位是免疫效应细胞表面抗原或表位并且所述第二抗原或表位是肿瘤细胞表面抗原或表位。在又一些具体的实施方案中，所述第一抗原或表位是肿瘤细胞表面抗原或表位并且所述第二抗原或表位是另一种肿瘤细胞表面抗原或表位。
特别地，所述肿瘤细胞表面抗原或表位选自：afp、bcma、ca19-9、ca125、cea、claudin、dr5、emp2、gpa33、egfr、folate、her2、her3、fgfr1、c-met、pdgfr、vegfr、cd16、cd19、cd20、cd22、cd25、cd30、cd33、cd38、cd45、cd47、cd123、cd133、cd137、cd138、psma、tag72、tim-3、trop-2、p-cadherin、gp100、pd-l1、和epcam，。
特别地，所述免疫效应细胞表面抗原或表位可选自：fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b)、fcαri(cd89)、cd3、和pd1。
在一些具体的实施方案中，本发明抗体中的各个部分(包括但不限于：第一链的vl区、cl区；第二链的重链vh区、重链恒定区(包括ch1区、铰链区、ch2区、ch3区)、和scfv区、；第三链的重链fc区、包括铰链区、ch2区、ch3区、可各自独立地来源于人、小鼠、大鼠、兔、或骆驼科物种等。优选地，第一链的cl区、第二链的重链恒定区、第三链的重链fc区均来源于人。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了抗cd89-抗cd20双特异抗体，其中所述第一抗原或表位为cd89且所述第二抗原或表位为cd20，或者所述第一抗原或表位为cd20且所述第二抗原或表位为cd89。优选地，所述第一链的序列为seqidno：1，所述第二链的vh和ch1的序列为seqidno：2；所述第二链的scfv区的序列为seqidno：3；以及所述第二链的fc区的序列和所述第三链的fc区的序列中的一个为seqidno：4或49，另一个为seqidno：5或50。特别地，所述第二链的fc区的序列为seqidno：4，和所述第三链的fc区的序列为seqidno：5。特别地，所述第二链的fc区的序列为seqidno：49，和所述第三链的fc区的序列为seqidno：50。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了抗cd19-抗cd3双特异抗体，其中所述第一抗原或表位为cd19且所述第二抗原或表位为cd3，或者所述第一抗原或表位为cd3且所述第二抗原或表位为cd19。优选地，所述第一链的序列为seqidno：6，所述第二链的vh和ch1的序列为seqidno：7；所述第二链的scfv区的序列为seqidno：8；以及所述第二链的fc区的序列和所述第三链的fc区的序列中的一个为seqidno：4或49，另一个为seqidno：5或50。特别地，所述第二链的fc区的序列为seqidno：4，和所述第三链的fc区的序列为seqidno：5。特别地，所述第二链的fc区的序列为seqidno：49，和所述第三链的fc区的序列为seqidno：50。
在一些具体的实施方案中，所述第二链的fc区与scfv区通过肽接头相连接，优选地所述肽接头是0、1、2、或3个ggggs。
在一些具体的实施方案中，所述第二链的scfv区中的轻链可变区和重链可变区通过肽接头相连接，优选地所述肽接头是0、1、2、或3个ggggs。
在一些具体的实施方案中，本发明抗体中的所述第一抗原或表位为cd89，并且所述第一链的vl包含下列cdr：序列如seqidno：9所示的cdr1，序列如seqidno：10所示的cdr2，序列如seqidno：11所示的cdr3，以及所述第二链的vh包含下列cdr：序列如seqidno：12所示的cdr1，序列如seqidno：13所示的cdr2，序列如seqidno：14所示的cdr3。
在一些具体的实施方案中，本发明抗体中的所述第一抗原或表位为cd19，并且所述第一链的vl包含下列cdr：序列如seqidno：15所示的cdr1，序列如seqidno：16所示的cdr2，序列如seqidno：17所示的cdr3，以及所述第二链的vh包含下列cdr：序列如seqidno：18所示的cdr1，序列如seqidno：19所示的cdr2，序列如seqidno：20所示的cdr3。
在一些具体的实施方案中，本发明抗体中的所述第二抗原或表位为cd20，并且所述第二链的scfv序列如seqidno：3所示。
在一些具体的实施方案中，本发明抗体中的所述第二抗原或表位为cd3，并且所述第二链的scfv序列如seqidno：8所示。
在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明抗体的方法，其包括下列步骤：
a)用以下各项转化宿主细胞：
第一载体，其包含编码所述第一链的核酸分子，
第二载体，其包含编码所述第二链的核酸分子，和
第三载体，其包含编码所述第三链的核酸分子；
b)在容许合成所述抗体的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从培养物中回收所述抗体。
在一些实施方案中，所述第一载体、第二载体和第三载体是不同的载体。在一些实施方案中，所述第一载体、第二载体和第三载体是同一个载体。
在另一个方面，本发明提供了用于制备本发明抗体的方法，其包括下列步骤：
a)用以下各项转化宿主细胞：
载体，其包含编码所述第一链的核酸序列、编码所述第二链的核酸序列和编码所述第三链的核酸序列；
b)在容许合成所述抗体的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从培养物中回收所述抗体。
在又一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含：
第一载体，其包含编码所述第一链的核酸分子，
第二载体，其包含编码所述第二链的核酸分子，和
第三载体，其包含编码所述第三链的核酸分子。
在又一个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含：
载体，其包含编码所述第一链的核酸序列、编码所述第二链的核酸序列和编码所述第三链的核酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述载体是表达载体，优选质粒、病毒或其他载体。
在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。特别地，所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞，可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，例如293细胞、293f细胞、cho细胞、nso细胞、bhk细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选bhk细胞、cho细胞、nso细胞或cos细胞。
在又一个方面，本发明提供了能够特异性结合cd89的抗体，其中所述抗体包含：重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3，其中
所述重链cdr1的氨基酸序列如seqidno：12所示，
所述重链cdr2的氨基酸序列如seqidno：13所示，
所述重链cdr3的氨基酸序列如seqidno：14所示，
所述轻链cdr1的氨基酸序列如seqidno：9所示，
所述轻链cdr2的氨基酸序列如seqidno：10所示，以及
所述轻链cdr3的氨基酸序列如seqidno：11所示。
在一些实施方案中，本发明的抗cd89抗体包含氨基酸序列如seqidno：23所示的重链可变区，以及氨基酸序列如seqidno：24所示的轻链可变区。
在又一个方面，本发明提供了能够特异性结合cd19的抗体，其中所述抗体包含：重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、轻链cdrl、轻链cdr2、轻链cdr3，其中
所述重链cdr1的氨基酸序列如seqidno：18所示，
所述重链cdr2的氨基酸序列如seqidno：19所示，
所述重链cdr3的氨基酸序列如seqidno：20所示，
所述轻链cdr1的氨基酸序列如seqidno：15所示，
所述轻链cdr2的氨基酸序列如seqidno：16所示，以及
所述轻链cdr3的氨基酸序列如seqidno：17所示。
在一些实施方案中，本发明的抗cd19抗体包含氨基酸序列如seqidno：38所示的重链可变区，以及氨基酸序列如seqidno：37所示的轻链可变区。
在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗体和至少一种可药用赋形剂。
在又一个方面，本发明提供了本发明的抗体在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在又一个方面，本发明提供了如上所述的非对称双特异性抗体，其用于治疗疾病。
在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗疾病的方法，其包括：将治疗有效量的本发明的抗体施用给有需要的对象。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症或肿瘤，优选地其中在癌细胞或肿瘤细胞表面表达第一抗原或表位，例如b淋巴细胞肿瘤(如非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(例如慢性淋巴细胞性白血病)、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、头颈癌和宫颈癌。
在一些实施方案中，所述疾病是以b细胞的表达为特征的疾病。在某些实施方案中，所述疾病对用抗-cd19抗体和抗-cd20抗体中的至少一种治疗无反应。
在又一些实施方案中，所述疾病是自身免疫性疾病。特别地，所述自身免疫性疾病是以下中的一种或多种：多发性硬化症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病性关节炎、银屑病、血管炎、iga肾炎、葡萄膜炎、克罗恩氏病和1型糖尿病等。
定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
本文中所用的术语“非对称”指本发明的抗体不能分成相互对称的两个部分。具体地，某些天然抗体(例如igg)包含两个相同的重链和两个相同的轻链，其中一个重链和一个轻链组成的部分与另一个重链和另一个轻链组成的部分相互对称。优选地，本发明的非对称抗体是由三个各不相同的链组成的异源三聚体。
本文中所使用的术语“双特异性”旨在涵盖具有两种不同的结合特异性的任何试剂，例如，异多聚体、单体、蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物，优选抗体。
如本文所用的术语“分离的”意指已经被鉴别并且从其天然细胞培养环境的组分中分离和/或回收的物质，例如抗体。
本文所使用的术语“抗体”涵盖全长抗体(例如，igg1或igg4抗体)、其各种功能性片段(例如可仅包含抗原结合部分，如fab、f(ab’)2或scfv片段)以及经过修饰的抗体(例如人源化、糖基化等等)。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(cdc)。
本文所使用的术语“功能性片段”旨在表示保留全长抗体功能的片段，例如抗原结合片段，尤其是指下述抗体片段：如fv、scfv(sc指单链)、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，peg化”)(被称为fv-peg、scfv-peg、fab-peg、f(ab′)2-peg或fab′-peg的聚乙二醇化片段)(“peg”为聚乙二醇)。
本文中所使用的术语“cdr区”或“cdr”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如kabatetal.所定义(kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.，u.s.departmentofhealthandhumanservices，nih，1991，以及以后版本)。存在三个重链cdr和三个轻链cdr。根据情况，本文所用术语cdr或cdrs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。
本文中所用的术语“fc区”或“fc部分”是本领域技术人员公知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶裂解而定义。抗体的fc部分直接参与补体活化，clq结合，c3活化和fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响取决于特定的条件，但是与clq的结合由fc部分中确定的结合位点所导致。所述结合位点是现有技术中已知的且记述在例如lukas，t.j.，等，j.immunol.(免疫学杂志)127(1981)2555-2560jrunhouse，r.，和cebra，j.j.，mol.immunol.(分子免疫学)16(1979)907-917；burton，d.r.等，nature(自然)288(1980)338-344；thommesen，j.e.等，mol.immunol.(分子免疫学)37(2000)995-1004；idusogie，e.e.，等，j.immunol.(免疫学杂志)164(2000)4178-4184；hezareh，m.等，j.virol.(病毒学杂志)75(2001)12161-12168；morgan，a.等，immunology(免疫学)86(1995)319-324；和ep0307434中。所述结合位点是例如l234，l235，d270，n297，e318，k320，k322，p331和p329(按照kabat的eu目录编号，见下)。亚型iggl，igg2和igg3的抗体通常表现出补体活化，clq结合和c3活化，而igg4不活化补体系统，不结合clq且不活化c3。优选地，fc部分是人fc部分。
本文中所用的术语“fab区“是指由免疫球蛋白的重链的vh和ch1结构域(″fab重链″)或轻链的vl和cl结构域(″fab轻链″)或其两者。
如本文使用的，术语“scfv”或“单链抗体片段”表示通过接头(例如10-25个氨基酸的短肽)线性连接在一起的抗体重链可变区和抗体轻链可变区所组成的单链，其表现出与抗原的特异性结合。
如本发明中使用的术语“肽接头”表示用于将不同的抗原结合位点和/或最终包含不同抗原结合位点的抗体片段(例如单链fv、全长抗体、vh结构域和/或vl结构域、fab、(fab)2和fc部分)连接在一起的肽，优选地其具有合成来源的氨基酸序列。肽接头可包含一个或多个以下表1中所列的氨基酸序列，以及其他任意选择的氨基酸。
如本文使用的，术语“结合”或“特异性结合”指抗体与抗原表位在体外测定中，优选在使用表达野生型抗原的cho细胞的基于细胞的elisa中的结合。结合指10-8m或更低，优选10-13m至10-9m的结合亲和力(kd、)。可通过biacore测定(pharmaciabiosensorab，uppsala，sweden)研究抗体与抗原或fcyriii的结合。结合亲和力通过术语ka(抗体/抗原复合物中抗体的结合速率常数)、kd(解离常数)和kd(kd/ka)定义。
本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。
可通过本领域已知的多种方法施用本发明的组合物。熟练技术人员将理解，施用途径和/或模式将依赖希望的结果而变化。为了通过特定施用途径施用本发明的化合物，可能需要用避免其失活的材料覆盖化合物，或与所述材料共同施用化合物。例如，可在合适的载体中，例如脂质体或稀释剂中对受试者施用化合物。可药用的稀释剂包括盐溶液和水性缓冲液。药物载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末，用于临时制备无菌的可注射的溶液或分散液。用于药物活性物质的这样的介质和试剂的用途是本领域已知的。
如本文使用的短语“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”指除了肠施用和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本发明的组合物也可包含辅料，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过上文中的灭菌程序和通过包含多种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等双重保证避免微生物的存在。也可能希望在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶实现可注射的药物形式的延长吸收。
与选择的施用途径无关，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物(可以合适的水化形式使用)和/或本发明的药物组合物配制为可药用的剂量形式。
本发明的双特异抗体含有fc片段，以此蛋白质在细胞表达后可以通过a蛋白亲和层析分离纯化，这是本发明的双特异抗体的优势之一。亲和层析后可以用离子交换、分子筛、疏水层析等方法进一步纯化。双特异抗体的纯度可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、hplc等方法鉴定。目的蛋白的分子量大约是133kd.
本发明人出人意料地发现，相比于其他双特异性抗体，本发明的非对称双特异性抗体显示出特别优异的性能，包括但不限于：两种不同的特异性各自均为单价结合(即一个抗体分子只结合一个抗原表位，例如免疫效应细胞上的表位，可以防止免疫效应细胞间发生偶联而互相杀伤)；在细胞内高水平表达；在体内半衰期更长；具有更高的生物学活性；更加有效地杀伤肿瘤细胞(例如b细胞)；更加有效地募集免疫效应细胞(例如t细胞和/或b细胞)；更加小的副作用。
具体地，相比于双特异性抗体技术中备受关注的双特异性t细胞募集物(bite)类型的双特异性抗体(例如blinatumomab)，本发明的抗体结构表现出更加优异的性能。
为了构建以cd89阳性细胞为免疫效应细胞的双特异抗体，本发明人首先制备了抗cd89单克隆抗体。该抗体通过常规杂交瘤技术获得，然后通过抗体基因克隆确定了该抗体重链和轻链可变区dna序列，进而得到该抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列(分别如seqidno：21、22、23、24所示)。然后，在此基础上，本发明人分别构建了bite结构的双特异性抗体(抗cd20-抗cd89双特异抗体)和本发明结构的非对称双特异性抗体，其中cd20抗体利用rituxan的序列，在两个scfv之间也使用了与blinatumomab一样的连接序列。结果发现，使用bite结构的抗cd20-抗cd89双特异性抗体在hek293细胞和cho均不表达，或者表达水平极低，难以开展进一步实验，即便尝试多个不同连接序列和转染方法，也依然无法获得所需表达水平。相反，利用本发明的非对称双特异性抗体能够很好地在hek293细胞和cho细胞得到表达，而且具有很好的生物学活性。重要的是，本发明的抗体具有更加优异的体内半衰期。
为了检验该新型双特异抗体结构的通用性，我们又构建了以cd19和cd3为靶标的双特异抗体，这个双特异抗体我们采取抗cd19fab-抗cd3scfv结构。我们发现这个结构的双特异抗体也能很好地在293细胞和cho细胞得到表达，因此证明本发明的非对称双特异抗体具有易于表达的特点。进而，与抗cd19scfv-cd3scfv双特异抗体(即bite)的比较，我们发现我们发明的asbsab不仅具有容易表达的特点，更具有半衰期长、易于纯化的特点，同时，它保留了bite与免疫效应细胞和肿瘤细胞以单价结合的优点。因此，该asbsab双特异抗体分子结构可以解决bite的缺点，具有很高的应用价值。
提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。
实施例
实施例1.抗cd89单克隆抗体制备
为了制备以cd89细胞为免疫效应细胞的双特异抗体，我们必须首先获得一个对cd89具有高亲和力的单克隆抗体。
我们用人cd89重组蛋白质(sinobiologicals)免疫balb/c小鼠(上海斯莱克实验动物中心)，取免疫小鼠脾淋巴细胞，与sp2/0骨髓瘤细胞(atcc)融合制备杂交瘤，将融合后的细胞在96孔细胞培养板进行克隆培养，用以cd89包被elisa检测阳性克隆。取阳性克隆的杂交瘤细胞进行扩大培养，并进行亚克隆培养。由此获得了若干抗cd89抗体杂交瘤细胞株，通过elisa和流式细胞仪证明对cd89具有高亲和力。确定抗cd89单克隆抗体杂交瘤细胞株。然后通过对杂交瘤细胞的抗体基因克隆获得了抗cd89的重链和轻链可变区dna序列(seqidno：21、22)，并进而得到重链和轻链的可变区氨基酸序列(seqidno：23、24)，通过序列分析确定了该抗体轻链和重链的六个cdr区域序列(seqidno：9、10、11、12、13、14)。
实施例2.抗cd89-抗cd20非对称双特异性抗体的构建
在我们构成的双特异抗体的三条多肽链中，第一条链包括抗cd89抗体vl和人kappacl，cd89抗体vl用抗cd89上游和下游引物(seqidno：25、26)用pcr扩增自实施例1中所得的抗体基因；人kappacl用cl上游和下游引物(seqidno：27、28)用pcr扩增自质粒pfuse2-clig-hk(invivogen)，再通过重叠pcr合成完整的抗cd89vl-cl嵌合轻链，克隆到表达质粒pcdna3.1。第二条多肽链是抗cd89vh，人igg恒定区，和抗cd20scfv，抗cd89抗体vh用相应上游和下游引物(seqidno：29、30)用pcr扩增自实施例1中所得的抗体基因，人igg恒定区用上下游引物(seqidno：31、32)从相关质粒(pcdna3.1-higg1fc-hole，人工基因合成，苏州金唯智，seqidno：51)扩增，其中fc含有凹洞突变(t366s、l368a、y407v，对应于本申请中seqidno：4的146、148和187位)，抗cd20scfv利用上下游引物从(seqidno：33、34)相关质粒(pcdna3.1-anti-cd20-scfv，人工基因合成，苏州金唯智，seqidno：52)扩增，最后用重叠pcr合成完整的cd89vh-人iggch(凹洞)-连接序列(g4s)3-抗cd20scfv，克隆到表达质粒pcdna3.1中。第三条链是含有铰链区的人fc，含有凸起突变(t366w，对应于本申请中seqidno：5的146位)，用上下游引物(seqidno：35、36)从质粒(pcdna3.1-higg1fc-knob，人工基因合成，苏州金唯智，seqidno：53)扩增获得，并克隆到表达载体pcdna3.1中。以上三个目的序列及载体前后分别加入agei和sali两个酶切位点。将表达载体用agei和sali两个酶来进行双酶切，按照无缝克隆的方法将上步中得到的dna片段按照序列设计的顺序连接起来。用无缝克隆连接酶试剂盒
此外，本发明人还构建了含有fc区域297位突变(从asn到ala)的抗cd89-抗cd20非对称双特异性抗体(cd89-cd20mut)，该突变目的是使得fc区丧失adcc效应功能。将如上所述得到的重组质粒进行基因定位突变，将第二链重链(凹洞)和第三链fc(凸起)片段这两个载体的fc区域297位asn突变ala(对应于本申请中seqidno：4和5的77位)，使其丧失adcc效应的功能。之后进行菌液pcr鉴定(如图2所示)，然后dna测序，筛选出dna序列正确的克隆。
实施例3.抗cd19-抗cd3非对称双特异性抗体的构建
在这个双特异抗体，fab部分是抗cd19抗体，其抗体vl和vh序列(seqidno：37、38)来自一个已经公开的鼠源抗cd19抗体；scfv部分是抗cd3抗体，其svfv序列(seqidno：8)来自一个已经公开的scfv抗体。第一条多肽链包括抗cd19抗体vl和人kappacl，vl通过用上游和下游引物(seqidno：39、40)经过pcr从相关质粒(pcdna3.1-anti-cd19-scfv，人工基因合成，苏州金唯智，seqidno：54)扩增；人kappacl用cl上游和下游引物(seqidno：41、42)用pcr获得，再通过重叠pcr合成完整的抗cd19vl-cl嵌合轻链，克隆到表达质粒pcdna3.1。第二条多肽链是抗cd19vh，人igg恒定区，和抗cd3scfv，抗cd19抗体vh用相应上游和下游引物(seqidno：43、44)用pcr从相关质粒(pcdna3.1-anti-cd19-scfv，人工基因合成，苏州金唯智，seqidno：54)扩增，人igg恒定区用上下游引物(seqidno：45、46)从相关质粒(pcdna3.1-higg1fc-hole，seqidno：51)扩增，其fc含有凹洞突变，抗cd3scfv利用上下游引物(seqidno：47、48)从相关质粒(pcdna3.1-anti-cd3-scfv，人工基因合成，苏州金唯智，seqidno：55)扩增，最后用重叠pcr合成完整的cd19vh-人iggch(凹洞)-连接序列(g4s)3-抗cd3scfv，克隆到表达质粒中。第三条链与实例2中的第三条链相同。目的序列通过与实例2相同的方法克隆到表达质粒，dna测序，获得具有正确dna序列的克隆。
实施例4.双特异性抗体表达及鉴定
将如上所述构建的编码双特异抗体的三条多肽链的质粒分别转化感受态细菌dh5α，通过细菌培养扩增细菌并纯化质粒dna。将纯化后的质粒dna用共转染法瞬时转染293f细胞。设gfp质粒作为阳性对照，同时感染293f细胞以观察感染效率。我们分别用抗cd89-抗cd20双特异抗体质粒和抗cd19-抗cd3双特异抗体质粒转染了293细胞，转染48小时后，用elisa双抗夹心法检测重组抗体的表达量，证明两个双特异抗体都能够很好地表达。转染72小时后，收集转染细胞的培养上清，用proteina亲合层析纯化抗体蛋白。上样前将样品溶液经0.45um的滤膜过滤，以除去细胞、聚合物等杂质，加入1/10体积结合缓冲液，从而使样品与结合缓冲液ph相同。样品流完后，用5ml(5-10倍体积)结合缓冲液流洗柱子。纯化的两个双特异抗体用sds-page进行分析，在非还原电泳，呈现133kd条带，在还原电泳，呈现77kd和26-29kd条带，与预测的分子量相同(图3)。
实施例5.流式细胞仪鉴定抗体与各个靶标的结合力
为了鉴定经过蛋白质a纯化的抗cd89-抗cd20和抗cd19-抗cd3两个双特异抗体对靶标的结合能力，我们用cd19和cd20阳性的raji细胞(atcc)、人外周血分离的cd89阳性pmn细胞、和cd3阳性的jurkat细胞(atcc)进行了流式细胞仪实验。将raji、pmn、jurkat三种细胞分别用吸管吹打成单细胞悬液，用pbs重悬细胞后计数，取1x106细胞，加入不同稀释度的双特异性抗体，冰浴45分钟，pbs洗两遍，加fitc-山羊抗人igg(h+l)二抗标记，冰浴45分钟，pbs洗两遍；500ulpbs重悬后，将细胞加入流式管中，用流式细胞仪检测并计算荧光强度。阴性对照组为无关抗体对照。结果显示这两种双特异抗体分别对它们相应的抗原有很好的亲和力(图4、图5)。
实施例6.抗cd89-抗cd20双特异性抗体杀伤肿瘤细胞效应检测
为了确定抗cd89-抗cd20双特异性抗体对cd20阳性细胞的杀伤作用，我们利用cytotox96试剂盒对raji细胞进行了检测。cytotox96试剂盒可定量检测乳酸脱氢酶(ldh)的含量，ldh是一种稳定的胞质酶，细胞裂解时可以释放出来，其释放方式与[51cr]在放射性分析中释放的方式基本相同，ldh的释放量与死亡的细胞数量成比例。向96孔板加入固定数量的raji细胞，加入效应细胞人pmns或pbmcs，加入用0.1％bsa/pbs(w/v)不同稀释梯度稀释双特异性抗体，加入裂解液(lysissolution)(10x)，孵育4小时后，250xg离心4分钟。用排枪从每孔转移50μl上清至96酶标板中，向每孔加入50μl底物，用铝箔纸或不透明的盒子覆盖板子使之避光，室温孵育30分钟。结果见图6。
在pmn存在的条件下(绝大部分是嗜中性粒细胞)，该抗cd89-抗cd20双特异性抗体能非常有效的杀伤肿瘤细胞，而对照组美罗华抗体(cd20-ig)却不能通过pmn介导杀伤肿瘤细胞(pmn细胞缺乏nk细胞)，同时，抗cd89-抗cd20双特异性抗体杀伤肿瘤细胞的作用与fc介导的adcc无关，因为把抗cd89-抗cd20双特异性抗体的fc突变(cd89-cd20mut)以去除adcc功能后仍然能很好地杀死肿瘤细胞(图6)，说明抗cd89-抗cd20双特异抗体是通过cd89募集pmn效应细胞(绝大部分是嗜中性粒细胞)的。
在pbmc存在的条件下，本发明的抗cd89-抗cd20双特异性抗体能杀伤肿瘤细胞，但是把fc突变(cd89-cd20mut)以去除adcc功能后，该双特异抗体失去对肿瘤的杀伤能力，说明通过pbmc的杀伤能力是fc介导的adcc作用。同理，对照组美罗华抗体(cd20-ig)能有效地杀伤肿瘤细胞，通过adcc作用。
本发明人首次成功地构建出，基于cd89表面抗原，通过pmn(绝大部分是嗜中性粒细胞)介导的细胞杀伤功能来杀伤肿瘤细胞的双特异性抗体，这在免疫治疗领域是一大突破，开拓了一个新的细分领域。
实施例7.抗cd19-抗cd3双特异性抗体介导的t细胞体外杀伤能力检测
我们利用cytotox96非放射性细胞毒性试剂盒检测了抗cd19-抗cd3双特异性抗体对cd19阳性细胞的杀伤作用，抗体介导t细胞杀伤能力。所用t细胞来源于人新鲜外周血分离的pbmc细胞，经过il-2(10u/ml)和cd3抗体激活4-5天后，收集备用。肿瘤细胞为高表达cd19抗原的raji细胞。肿瘤靶细胞与效应t细胞靶效比例为1∶10。双特异性抗体工作浓度按照十倍梯度稀释。结果显示，抗cd19-抗cd3双特异性抗体能够非常有效地介导t细胞对cd19阳性肿瘤细胞的杀伤作用，ec50值约2ng/ml(图7)。
这一实验结果表明，本发明的非对称双特异性抗体结构不仅仅可用于抗cd89和抗cd20这两个具体靶标，而是可作为一个新的双特异性抗体平台广泛适用于多种不同靶标。具体地，本发明的非对称双特异性抗体结构克服了现有技术(例如bite技术)的诸多缺陷，其空间结构的灵活度和适应性使得其能够构建出多种针对不同靶标的双特异性抗体，用于多种不同用途。
实施例8.抗cd89-抗cd20双特异性抗体的血清半衰期检测
我们以抗cd89-抗cd20双特异抗体为例研究了其在动物体内药物动力学。取6-8周龄的c57bl/6雌鼠，每组5只，以每鼠100μg抗体经尾静脉注射美罗华单抗或双特异性抗体。并在注射后的2、4、8、24、48、72、96、120、144小时眼眶取血，通过elisa双抗夹心方法检测体内igg的含量(图8)。结果出人意料地发现本发明的双特异抗体相比于bite(半衰期仅为2.1小时)有更长的体内半衰期，其半衰期与美罗华单抗相类似，因此，本发明的抗体综合了普通单抗的长半衰期与现有双特异性抗体的双特异性两种优点，为临床治疗提供了更加有力的武器。
实施例9.抗cd89-抗cd20双特异性抗体对肿瘤的体内治疗实验
将处于对数生长期的cd20-llc细胞(稳定表达人cd20抗原的小鼠lewis肺癌细胞系)接种于小鼠右侧后肢外侧皮下，每只小鼠接种1x106细胞，接种后待肿瘤体积长到约100-150mm3时，随机把小鼠分成组，每组6-8只小鼠，各组每周一次给药，采用尾静脉注射给药。治疗组给予体积0.2ml，剂量10mg/kg的药物，对照组给予相同体积的pbs。每隔两天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线，直到pbs组肿瘤长到约1000mm3。结果显示，在野生型小鼠模型试验中，抗cd89-抗cd20双特异性抗体对肿瘤杀伤效率很低，基本与pbs对照组相当，这是由于野生小鼠体内没有cd89受体，故抗cd89-抗cd20基本上没有抗肿瘤作用，相反，美罗华抗体具有不错的抗肿瘤能力，能抑制肿瘤的生长(图9)。为了确定抗cd89-抗cd20双特异抗体的抗肿瘤作用，我们进一步在fcαri(cd89)转基因小鼠模型中进行了研究，我们发现抗cd89-抗cd20双特异性抗体具备显著抑制肿瘤生长的能力，出人意料地，其抗肿瘤效果甚至显著优于商业化的美罗华抗体(cd20-igg)(图9)。
实施例10.抗cd19-抗cd3双特异性抗体对肿瘤的体内治疗实验
将处于对数生长期的raji细胞接种于裸鼠右侧后肢外侧皮下，每只小鼠接种3x106细胞悬液，每组6-8只小鼠。同时将预先体外扩增的人t淋巴细胞，尾静脉注射小鼠体内，1x107每只小鼠。同时给药抗cd19-抗cd3双特异性抗体，抗体每3天给一次药，共给3次(第0、3、6天)，剂量5mg/kg。均采用尾静脉注射给药。pbs组为对照组，t细胞组只注射t细胞，约每隔两天用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长度和宽度，计算肿瘤体积，从治疗给药当天计0天，绘制肿瘤生长曲线，直到pbs组肿瘤长到约1000mm3。结果显示，在裸鼠-人t细胞模型试验中，抗cd19-抗cd3双特异性抗体在体内激活t细胞作用下，对肿瘤杀伤效率很高。肿瘤于接种后15天，才达到100-150mm3的水平，显著晚于pbs组。没有接受抗体药物治疗，只注射t细胞的小鼠，其肿瘤生长情况基本与pbs对照组相当(图10)。
以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。
本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。
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[9]vanegmondm，vangarderene，vansprielabetal.fcalpharipositiveliverkupffercells：reappraisalofthefunctionofimmunoglobulinainimmunity.[j].natmed，2000；6(6)：680.
[10]fiedericgeissmann，pierrelaunay，benoitpasquireetal.asubsetofhumandendriticcellsexpressesigafcreceptor(cd89)，whichmediatesinternalizationandactivationuponcrosslinkingbyigacomplexes.[j]j.ofimmunology，2001；166:346-348.
[11]herra.b.，c.l.whiet，c.miblunr，c.wu，etal.bivalentbindingofigaitofcαrisuggestsamechanismforcytokineactivationoflgaphagoeytosis.[j].j.mol.biol.2003.327:645-657.
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[18]ridgway，etal.，′knobs-into-holes′engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerization.proteinengineeringvol.9no.7pp.617-621，1996
seqidno：1所述第一链(抗cd89轻链抗体vl和cl)氨基酸序列
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaserleuglygluargvalserleuthrcysargalaserglnaspileglyserserleuasntrpleuglnglngluproaspglythrilelysargleuiletyralathrserserleuaspserglyvalprogluargpheserglyserargserglyserhistyrserleuthrileserserleuglusergluaspphevalasptyrtyrcysleuglntyralasertyrprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglucys
seqidno：2所述第二链的抗cd89重链抗体vh和ch1氨基酸序列
glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglygluthrvallysilesercyslysalaserglytyrvalphethrasntyrglymetasntrpvallysglnthrproglylysglyleulystrpmetglytrpileasnthrtyrthrglyargprothrseralaaspaspphelysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyrleuglnileasnasnleulysasngluaspthralathrtyrphecysserserglnglypheserphethrsertrpglyglnglythrleuvalthrvalseralaalaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys
seqidno：3所述第二链的scfv区(抗cd20的scfv)氨基酸序列
glnalatyrleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyalaservallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyrasnmethistrpvallysglnthrproargglnglyleuglutrpileglyalailetyrproglyasnglyaspthrsertyrasnglnlysphelysglylysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecysalaargvalvaltyrtyrserasnsertyrtrptyrpheaspvaltrpglythrglythrthrvalthrvalserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglnilevalleuserglnserproalaileleuseralaserproglyglulysvalthrmetthrcysargalaserserservalsertyrmethistrptyrglnglnlysproglyserserprolysprotrpiletyralaproserasnleualaserglyvalproalaargpheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrileserargvalglualagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserpheasnproprothrpheglyalaglythrlysleugluleu
seqidno：4所述第二链的fc区(fc-hole片段)的核酸序列
asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyralaserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleusercysalavallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleuvalserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
seqidno：5所述第三链的fc区(fc-knob片段)的氨基酸序列
asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyralaserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaprolleglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleutrpcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
seqidno：6所述第一链的序列(抗cd19轻链抗体vl和cl)氨基酸序列
aspileglnleuthrglnserproalaserleualavalserleuglyglnargalathrilesercyslysalaserglnservalasptyraspglyaspsertyrleuasntrptyrglnglnileproglyglnproprolysleuleuiletyraspalaserasnleuvalserglyileproproargpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehisprovalglulysvalaspalaalathrtyrhiscysglnglnserthrgluaspprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysserpheasnargglyglucys
seqidno：7所述第二链的抗cd19重链抗体vh和ch1氨基酸序列
glnvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyserservallysilesercyslysalaserglytyralaphesersertyrtrpmetasntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpileglyglniletrpproglyaspglyaspthrasntyrasnglylysphelysglylysalathrleuthralaaspgluserserserthralatyrmetglnleuserserleualasergluaspseralavaltyrphecysalaargarggluthrthrthrvalglyargtyrtyrtyralametasptyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplyslysvalgluprolyssercys
seqidno：8所述第二链的scfv区(抗cd3的scfv)核酸序列
aspilelysleuglnglnserglyalagluleualaargproglyalaservallysmetsercyslysthrserglytyrthrphethrargtyrthrmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpileglytyrileasnproserargglytyrthrasntyrasnglnlysphelysasplysalathrleuthrthrasplysserserserthralatyrmetglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcysalaargtyrtyraspasphistyrcysleuasptyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserservalgluglyglyserglyglyserglyglyserglyglyserglyglyvalaspaspileglnleuthrglnserproalailemetseralaserproglyglulysvalthrmetthrcysargalaserserservalsertyrmetasntrptyrglnglnlysserglythrserprolysargtrpiletyraspthrserlysvalalaserglyvalprotyrargpheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproleuthrpheglyalaglythrlysleugluleulys
seqidno：9抗cd89抗体vlcdr1
glnaspileglyserser
seqidno：10抗cd89抗体vlcdr2
alathrser
seqidno：11cd89抗体vlcdr3
leuglntyralasertyrprotrpthr
seqidno：12抗cd89抗体vhcdr1
glytyrvalphethrasntyrgly
seqidno：13抗cd89抗体vhcdr2
ileasnthrtyrthrglyargpro
seqidno：14抗cd89抗体vhcdr3
serserglnglypheserphethrser
seqidno：15抗cd19抗体vlcdr1
glnservalasptyraspglyaspsertyr
seqidno：16抗cd19抗体vlcdr2
aspalaser
seqidno：17抗cd19抗体vlcdr3
glnglnserthrgluaspprotrpthr
seqidno：18抗cd19抗体vhcdr1
glytyralaphesersertyrtrp
seqidno：19抗cd19抗体vhcdr2
iletrpproglyaspglyaspthr
seqidno：20抗cd19抗体vhcdr3
alaargarggluthrthrthrvalglyargtyrtyrtyralametasptyr
seqidno：21抗cd89重链可变区dna序列
seqidno：22抗cd89轻链可变区dna序列
seqidno：23抗cd89重链可变区氨基酸序列
glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglygluthrvallysilesercyslysalaserglytyrvalphethrasntyrglymetasntrpvallysglnthrproglylysglyleulystrpmetglytrpileasnthrtyrthrglyargprothrseralaaspaspphelysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyrleuglnileasnasnleulysasngluaspthralathrtyrphecysserserglnglypheserphethrsertrpglyglnglythrleuvalthrvalserala
seqidno：24抗cd89轻链可变区氨基酸序列
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaserleuglygluargvalserleuthrcysargalaserglnaspileglyserserleuasntrpleuglnglngluproaspglythrilelysargleuiletyralathrserserleuaspserglyvalprogluargpheserglyserargserglyserhistyrserleuthrileserserleuglusergluaspphevalasptyrtyrcysleuglntyralasertyrprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys
seqidno：25抗cd89vl片段的上游引物
taagcttggtaccgagctcggatccgccgccaccatggtcagctactgggacacc
seqidno：26抗cd89vl片段的下游引物
gatggtgcagccacagttcgtttgatttccagcttggtgc
seqidno：27cl片段的上游引物
gcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatc
seqidno：28cl片段的下游引物
gcgggccctctagactcgagcggccgcgtcgacctaacactctcccctgttgaagctct
seqidno：29cd89vh片段的上游引物
taagcttggtaccgagctcggatccgccgccaccatggtcagctactgggacacc
seqidno：30cd89vh片段的下游引物
gatgggcccttggtggaggctgcagagacagtgaccagag
seqidno：31人igg恒定区上游引物
ctctggtcactgtctctgcagcctccaccaagggcccatc
seqidno：32人igg恒定区下游引物
tttacccggagacagggagaggctcttctgcgtg
seqidno：33cd20scfv片段的上游引物
gtggtggtagcggtggcggtggtagtcaggcttatttgcaacagtctggcgcg
seqidno：34cd20scfv片段的下游引物
ccaagctggagctggaataggtcgacgcggccgctcgagtctagagggcccgcg
seqidno：35含有铰链区的人fc(凸起)的上游引物
aagcttggtaccgagctcggatccgccgccaccatggtcagctactgggacac
seqidno：36含有铰链区的人fc(凸起)的下游引物
cgcgggccctctagactcgagcggccgcgtcgacctatttacccggagacagggagag
seqidno：37抗cd19轻链可变区氨基酸序列
aspileglnleuthrglnserproalaserleualavalserleuglyglnargalathrilesercyslysalaserglnservalasptyraspglyaspsertyrleuasntrptyrglnglnileproglyglnproprolysleuleuiletyraspalaserasnleuvalserglyileproproargpheserglyserglyserglythraspphethrleuasnilehisprovalglulysvalaspalaalathrtyrhiscysglnglnserthrgluaspprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys
seqidno：38抗cd19重链可变区氨基酸序列
glnvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyserservallysilesercyslysalaserglytyralaphesersertyrtrpmetasntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpileglyglniletrpproglyaspglyaspthrasntyrasnglylysphelysglylysalathrleuthralaaspgluserserserthralatyrmetglnleuserserleualasergluaspseralavaltyrphecysalaargarggluthrthrthrvalglyargtyrtyrtyralametasptyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser
seqidno：39抗cd19vl片段的上游引物
gtctgcttctcacaggatctagttccggagatatccaactgacccagagc
seqidno：40抗cd19vl片段的下游引物
gatggtgcagccacagttcgcttgatttccagttttgtgc
seqidno：41cl片段的上游引物
aaactggaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttc
seqidno：42cl片段的下游引物
gcgggccctctagactcgagcggccgcgtcgacctaacactctcccctgttgaagctct
seqidno：43抗cd19vh片段的上游引物
tctgcttctcacaggatctagttccggacaggtgcagctccagcaaagc
seqidno：44抗cd19vh片段的下游引物
gatgggcccttggtggaggcgctgctcactgtcactgtgg
seqidno：45人igg恒定区片段的上游引物
gggaaccacagtgacagtgagcagcgcctccaccaagggcccatcggt
seqidno：46人igg恒定区片段的下游引物
tttacccggagacagggagaggctcttctgcgtg
seqidno：47抗cd3scfv片段的上游引物
ggtagtgacatcaaactccaacagagcggagccgaac
seqidno：48抗cd3scfv片段的下游引物
gcgggccctctagactcgagcggccgcgtcgacctacttcagctccagcttggtgccg
seqidno：49不含有fc区域297位asn至ala突变的所述第二链的fc区(fc-凹洞片段)的序列
asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleusercysalavallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleuvalserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
seqidno：50不含有fc区域297位asn至ala突变的所述第三链的fc区(fc-凸起片段)的序列
asplysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetlleserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleutrpcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys
seqidno：51人工基因合成igg恒定区(包含有fc-凹洞片段)的dna序列
gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcagccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgtcctgcgcggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
seqidno：52人工基因合成的抗cd20-scfv的dna序列
seqidno：53人工基因合成igg恒定区(包含有fc-凸起片段)的dna序列
seqidno：54人工基因合成的抗cd19-scfv的dna序列
gatatccaactgacccagagccccgctagcctggccgtcagcctgggccagagggccaccatttcctgcaaggctagccagagcgtcgactacgacggcgactcctacctgaactggtaccagcagattcctggccagcctcccaagctgctgatctatgacgcctccaatctggtgagcggcatcccccccagattttccggcagcggctccggcaccgattttaccctgaacatccaccccgtcgagaaagtggatgccgccacctaccactgccagcagagcacagaggatccctggaccttcggaggcggcacaaaactggaaatcaagggcggcggcggaagcggaggaggaggatccggaggaggcggaagccaggtgcagctccagcaaagcggcgccgagctggtgagacccggaagctccgtgaaaatcagctgcaaggcctccggctacgccttctcctcctactggatgaactgggtgaagcagagacctggacaaggcctcgagtggatcggacagatctggcccggcgacggagacaccaactacaatggcaaatttaaaggaaaagccacactgaccgctgacgagagctcctccacagcctatatgcaactgagctccctggcctccgaggatagcgccgtctacttctgcgctaggagagagaccaccaccgtgggcagatattactacgccatggattactggggccagggaaccacagtgacagtgagcagc
seqidno：55人工基因合成的抗cd3-scfv的dna序列
序列表
<110>上海市同济医院
<120>一种非对称双特异性抗体
<130>mp1703081
<160>55
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>214
<212>prt
<213>artificialsequence
<220>
<223>chain1
<400>1
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaserleugly
151015
gluargvalserleuthrcysargalaserglnaspileglyserser
202530
leuasntrpleuglnglngluproaspglythrilelysargleuile
354045
tyralathrserserleuaspserglyvalprogluargphesergly
505560
serargserglyserhistyrserleuthrileserserleugluser
65707580
gluaspphevalasptyrtyrcysleuglntyralasertyrprotrp
859095
thrpheglyglyglythrlysleugluilelysargthrvalalaala
100105110
proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly
115120125
thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala
130135140
lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln
145150155160
gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser
165170175
serthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysvaltyr
180185190
alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser
195200205
pheasnargglyglucys
210
<210>2
<211>219
<212>prt
<213>artificialsequence
<220>
<223>chain2vhch1
<400>2
glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu
151015
thrvallysilesercyslysalaserglytyrvalphethrasntyr
202530
glymetasntrpvallysglnthrproglylysglyleulystrpmet
354045
glytrpileasnthrtyrthrglyargprothrseralaaspaspphe
505560
lysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyr
65707580
leuglnileasnasnleulysasngluaspthralathrtyrphecys
859095
serserglnglypheserphethrsertrpglyglnglythrleuval
100105110
thrvalseralaalaserthrlysglyproservalpheproleuala
115120125
proserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleu
130135140
vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly
145150155160
alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser
165170175
glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleu
180185190
glythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthr
195200205
lysvalasplyslysvalgluprolyssercys
210215
<210>3
<211>241
<212>prt
<213>artificialsequence
<220>
<223>chain2scfv
<400>3
glnalatyrleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyala
151015
servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr
202530
asnmethistrpvallysglnthrproargglnglyleuglutrpile
354045
glyalailetyrproglyasnglyaspthrsertyrasnglnlysphe
505560
lysglylysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr
65707580
metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys
859095
alaargvalvaltyrtyrserasnsertyrtrptyrpheaspvaltrp
100105110
glythrglythrthrvalthrvalserglyglyglyglyserglygly
115120125
glyglyserglyglyglyglyserglnilevalleuserglnserpro
130135140
alaileleuseralaserproglyglulysvalthrmetthrcysarg
145150155160
alaserserservalsertyrmethistrptyrglnglnlysprogly
165170175
serserprolysprotrpiletyralaproserasnleualasergly
180185190
valproalaargpheserglyserglyserglythrsertyrserleu
195200205
thrileserargvalglualagluaspalaalathrtyrtyrcysgln
210215220
glntrpserpheasnproprothrpheglyalaglythrlysleuglu
225230235240
leu
<210>4
<211>227
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