本发明属于海藻多糖的提取技术领域，具体地，涉及一种d-海藻糖提纯工艺。
背景技术：
海藻糖，也即d-海藻糖，是一种安全、可靠的天然糖类，1832年由wiggers将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来，随后的研究发现海藻糖在自然界中许多食用动、植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇粪、海藻类、豆类虾、面包、啤酒厦酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。
海藻糖具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抑制补体激活及吸收重金属等功能，另外，因具有安全，可靠，环保的特性，将其用于兽药的生产具有较高的市场前景。
在现有技术中，一般采用真空热浓缩方法提取浓缩蕨麻多糖，该方法容易使蕨麻多糖的抗氧化活性降低，降低其的药用价值，另外，现有的方法中仅对蕨麻多糖进行粗提纯，提纯出的粗蕨麻多糖内含杂质较多，不利于海藻糖的开发应用。
目前海藻糖制备方法主要有微生物抽提法、发酵法等。
微生物抽提法成本高，提取源有限，很大程度制约着海藻糖大规模工业化生产。
发酵法转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制困难，因而对降低生产成本、促进推广应用等方面很不利。
cn200610016527.9公开了一种海藻糖的分离纯化方法，具体步骤是：向每克海藻糖酶反应液中加入0.14-0.28个糖化酶单位，在50-60℃、ph3.5-5.5条件下水解6-12h，再向糖化酶酶解液中接种3-10%重量的酿酒酵母，在25-30℃，ph5.5-7.5条件下培养6-16h，钝化后发酵液离心、超滤、离子交换、浓缩、结晶干燥得到海藻糖。但此法周期过长、海藻糖收率不高、后期发酵液中成分比较复杂，分离也有一定难度，不适合工业生产。
因此，如何发展一种可改善上述技术缺陷的褐藻糖胶提取方法，为相关技术领域急需解决的问题。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种d-海藻糖提纯工艺。
本发明提供的一种d-海藻糖提纯工艺，解决了现有技术中的方法提取的d-海藻糖纯度低，d-海藻糖提取率低的问题。
根据本发明提供的一种d-海藻糖提纯工艺，包括如下步骤：
步骤（1）：取新鲜海带清洗3-5次，沥干，切碎，用6-8倍于海带重量的去离子水室温浸泡1-2天，浸泡完成后进行打浆处理，制得浆液；
步骤（2）：向浆液中加入酸性纤维素酶，置于40-54℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在4.5-6.5之间，酶解过程中不停搅拌；
步骤（3）：加入碱性果胶酶，置于50-65℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在8.0-10.0之间，酶解过程中不停搅拌；
步骤（4）：离心机离心除杂，得到酶解液；
步骤（5）：将酶解液通过超滤膜进行超滤处理，酶解液依次经过截留分子量为300的超滤膜及截留分子量为400的超滤膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提纯溶液；
步骤（6）：将d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇混合进行脱水，使d-海藻糖从溶液中完全析出；
步骤（7）：使d-海藻糖从d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的混合溶液中完全分离出来；
步骤（8）：干燥得到提纯的d-海藻糖。
优选地，所述步骤（5）在进行超滤处理前，将所述超滤膜先用氢氧化钠溶液清洗，再用清水进行清洗，使所述超滤膜的ph值达到7.0-7.4。
优选地，所述步骤（7）中所述d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的体积比为1：4-5。
优选地，所述步骤（4）中离心机转速为1000-1200r/min，离心时间为20-30min。
优选地，所述超滤处理过程中使用的过滤膜为聚偏氟乙烯滤膜。
优选地，所述酸性纤维素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
优选地，所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纤维素酶的方法为先将里氏木霉a3进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，在30℃条件下培养5-8天，在15℃条件下放置7-10天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到里氏木霉91-3菌株。
优选地，所述步骤（8）干燥温度为60-80℃。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明的特色包括两个部分，一方面是在海藻糖从海带细胞壁中释放阶段，本发明用酸性纤维素酶和碱性果胶酶对细胞壁进行离散，由于酶具有单一性，纤维素酶和果胶酶可以将细胞壁的主要组成成分纤维素和果胶质分解，从而将细胞壁破坏，使其中的海藻糖释放出来，在这个过程中由于本发明选择在酸性纤维素酶和碱性果胶酶最适的ph条件和温度条件进行，两种酶的活性达到最大，结果使纤维素和果胶质分解彻底，细胞壁离散完全，最终使海藻糖充分释放；另一方面，由于海带细胞壁中除了还有海藻糖外还含有其他糖类、蛋白质、无机物等成分，因此必须要进行更进一步的分离才可获得纯度较高的海藻糖，海藻糖的分子量为320，因此本发明使用超滤方法，采用不同的超滤膜，较准确地将海藻糖分离出来。采用本发明的提纯工艺可使提纯率较一般的提纯方法提高4到7个百分点；
（2）本发明未使用强酸、强碱及有毒的有机溶剂，做到了清洁环保，且本发明方法中所产生的废弃液和废渣可用来生产酵母膏，几乎无排放；
（3）本发明提取的d-海藻糖具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抑制补体激活及吸收重金属等作用，因此可用于兽药的制备。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供的一种d-海藻糖提纯工艺，解决了现有技术中的方法提取的d-海藻糖纯度低，d-海藻糖提取率低的问题。
根据本发明提供的一种d-海藻糖提纯工艺，包括如下步骤：
步骤（1）：取新鲜海带清洗3-5次，沥干，切碎，用6-8倍于海带重量的去离子水室温浸泡1-2天，浸泡完成后进行打浆处理，制得浆液。其中浸泡的目的是为了使海带细胞膨胀，使细胞壁中的各种成分处于活跃状态，利于酶解反应和分离提纯；
步骤（2）：向浆液中加入酸性纤维素酶，置于40-54℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在4.5-6.5之间，酶解过程中不停搅拌。由于ph控制在4.5-6.5之间，温度控制在40-54℃的时候，酸性纤维素酶的活性最高，因此酶解效果也是最好的，可将细胞壁中含有的纤维素酶解，从而破坏细胞壁，而使其中的褐藻糖胶释放出来；
步骤（3）：加入碱性果胶酶，置于50-65℃的水浴中酶解2-6h，ph控制在8.0-10.0之间，酶解过程中不停搅拌，由于ph控制在8.0-10.0之间，温度控制在50-65℃的时候，果胶酶的活性最高，因此酶解效果也是最好的，可将细胞壁中含有的果胶质酶解，从而破坏细胞壁，而使其中的褐藻糖胶释放出来；
步骤（4）：离心机离心除杂，得到酶解液；
步骤（5）：将酶解液通过超滤膜进行超滤处理，酶解液依次经过截留分子量为300的超滤膜及截留分子量为400的超滤膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提纯溶液；
步骤（6）：将d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇混合进行脱水，使d-海藻糖从溶液中完全析出；
步骤（7）：使d-海藻糖从d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的混合溶液中分离出来；
步骤（8）：干燥得到提纯的d-海藻糖。
优选地，所述步骤（5）在进行超滤处理前，将所述超滤膜先用氢氧化钠溶液清洗，再用清水进行清洗，使所述超滤膜的ph值达到7.0-7.4。
优选地，所述步骤（7）中所述d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的体积比为1：4-5。
优选地，所述步骤（4）中离心机转速为1000-1200r/min，离心时间为20-30min。
优选地，所述超滤处理过程中使用的过滤膜为聚偏氟乙烯滤膜。
优选地，所述酸性纤维素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
优选地，所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纤维素酶的方法为先将里氏木霉a3进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，在30℃条件下培养5-8天，在15℃条件下放置7-10天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。
优选地，所述步骤（8）干燥温度为60-80℃。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
（1）本发明的特色包括两个部分，一方面是在海藻糖从海带细胞壁中释放阶段，本发明用酸性纤维素酶和碱性果胶酶对细胞壁进行离散，由于酶具有单一性，纤维素酶和果胶酶可以将细胞壁的主要组成成分纤维素和果胶质分解，从而将细胞壁破坏，使其中的海藻糖释放出来，在这个过程中由于本发明选择在酸性纤维素酶和碱性果胶酶最适的ph条件和温度条件进行，两种酶的活性达到最大，结果使纤维素和果胶质分解彻底，细胞壁离散完全，最终使海藻糖充分释放；另一方面，由于海带细胞壁中除了还有海藻糖外还含有其他糖类、蛋白质、无机物等成分，因此必须要进行更进一步的分离才可获得纯度较高的海藻糖，海藻糖的分子量为320，因此本发明使用超滤方法，采用不同的超滤膜，较准确地将海藻糖分离出来。采用本发明的提纯工艺可使提纯率较一般的提纯方法提高4到7个百分点；
（2）本发明未使用强酸、强碱及有毒的有机溶剂，做到了清洁环保，且本发明方法中所产生的废弃液和废渣可用来生产酵母膏，几乎无排放；
（3）本发明提取的d-海藻糖具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、抑制补体激活及吸收重金属等作用，因此可用于兽药的制备。
实施例1
本实施例提供的一种d-海藻糖提纯工艺，包括如下步骤：
步骤（1）：取新鲜海带清洗5次，沥干，切碎，用6倍于海带重量的去离子水室温浸泡2天，浸泡完成后进行打浆处理，制得浆液；
步骤（2）：向浆液中加入酸性纤维素酶，置于40℃的水浴中酶解6h，ph控制在4.5，酶解过程中不停搅拌；
步骤（3）：加入碱性果胶酶，置于65℃的水浴中酶解2h，ph控制在10.0，酶解过程中不停搅拌；
步骤（4）：离心机离心除杂，得到酶解液；
步骤（5）：将酶解液通过超滤膜进行超滤处理，酶解液依次经过截留分子量为300的超滤膜及截留分子量为400的超滤膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提纯溶液；
步骤（6）：将d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇混合进行脱水，使d-海藻糖从溶液中完全析出；
步骤（7）：使d-海藻糖从d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的混合溶液中分离出来；
步骤（8）：干燥得到提纯的d-海藻糖。
所述步骤（5）在进行超滤处理前，将所述超滤膜先用氢氧化钠溶液清洗，再用清水进行清洗，使所述超滤膜的ph值达到7.0。
所述步骤（7）中所述d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的体积比为1：5。
所述步骤（4）中离心机转速为1000r/min，离心时间为30min。
所述超滤处理过程中使用的过滤膜为聚偏氟乙烯滤膜。
所述酸性纤维素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纤维素酶的方法为先将里氏木霉a3进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，在30℃条件下培养8天，在15℃条件下放置7天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到里氏木霉91-3菌株。
所述步骤（8）干燥温度为80℃。
本实施例的提纯工艺可使提纯率较一般的提纯方法提高5个百分点。
实施例2
本实施例提供的一种d-海藻糖提纯工艺，包括如下步骤：
步骤（1）：取新鲜海带清洗3次，沥干，切碎，用8倍于海带重量的去离子水室温浸泡1天，浸泡完成后进行打浆处理，制得浆液；
步骤（2）：向浆液中加入酸性纤维素酶，置于54℃的水浴中酶解2h，ph控制在6.5，酶解过程中不停搅拌；
步骤（3）：加入碱性果胶酶，置于50℃的水浴中酶解6h，ph控制在8.0，酶解过程中不停搅拌；
步骤（4）：离心机离心除杂，得到酶解液；
步骤（5）：将酶解液通过超滤膜进行超滤处理，酶解液依次经过截留分子量为300的超滤膜及截留分子量为400的超滤膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提纯溶液；
步骤（6）：将d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇混合进行脱水，使d-海藻糖从溶液中完全析出；
步骤（7）：使d-海藻糖从d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的混合溶液中分离出来；
步骤（8）：干燥得到提纯的d-海藻糖。
所述步骤（5）在进行超滤处理前，将所述超滤膜先用氢氧化钠溶液清洗，再用清水进行清洗，使所述超滤膜的ph值达到7.0。
所述步骤（7）中所述d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的体积比为1：4。
所述步骤（4）中离心机转速为1200r/min，离心时间为20min。
所述超滤处理过程中使用的过滤膜为聚偏氟乙烯滤膜。
所述酸性纤维素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纤维素酶的方法为先将里氏木霉a3进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，在30℃条件下培养5天，在15℃条件下放置10天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到里氏木霉91-3菌株。
所述步骤（8）干燥温度为60℃。
本实施例的提纯工艺可使提纯率较一般的提纯方法提高7个百分点。
实施例3
本实施例提供的一种d-海藻糖提纯工艺，包括如下步骤：
步骤（1）：取新鲜海带清洗4次，沥干，切碎，用7倍于海带重量的去离子水室温浸泡1天，浸泡完成后进行打浆处理，制得浆液；
步骤（2）：向浆液中加入酸性纤维素酶，置于45℃的水浴中酶解4h，ph控制在5.0，酶解过程中不停搅拌；
步骤（3）：加入碱性果胶酶，置于55℃的水浴中酶解4h，ph控制在9.0，酶解过程中不停搅拌；
步骤（4）：离心机离心除杂，得到酶解液；
步骤（5）：将酶解液通过超滤膜进行超滤处理，酶解液依次经过截留分子量为300的超滤膜及截留分子量为400的超滤膜，得到分子量介于300-400的d-海藻糖提纯溶液；
步骤（6）：将d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇混合进行脱水，使d-海藻糖从溶液中完全析出；
步骤（7）：使d-海藻糖从d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的混合溶液中分离出来；
步骤（8）：干燥得到提纯的d-海藻糖。
所述步骤（5）在进行超滤处理前，将所述超滤膜先用氢氧化钠溶液清洗，再用清水进行清洗，使所述超滤膜的ph值达到7.2。
所述步骤（7）中所述d-海藻糖提纯溶液与无水乙醇的体积比为1：4。
所述步骤（4）中离心机转速为1100r/min，离心时间为25min。
所述超滤处理过程中使用的过滤膜为聚偏氟乙烯滤膜。
所述酸性纤维素酶由里氏木霉91-3菌株分解得到。
所述里氏木霉91-3菌株分解酸性纤维素酶的方法为先将里氏木霉a3进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，在30℃条件下培养6天，在15℃条件下放置8天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到里氏木霉91-3菌株。
所述步骤（8）干燥温度为70℃。
本实施例的提纯工艺可使提纯率较一般的提纯方法提高4个百分点。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。