本发明涉及一种用于提高肝炎患者免疫力的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖及其制备方法与应用，属于医药技术领域。
背景技术：
肝炎是肝脏炎症的统称，通常是指由多种致病因素如病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物、酒精、自身免疫等因素使肝脏细胞受到破坏，肝脏的功能受到损害，表现为肝功能指标的异常，并引起身体一系列不适症状。提高自身免疫力可以减缓肝炎病情的进展，从而有效减免病情恶化为肝硬化甚至肝癌。
目前提高肝炎患者免疫力的药物主要有胸腺肽、胸腺五肽等。胸腺肽有效成分不明确，含量低、含致敏大分子蛋白，不符合WHO对免疫调节剂的五项标准，因而疗效低、安全性差，不良反应尤其是严重过敏反应频繁发生。虽然胸腺五肽的效果比较优异，但是其合成的方法相对复杂，价格昂贵。
β-1,3葡聚糖是一类以β-1,3糖苷键连接的具有多种生物活性的葡萄糖聚合物。大量研究表明，β-1,3-葡聚糖具有特殊的生物活性：其能够活化巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等，能够提高白细胞介素、干扰素及肿瘤坏死因子α的含量，全面刺激机体的免疫系统，从而提高机体的免疫力。β-1,3-葡聚糖能使受伤机体的淋巴细胞产生细胞因子IL-1的能力迅速恢复正常，有效调节机体免疫机能，还能够促进体内IgM抗体的产生，提高体液免疫能力。β-1,3-葡聚糖能够有效激活机体非特异性防御机制，故应用在肿瘤、感染病和治疗创伤方面深受瞩目，近几年研究发现，β-1,3-葡聚糖在治疗肿瘤、心血管、糖尿病等病症以及降血脂、抗衰老方面效果显著。
目前市场上的β-1,3-葡聚糖产品几乎都是从酵母细胞中提取，而酵母细胞中葡聚糖含量低，且主要集中在细胞壁中，提取过程相当繁琐，产品纯度又低，生产成本极高。因此，医学领域亟需一种高活性、高纯度、低成本的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，以期能够显著提高患者的自身免疫力。利用生物发酵法生产的微生物多糖可得然胶是一种水不溶性大分子β-1,3-葡聚糖，已被卫生部公告为一种可以在食品中添加的添加剂。天然的大分子可得然胶虽然由β-1,3-葡聚糖组成，但由于其不溶于水，导致其不具有显著的生物活性，但其水溶性衍生物(如硫酸酯化物等)、低分子量可得然胶或可得然胶寡糖则具有非常显著的生物活性，能够显著提高机体免疫活性，对于治疗肿瘤及感染疾病等具有突出的效果。因此通过降低可得然胶的分子量，提高可得然胶溶解性，将其用于提高患者免疫力具有重要的意义。
目前报道中关于可得然胶水溶性衍生技术的研究很多，但由于需要进行化学反应，这增加了可得然胶水溶液的组分，对其生物安全性也造成了较大影响，同时通过化学降解的方法降低可得然胶的分子量，反应过程不易控制，产品收率较低，且大部分产物为无效的单糖。
技术实现要素：
基于以上技术的不足，本发明从大分子可得然胶的物理化学性质出发，通过大量研究开发了一种高效降低大分子可得然胶分子量的方法，获得了完全水溶性的小分子β-1,3-葡聚糖，将其用于肝炎患者的辅助治疗后，效果明显。
针对大分子β-1,3-葡聚糖可得然胶溶解性差，生理活性低的缺点，本发明开发了以高纯度大分子β-1,3-葡聚糖可得然胶为原料通过一系列物理手段降低其分子量，制得可溶性高纯度小分子β-1,3-葡聚糖。
本发明采用的技术方案如下：
本发明第一个目的是提供一种用于提高肝炎患者免疫力的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)以大分子微生物多糖可得然胶为原料，将其超微粉碎、高压均质、过滤得到过滤液，将过滤液浓缩后，得到可溶性小分子β-1,3-葡聚糖浓缩液；
(2)取浓缩液，醇沉、过滤，得到的沉淀经过干燥即为高纯度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。
优选的，具体的制备方法包括：
1)原料：选取的可得然胶为高纯度可得然胶，其纯度在90％以上，优选的产品粒度为200目以上，74μm以下。
2)超微粉碎，优选的粉碎技术为气流式超微粉碎，粉碎粒度达到4μm以下。
3)高压均质，将步骤2)中粉碎达标的粉末悬于去离子水中，得到多糖悬液，采用高压均质机进行循环均质，并控制液体温度低于50℃，优选的压力范围为40～60MPa，优选的多糖悬液质量浓度为0.5～1.0％，粉碎粒度达到50nm以下。
4)离心分离，将步骤3)所得循环均质液用去离子水稀释3～10倍混匀后，采用离心机分离，3000～5000r/min离心5-15min后，离心后得到的沉淀物返回步骤3)继续进行高压均质，上清液进入后续步骤。
5)纳滤浓缩，将步骤4)中离心所得上清液用纳滤膜进行浓缩并除盐、除单糖，优选的纳滤膜截留分子量为300～400Da，浓缩至滤液体积的1/3～1/10，即为可溶性小分子β-1,3-葡聚糖浓缩液。
6)乙醇沉淀，向步骤5)中所得浓缩液中加入2～5倍体积的乙醇，沉淀可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，过滤或离心得沉淀后再用2～5倍体积的乙醇洗涤两次，再次通过过滤或离心得到的沉淀即为目标产物。
7)干燥，将步骤6)中所得沉淀干燥，优选的条件为60～80℃，干燥2～4h，干燥后所得固体即为高纯度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。
本发明的第二个目的是提供一种采用上述方法制备得到的小分子β-1,3-葡聚糖，其是由大分子可得然胶降低分子量制得，所述小分子β-1,3-葡聚糖的平均分子量为6000～10000Da。
本发明的第三个目的是提供上述小分子β-1,3-葡聚糖在免疫活性增强、抗炎活性增强或肿瘤辅助治疗药物或保健食品中的应用，尤其是将其用于肝炎患者的辅助治疗后，可提高肝炎患者免疫力。
本发明的第四个目的是提供一种组合物(如药物组合物或保健食品组合物)，其由所述的小分子β-1,3-葡聚糖和药学上或食品学上可接受的赋形剂组成。
本发明的有益效果是：
(1)传统上生产β-1,3-葡聚糖的方法是从香菇、酵母、燕麦、青稞中提取获得，而本发明以微生物胞外多糖可得然胶为原料，为生产β-1,3-葡聚糖提供了一条新的途径；所选原料纯度高，成分明确，质量容易控制；
(2)通过本发明一系列的物理方法处理，建立了一条稳定的提取可溶性小分子β-1,3-葡聚糖的工艺，不需要进行化学反应，减少了成品中的杂质组分，所得目标产品可溶性小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度高达95％以上，能够实现大规模的生产；
(3)目标产品可溶性小分子β-1,3-葡聚糖的产品收率高达到60％以上；
(4)本发明的技术步骤为不引入任何化学或有害其他杂质，确保的所得产品的生物安全；
(5)本发明的目标产物为可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，完全水溶，生理活性特别是提高生物体免疫活性、抗炎活性、抗肿瘤活性具有非常显著的效果。
(6)本发明制备得到的β-1,3-葡聚糖用于提高肝炎患者免疫力，具有较为明显的效果，在医学领域的应用中具有重要意义。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行完整细线地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于提高肝炎患者免疫力的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖具体制取工艺步骤内容如下：
(1)原料：选取高纯度可得然胶(90％以上)，该可得然胶产品粒度为200目以上、74μm以下；
(2)超微粉碎，粉碎技术为气流式超微粉碎，粉碎粒度达到4μm以下；
(3)高压均质，将步骤(2)中粉碎达标的粉末悬于去离子水中，采用高压均质机进行循环均质，并控制液体温度低于45℃，压力为60MPa，多糖悬液浓度为0.5％，粉碎粒度达到50nm以下；
(4)离心分离，将步骤(3)所得循环均质液用去离子水稀释3倍混匀后，采用离心机分离，3000r/min离心10min后，离心后得到的不溶物返回步骤(3)继续进行高压均质，滤液进入后续步骤；
(5)纳滤浓缩，将步骤(4)所得过滤液用纳滤膜进行浓缩并除盐、除单糖，纳滤膜截留分子量为300Da，浓缩至滤液体积的1/5，即为可溶性小分子β-1,3-葡聚糖浓缩液；
(6)乙醇沉淀，向步骤(5)中所得浓缩液中加入2倍体积的乙醇，沉淀可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，3000r/min离心3min后，得沉淀再采用2倍体积的乙醇洗涤两次，3000r/min离心3min后所得沉淀即为目标产物；
(7)干燥，将步骤(6)中所得沉淀干燥，干燥条件为60℃，干燥4h，干燥后所得固体即为高纯度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。
经检测，可溶性小分子β-1,3-葡聚糖的纯度为96.5％，产品收率为70％，平均分子量为7400Da。
经过试验验证，本实施例得到的β-1,3-葡聚糖能够用于肝炎患者的辅助治疗，并且能够明显提高肝炎患者的免疫力。
实施例2
一种用于提高肝炎患者免疫力的可溶性小分子β-1,3-葡聚糖具体制取工艺步骤内容如下：
(1)原料：选取高纯度可得然胶(90％以上)，该可得然胶产品粒度为200目以上、74μm以下；
(2)超微粉碎，粉碎技术为气流式超微粉碎，粉碎粒度达到4μm以下；
(3)高压均质，将步骤(2)中粉碎达标的粉末悬于去离子水中，采用高压均质机进行循环均质，并控制液体温度低于40℃，压力为45MPa，多糖悬液浓度为0.75％，粉碎粒度达到50nm以下；
(4)离心分离，将步骤(3)所得循环均质液用去离子水稀释6倍混匀后，采用离心机分离，5000r/min离心5min后，离心后得到的不溶物返回步骤(3)继续进行高压均质，滤液进入后续步骤；
(5)纳滤浓缩，将步骤(4)所得过滤液用纳滤膜进行浓缩并除盐、除单糖，纳滤膜截留分子量为300Da，浓缩至滤液体积的1/3，即为可溶性小分子β-1,3-葡聚糖浓缩液；
(6)乙醇沉淀，向步骤(5)中所得浓缩液中加入3倍体积的乙醇，沉淀可溶性小分子β-1,3-葡聚糖，过滤得沉淀再采用2.5倍体积的乙醇洗涤两次，再次过滤所得沉淀即为目标产物；
(7)干燥，将步骤(6)中所得沉淀干燥，干燥条件为70℃，干燥3h，干燥后所得固体即为高纯度可溶性小分子β-1,3-葡聚糖。
经检测，可溶性小分子β-1,3-葡聚糖的纯度为98％，产品收率为65％，平均分子量为6750Da。
经过试验验证，本实施例得到的β-1,3-葡聚糖能够用于肝炎患者的辅助治疗，并且能
够明显提高肝炎患者的免疫力。
实施例3
取实施例1中制备得到的β-1,3-葡聚糖，辅料为药用淀粉、糊精和质量分数为50％的乙醇，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时，制成片状，便于患者服用。
实施例4
取实施例1中制备得到的β-1,3-葡聚糖，辅料为药用淀粉和体积分数为50％的乙醇，制粒，整粒，烘干，装成胶囊，便于患者服用。
实施例5
无菌条件下取实施例1中制备得到的β-1,3-葡聚糖，加入纯净水溶解后，分装灭菌，制得口服液，便于患者服用。