本发明涉及生物多糖提取
技术领域：
，具体涉及一种透明质酸提纯工艺。
背景技术：
：透明质酸即玻璃酸(SodiumHyaluronate)，也称玻尿酸，简称HA，是人类于1934年首先从牛眼玻璃体中分离得到的一种广泛存在于动物和人体结缔组织细胞外基质以及部分细菌中的一种高分子直链酸性粘多糖。目前，人们已从结缔组织、脐带、皮肤、关节滑液、脑、软骨、鸡冠、林蛙皮等组织中分离出HA。在生物体中，HA常与蛋白质相结合，并与其他粘多糖共存。在眼玻璃体和滑液中，HA以溶解形式存在，在鸡冠和脐带中，以凝胶形式存在。HA是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1,4和β-1,3糖苷键反复交替连接而成的一种链状高分子聚合物，分子量在10万至400百万之间。分子中两种单糖按等摩尔比组成。由于HA分子中每一个双糖单位中均含有一个羧基，在生理条件下均可解离成负离子，等空间距离的负离子相互排斥，使其分子在水溶液中处于松散状，占据了大量空间，因此具有特殊的保水作用，保水能力理论上可高达500ml/g，被誉为理想的天然保湿因子。由于氢键作用，HA分子在水溶液中呈单螺旋状态的二级结构。当HA达到一定浓度时，HA分子之间产生相互作用，形成双螺旋结构，浓度达到0.1％时，HA分子即可互相缠绕，形成网状的三级结构，赋予HA溶液特异的流变学性质。该特性是HA具有粘弹性和发挥生理功能的基础。HA形成网状结构的特性赋予其广泛的生物学功能及应用开发前景。目前微生物发酵法生产透明质酸采用的工艺发酵周期长、产物相对分子量低、产品透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明质酸的形态为纤维状，不易溶解。技术实现要素：针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种透明质酸提纯工艺。本发明目的是通过如下技术方案实现的：一种透明质酸提纯工艺，包括以下步骤：(1)絮凝过滤：将发酵液采用乙酸调节pH至4.5-5.5，加入絮凝剂，絮凝剂的添加量为18-22mg/L，絮凝温度为68-72℃，絮凝时间为42-48min，再过滤，得到滤液；(2)活性炭脱色：将滤液采用活性炭脱色，活性炭的添加量为5.5-7.5g/L，脱色温度为68-72℃，脱色时间为42-48min，得到脱色液；(3)乙醇沉淀：脱色液采用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0-6.5，再经乙醇沉淀，得到乙醇沉淀物；(4)络合沉淀：将乙醇沉淀物用0.08-0.12mol/L氯化钠溶液溶解后，加入络合剂进行络合沉淀；(5)解离沉淀：络合沉淀物用盐解离，过滤，滤液再经乙醇沉淀，最后将沉淀物经乙醇脱水，干燥；(6)将干燥后的沉淀物进行超细研磨即得。所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠混合而成，所述海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠的质量比为(1-3)：(1-3)：(1-3)。所述步骤(4)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成：十二烷基二甲基叔胺1-5份、十四烷基氯化吡啶1-5份、双十二烷基二甲基溴化铵1-5份、水80-100份。优选地，所述步骤(5)中沉淀物用盐解离时，先用0.08-0.12mol/L氯化钠溶液洗涤2-3次，然后再加入与发酵液等体积的0.4-0.6mol/L氯化钠溶液中搅拌解离16-19小时。优选地，所述干燥采用真空干燥，干燥温度为45-55℃，干燥时间为2-4小时。本发明透明质酸提纯工艺，操作流程简单，解决了目前透明质酸钠提纯工艺复杂的问题，其生产易于控制，产品质量稳定，得率高，成本大幅下降，具有良好的应用前景。具体实施方式实施例中各原料介绍：发酵液采用专利申请号：201310351005.4中实施例1的方法制备，其中发酵液中透明质酸含量为1.17g/L，透明质酸中蛋白质含量为0.025wt％。乙酸，CAS号：64-19-7。活性炭，CAS号：7440-44-0，采用巩义市北山口竹清活性炭厂提供的粒度为200目的食品级活性炭。氢氧化钠，CAS号：1310-73-2。乙醇，CAS号：64-17-5。氯化钠，CAS号：7647-14-5。海藻酸钠，CAS号：31581-02-9，采用珠海味佳食品添加剂有限公司提供的食品级海藻酸钠。柠檬酸钠，CAS号：68-04-2，采用江苏科伦多食品配料有限公司提供的型号为K2814的食品级柠檬酸钠。葡萄糖酸钠，CAS号：527-07-1，采用嘉兴市龙啸化工有限公司提供的食品级葡萄糖酸钠。十二烷基二甲基叔胺，CAS号：112-18-5。十四烷基氯化吡啶，CAS号：2785-54-8。双十二烷基二甲基溴化铵，CAS号：3282-73-3。实施例1透明质酸提纯工艺，包括以下步骤：(1)絮凝过滤：取25L发酵液采用乙酸调节pH至4.7，加热至70℃后加入絮凝剂搅拌混合均匀进行絮凝，絮凝剂的添加量为20mg/L，絮凝温度为70℃，絮凝时间为45min，再进行真空抽滤，得到24L滤液；(2)活性炭脱色：将24L滤液加热至72℃后添加144g活性炭，以转速为100转/分搅拌脱色45min后真空抽滤，得到24L脱色液；(3)乙醇沉淀：脱色液用2.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5，加入72L95％乙醇沉淀，得到乙醇沉淀物；(4)络合沉淀：将乙醇沉淀物用25L0.1mol/L氯化钠溶液溶解，在以转速为300转/分搅拌条件下加入络合剂，加入络合剂后搅拌5min，再静置1小时后母液上排，得络合沉淀物；(5)解离沉淀：络合沉淀物用0.1mol/L氯化钠溶液洗涤3次，每次洗涤0.1mol/L氯化钠溶液用量为1L，然后向沉淀中加入25L0.5mol/L氯化钠溶液中以转速为150转/分搅拌解离16小时，真空抽滤，滤液再经75L95％乙醇沉淀3小时，用无水乙醇脱水后，将沉淀物置于旋转式真空干燥器中，在干燥温度为50℃下真空干燥3小时，得到干燥后的沉淀物；(6)将干燥后的沉淀物采用超细研磨机(超细研磨机为无锡市飞鸣机械有限公司生产的型号为CXM的超细研磨机)进行超细研磨至500nm。得到实施例1的纳米级透明质酸。所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠按质量比为1：1：1搅拌混合均匀得到。所述步骤(4)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成：十二烷基二甲基叔胺3份、十四烷基氯化吡啶3份、双十二烷基二甲基溴化铵3份、水91份。将十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵加入水中搅拌混合均匀即得。实施例2与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(1)中絮凝剂由柠檬酸钠、葡萄糖酸钠按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例2的纳米级透明质酸。实施例3与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、葡萄糖酸钠按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例3的纳米级透明质酸。实施例4与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(1)中絮凝剂由海藻酸钠、柠檬酸钠按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例4的纳米级透明质酸。实施例5与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成：十四烷基氯化吡啶4.5份、双十二烷基二甲基溴化铵4.5份、水91份。将十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例5的纳米级透明质酸。实施例6与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成：十二烷基二甲基叔胺4.5份、双十二烷基二甲基溴化铵4.5份、水91份。将十二烷基二甲基叔胺、双十二烷基二甲基溴化铵加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例6的纳米级透明质酸。实施例7与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述步骤(3)中的络合剂由下述重量份的原料制备而成：十二烷基二甲基叔胺4.5份、十四烷基氯化吡啶4.5份、水91份。将十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶加入水中搅拌混合均匀即得。得到实施例7的纳米级透明质酸。测试例1将实施例1-7得到的纳米级透明质酸得率进行统计。计算方法：得率(％)＝纳米级透明质酸质量/25L发酵液中透明质酸质量×100，具体测试结果见表1。表1：得率结果表得率，％实施例197.0实施例289.2实施例392.1实施例491.3实施例591.2实施例689.8实施例790.6比较实施例1和实施例2-4，实施例1(海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠复配)得率明显高于实施例2-4(海藻酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠中任意二者复配)。比较实施例1与实施例5-7，实施例1(十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵复配)得率明显高于于实施例5-7(十二烷基二甲基叔胺、十四烷基氯化吡啶、双十二烷基二甲基溴化铵中任意二者复配)。当前第1页1 2 3