本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种原人参二醇的生物合成方法及其生产菌株。
背景技术：
原人参二醇(PPD)属于四环三萜类化合物，为人参二醇型皂苷Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3和Rh2等的苷元，主要来源于人参、三七、西洋参等五加科植物以及葫芦科植物如绞股蓝等。具有抗肿瘤、抗抑郁、提高人体免疫力等作用。目前主要来至于人参植物的提取，成本高，效率低下，其来源受到自然环境的限制，如土地的投入量、气候等。
合成生物学是21世纪初诞生的一门新兴工程学科，是以工程学和生物学为基础，以创新为导向迅速发展起来的新研究领域,希望解决生物化工、生物能源、生物材料、生物医药领域以及关系国计民生等的大问题。合成生物学的出现为植物天然药物的快速生产建立了有效的途径，有望成为未来最有前途的药物生产的绿色环保技术之一,可以有效解决植物来源的天然药物研发可能引起的资源问题。植物天然药物生物合成取得了引人注目的成就，如紫杉二烯、青蒿素、胡萝卜素等。这些研究不仅印证了通过合成生物学的设计，实现珍稀植物次生代谢产物的异源生物合成的可行性，其研究结果也显示这一技术的巨大优势和应用潜力。
目前，利用合成生物学原理设计和改造微生物菌株已实现了多种植物活天然药物的异源生产，最常用的微生物宿主为酿酒酵母和大肠杆菌。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种真核生物，因其具有内膜系统，更适合包括P450氧化酶等基因在内的植物次生代谢酶基因的表达。目前，已有不少植物天然药物在酿酒酵母中实现了生物合成。戴住波(Zhubo Dai)等通过在酿酒酵母中引入达玛二烯合酶、原人参二醇合酶和NADPH细胞色素P450酶，产生0.05mg/g原人参二醇；进一步通过引入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A、鲨烯合酶、2,3-氧化鲨烯合酶以及密码子优化原人参二醇合酶，导致原人参二醇262倍的增长；进一步通过双向萃取发酵技术发酵96h,获得原人参二醇8.40mg/g(1189mg/L)和达玛烯二醇10.94mg/g(1548mg/L)。该方法的主要不足之处在于发酵时间太长(专利申请CN 102925376A&Zhubo Dai Yiliu Xianan Zhang et al.Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides[J].Metabolic Engineering,2013,20 146-156.)。但酿酒酵母作为真核生物，利用其生物合成目标物质时，具有发酵周期长，遗传操作复杂，不易于高密度发酵等不足，限制了酿酒酵母在植物次生代谢产物生物合成中的应用。
E.coli是所有工程菌中开发最早、最成熟的一种，而且具有生长速度快，发酵时间短、培养基简单等优势，使得大肠杆菌在工业生产中有着酿酒酵母无法比拟的优势，更节能，更有效率；以及大肠杆菌基因组较小，遗传工具、技术及相关知识非常清晰，非常符合现代工业的要求，这些优势也是酿酒酵母无法比拟的，因此成为植物次生代谢产物合成生物学研究中首选的宿主菌。目前，几乎各大类天然产物，如聚酮类(如红霉素)、非核糖体肽类(如埃博霉素)、萜类化合物(如紫杉二烯)、苯丙烷类(如白藜芦醇)、生物碱类((S)-网状番荔枝碱)等化合物都在大肠杆菌有异源合成的成功报道。大肠杆菌中没有原人参二醇生物合成所需的鲨烯合酶、2,3-氧化鲨烯合酶、达玛烯二醇合酶、原人参二醇合酶以及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶等相关基因，因此，利用大肠杆菌生物合成原人参二醇，需要导入鲨烯合酶、2,3-氧化鲨烯合酶、达玛烯二醇合酶、原人参二醇合酶以及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶等相关基因，通过发酵，最终获得产原人参二醇大肠杆菌。
原人参二醇在大肠杆菌中生物合成，有着非常大的经济价值以及学术价值，不仅为PPD的工业化生产实现“绿色”，而且还能为中药活性成分以及天然药物通过大肠杆菌实现“绿色”生产提供思路与方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中利用酵母生物合成原人参二醇存在的酵母生长速度慢、发酵时间长、培养基复杂以及不利于工业化生产等缺陷，提供一种能够生产原人参二醇的大肠杆菌工程菌及相应的酶基因、重组载体和制备原人参二醇的方法。利用该基因工程菌生物合成原人参二醇，具有发酵时间短、培养基简单、符合现代工业的要求以及利于推广应用等优点。
本发明人经过诸多尝试和研究，在合成原人参二醇的诸多酶中筛选出外源的鲨烯合酶、2,3-氧化鲨烯合酶，将其克隆得到后与达玛二烯合酶基因、原人参二醇合酶基因以及NADPH细胞色素P450酶基因同时转入到大肠杆菌中，最终在大肠杆菌菌体内成功表达了五种异源基因。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：一种生产原人参二醇的基因工程菌，其是大肠杆菌(Escherichia coli)中表达鲨烯合酶基因、2,3-氧化鲨烯合酶基因、达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因以及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因的工程菌。
其中，可以将所述鲨烯合酶基因、所述2,3-氧化鲨烯合酶基因、所述达玛烯二醇合酶基因、所述原人参二醇合酶基因以及所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因克隆到同一个载体上进行表达，也可以克隆到一个以上的载体上进行表达。
为兼顾成本、制备效率以及各个基因更好地发挥作用和终产物的表达量，较佳地，将所述鲨烯合酶基因和所述2,3-氧化鲨烯合酶基因克隆到表达载体1，所述表达载体1的骨架优选为质粒pCDFDuet-1；将所述达玛烯二醇合酶基因、所述原人参二醇合酶基因以及所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因克隆到表达载体2，所述表达载体2的骨架优选为质粒pACYCDuet-1；更佳地，为更好地为达玛烯二醇合酶及原人参二醇合酶提供电子，所述表达载体2含有两个所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因。
为了克服大肠杆菌缺少P450酶基因定位所需要的内质网膜，本发明以达玛二烯合酶(DDS，登录号：AB265170)、原人参二醇合酶(PPDS，登录号：JN604537)和NADPH细胞色素P450酶(AtCPR1，登录号：X66016)为模板分别对其进行了大肠杆菌密码子优化以及基因序列的改造，使5个外源基因能够在大肠杆菌菌体内同时表达，协同作用。其中，所述达玛烯二醇合酶基因可以催化2,3-氧化鲨烯合成达玛二烯，较佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述原人参二醇合酶基因可以催化达玛二烯合成原人参二醇，较佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因可以为达玛二烯合酶和原人参二醇合酶提供电子，较佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步更佳地，所述达玛烯二醇合酶基因和原人参二醇合酶基因分别与其中一个所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因相邻；所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因优选均位于所述达玛烯二醇合酶基因或原人参二醇合酶基因的下游。最佳地，为了克服真核细胞来源的细胞色素P450酶基因和细胞色素P450还原酶基因在大肠杆菌表达困难的问题，所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因和达玛烯二醇合酶基因或原人参二醇合酶基因分别形成融合基因，其核苷酸序列优选分别如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
本发明所述鲨烯合酶基因可以催化焦磷酸法尼酯(FPP)合成鲨烯化合物；较佳地，选用来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的；更佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述2,3-氧化鲨烯合酶基因可以催化鲨烯合成2,3-氧化鲨烯；较佳地，选用来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2,3-氧化鲨烯合酶基因；更佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明解决上述技术问题的技术方案之二是：一种基因，其为达玛烯二醇合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
其为原人参二醇合酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
其为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
其为达玛烯二醇合酶基因和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因的融合基因1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；或者，
其为所述原人参二醇合酶基因和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因的融合基因2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明解决上述技术问题的技术方案之三是：一种包含上述鲨烯合酶基因以及2,3-氧化鲨烯合酶基因的表达载体(表达载体1)。较佳地，所述表达载体的骨架优选为质粒pCDFDuet-1。
本发明解决上述技术问题的技术方案之四是：一种包含上述达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因以及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因的表达载体(表达载体2)；较佳地，包含上述融合基因1和融合基因2的表达载体。更佳地，所述表达载体的骨架优选为质粒pACYCDuet-1。
本发明解决上述技术问题的技术方案之五是：一种原人参二醇的制备方法，其包括将上述基因工程菌发酵，从发酵液中获得原人参二醇。
本发明解决上述技术问题的技术方案之六是：一种上述基因工程菌的制备方法，该方法包括下列步骤：
1)构建上述含有鲨烯合酶基因和2,3-氧化鲨烯合酶基因的表达载体1，以及含有达玛烯二醇合酶基因、原人参二醇合酶基因以及两个烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因的表达载体2；
2)以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主菌株，用步骤1)得到的表达载体1和表达载体2同时进行转化，获得重组表达原人参二醇的大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌为本领域常规的大肠杆菌。
较佳地，本发明所述大肠杆菌优选BL21(DE3)菌株。
应了解，本发明“表达载体1”和“表达载体2”、以及“融合基因1”和“融合基因2”中的“1”和“2”均无实际意义，仅为区分相同的术语。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
利用本发明的基因工程菌生物合成原人参二醇，发酵时间短、培养基简单，以及大肠杆菌基因组较小，遗传工具、技术及相关知识非常清晰，非常符合现代工业的要求，利于推广应用；且原人参二醇在大肠杆菌中生物合成，有着非常大的经济价值以及学术价值，不仅为PPD的工业化生产实现“绿色”，而且还能为中药活性成分以及天然药物通过大肠杆菌实现“绿色”生产提供思路与方法。
附图说明
图1为质粒pCDFDuet-1SSSE构建示意图。
图2为质粒pACYCDuet-1D612C46P72C46构建示意图。
图3为质粒pACYCDuet-1D612C46P1C46构建示意图。
图4为酿酒酵母基因组电泳图。
图5为来自于酿酒酵母的SS基因和SE基因电泳图。
图6为pCDFDuet-1和SS基因双酶切胶回收电泳图。
图7为pCDFDuet-1SS质粒菌液PCR验证。
图8为pCDFDuet-1SS和SE基因双酶切胶回收电泳图。
图9为pCDFDuet-1SSSE质粒菌液PCR验证。
图10为D612、C46和D612C46基因电泳图。
图11为P72、C46和P72C46基因电泳图。
图12为P1、C46和P1C46基因电泳图。
图13为pACYDuet-1和D612C46基因双酶切胶回收电泳图。
图14为pACYDuet-1D612C46质粒菌液PCR验证。
图15为pACYDuet-1D612C46和P72C46基因双酶切胶回收电泳图。
图16为pACYDuet-1D612C46P72C46质粒菌液PCR验证。
图17为pACYDuet-1D612C46和P1C46基因双酶切胶回收电泳图。
图18为pACYDuet-1D612C46P1C46质粒菌液PCR验证。
图19A～图19E原人参二醇和样品的液质色谱图以及产物碎片离子图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
2×Taq Master Mix(Dye Plus)购自诺唯赞生物科技有限公司；
大肠杆菌BL21(DE3)、DH5α感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司
所使用的酶：NdeⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、BglⅡ、T4连接酶以及Max DNA polymerase均购自大连宝生物有限公司(TaKaRa,Dalian,China)；
链霉素以及氯霉素均购自上海生工生物工程股份有限公司；
DNA回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；
测序公司为上海睿迪生物科技有限公司。
实施例1质粒pCDFDuet-1SSSE构建
(1)酿酒酵母鲨烯合酶(SS)基因克隆
通过真菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取酿酒酵母ATCC 204508(购自ATCC)基因组，如电泳图4；以提取的酿酒酵母基因组DNA为模板，用“SS上”和“SS下”为引物扩增SS基因(GenBank登录号：EU675328)，序列如SEQ ID NO.1所示。
①扩增引物序列：
SS上：CGGGATCCGATGGGAAAGCTATTACAATTG(详见SEQ ID NO.11)；
SS下：CCAAGCTTTCACGCTCTGTGTAAAGTGTATATATAATAAAAC(详见SEQ ID NO.12)。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
酿酒酵母S288C基因组DNA(模板)：2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸10s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
再利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收回收目的基因片段，如电泳图5。
(2)酿酒酵母2,3-氧化鲨烯合酶(SE)基因克隆
将上述提取的酿酒酵母基因组DNA为模板，用“SE上”和“SE下”为引物扩增SE基因(GenBank登录号：NC 001139)，序列如SEQ ID NO.2所示。
①扩增引物序列：
SE上：GAAGATCTCATGTCTGCTGTTAACGTTGCAC(详见SEQ ID NO.13)；
SE下：GGGGTACCTTAACCAATCAACTCACCAAAC(详见SEQ ID NO.14)。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
酿酒酵母S288C基因组DNA(模板)：2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸10s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
再利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如电泳图5。
(3)表达载体构建
a.pCDFDuet-1SS载体构建
将胶回收后的SS基因与载体pCDFDuet-1(Novagen)分别用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，如图6，载体pCDFDuet-1与SS片段按摩尔比1:5的比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL链霉素的LB(蛋白胨10％，酵母提取物5％，NaCl 10％，琼脂糖12％)固体平板上，挑转化子，过夜培养，菌液用用2×Taq Master Mix(Dye Plus)PCR筛选阳性克隆，如图7，测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。
b.pCDFDuet-1SSSE载体构建
将胶回收后的SE基因与载体pCDFDuet-1SS分别用BglⅡ和KpnⅠ进行双酶切，如图8，载体pCDFDuet-1SS与外源片段SE按摩尔比1:5的比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有100μg/mL链霉素的LB(蛋白胨10％，酵母提取物5％，NaCl 10％，琼脂糖12％)固体平板上，挑转化子，过夜培养，菌液用用2×Taq Master Mix(Dye Plus)PCR筛选阳性克隆，如图9，测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。所得质粒pCDFDuet-1SSSE的图谱如图1所示。
实施例2质粒pACYCDuet-1D612C46P72C46构建
(1)D612C46基因克隆
A.以达玛二烯合酶基因(DDS，登录号：AB265170)为模板，经大肠杆菌密码子优化，化学合成D基因(序列如SEQ ID NO.8所示)，以D基因为模板，经疏水性分析，去掉第612氨基酸序列后的氨基酸序列，用“D上”和“D下”为引物扩增D612基因，D612基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
①扩增引物序列：
D上：CGCGGATCCGATGTGGAAGCAGAAGGGCGCACAG(详见SEQ ID NO.15)；
D下：GTGGTCTTCTTCCATGTCGACCCAGAGCCATCCGGCATCTGGTTGC(详见SEQ ID NO.16)。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
D基因(模板)：2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸20s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图10。
B.以烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因(AtCPR1，登录号：X66016)为模板，经大肠杆菌密码子优化，化学合成C基因(序列如SEQ ID NO.10所示)，以C基因为模板，经疏水性分析，去掉前46氨基酸序列，用“DC上”和“DC下”为引物扩增C46基因，C46基因的序列如SEQ ID NO.5所示。
①扩增引物序列：
DC上：
GCCGGATGGCTCTGGGTCGACATGGAAGAAGACCACCGCGGACC
(详见SEQ ID NO.17)；
DC下：CCCAAGCTTTTACCACACATCACGCAGGTAGC(详见SEQ ID NO.18)。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL，引物(10μM)各2μL，C基因为模板2μL，补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸20s；2)-4)35循环次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图10。
C.以D612基因和C46基因为模板，用“D上”和“DC下”为引物扩增D612C46融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
①扩增引物序列：
D上：CGCGGATCCGATGTGGAAGCAGAAGGGCGCACAG；
DC下：CCCAAGCTTTTACCACACATCACGCAGGTAGC。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
D612基因、C46基因(模板)：各2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸40s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图10。
(2)P72C46基因克隆
A.以原人参二醇合酶基因(PPDS，登录号：JN604537)为模板，经大肠杆菌密码子优化，化学合成P基因(序列如SEQ ID NO.9所示)，经疏水性分析，去掉前72氨基酸序列，用“P上”和“P下”为引物扩增P72基因，P72基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
①扩增引物序列:
P上：GGAATTCCATATGATGAAACGTATCCCGCAGAAGG(详见SEQ ID NO.19)；
P下：GGTCTTCTTCCATGTCGACCCGTTGTGCGGGTGCAGGTGAATC(详见SEQ ID NO.20)。
②扩增体系为：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：2μL；
P基因(模板)：2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸20s；2)-4)35个循环；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图11。
B.以上述经大肠杆菌密码子优化、化学合成的C基因为模板，经疏水性分析，去掉前46氨基酸序列，进行PCR扩增，得C46基因。
①扩增引物序列为：
PC上：GCACCCGCACAACGGGTCGACATGGAAGAAGACCACCGCGGACCG(详见SEQ ID NO.21)；
PC下：GGGGTACCTTACCACACATCACGCAGGTAGC(详见SEQ ID NO.22)。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
P基因(模板)：2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸20s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图11。
C.以P72基因和C46基因为模板，进行重叠PCR扩增，得P72C46融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
①扩增引物序列：
P上：GGAATTCCATATGATGAAACGTATCCCGCAGAAGG；
PC下：GGGGTACCTTACCACACATCACGCAGGTAGC。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
P72基因、C46基因(模板)：各2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸40s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段如图11。
(3)pACYCDuet-1D612C46P72C46载体构建
A.将胶回收后的D612C46基因与载体pACYCDuet-1(Novagen)分别用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，如电泳图13。载体pACYCDuet-1与外源片段按摩尔比1:5的比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有30μg/mL氯霉素的LB(蛋白胨10％，酵母提取物5％，NaCl 10％，琼脂糖12％)固体平板上，挑转化子，过夜培养，菌液用2×Taq Master Mix(Dye Plus)PCR筛选阳性克隆，如电泳图14，送测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。
B.将胶回收后的P72C46基因与载体pACYDuet-1D612C46分别用NdeⅠ和KpnⅠ进行双酶切，如图15，载体pACYDuet-1D612C46与外源片段P72C46按摩尔比1:5的比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有30μg/mL氯霉素的LB(蛋白胨10％，酵母提取物5％，NaCl 10％，琼脂糖12％)固体平板上，挑转化子，过夜培养，菌液用2×Taq Master Mix(Dye Plus)PCR筛选阳性克隆，如图16，送测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。所得质粒pACYCDuet-1D612C46P72C46的图谱如图2所示。
实施例3重组菌株pCDFDuet-1SSSE pACYCDuet-1D612C46P72C46BL21(DE3)构建
将质粒pCDFDuet-1SSSE与质粒pACYDuet-1D612C46P72C46同时转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有100μg/mL链霉素和30μg/mL氯霉素的LB(蛋白胨10％、酵母提取物5％、NaCl 10％、琼脂糖12％)固体平板上，用2×Taq Master Mix(Dye Plus)筛选阳性克隆，由此获得重组菌株pCDFDuet-1SSSEpACYD612C46P72C46BL21(DE3)。
实施例4重组菌株发酵
分别在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中接种重组菌株pCDFDuet-1SSSE pACYCDuet-1D612C46P72C46BL21(DE3)，接种量为10μL/2mL，37℃，220转/min培养过夜。第二天转接入TB液体培养基(1.2％(W/V)蛋白胨，2.4％(W/V)酵母提取物，17mM KH2PO4，72mM K2HPO4，10g/L葡萄糖)中，接种量为2mL/200mL，30℃，250转/min培养3h左右，待OD600＝0.6～0.9左右时，添加终浓度为0.5mmol/L的诱导剂IPTG进行诱导。培养48小时后，将发酵产物8000转/分钟，离心5分钟，去上清，沉淀加入10mL丙酮，超声30min提取2次，将丙酮提取物混合，吹干，获得发酵粗提物，加甲醇200μL溶解，取样进行UPLC-MS/MS测定(用到的化学试剂来自于国药集团化学试剂公司)(蛋白胨，酵母提取物和琼脂糖购买自英国OXOID)。
实施例5UPLC-MS/MS测定
(1)原人参二醇标准品配置
精密称取原人参二醇对照品2.5mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，冷藏备用。
(2)色谱条件
分析色谱柱：CORTECSTMC18柱(column)(2.1×100mm,1.6μm)，保护柱：CORTECSTM UPLC C18VanGuard Pre-柱(column)(2.1×5mm,1.6μm)；流动相：乙腈(A)与0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱：0～3min，30％A～90％A；3～6min，90％A～90％A；6～6.1min，90％A～30％A；6.1～8min，30％A～30％A。进样量：2μL；流速：0。
25mL/min；柱温：45℃。
(3)质谱条件
ESI电离源，采用正离子检测模式，质谱参数如下：驻留时间(s)：0.003s；毛细管电压：3.5kv；干燥气体：N2；碰撞气体：Ar；源温度：150℃；提取锥孔电压：3.00V；脱溶剂气流：900L·h-1；锥孔气流：50L·h-1；脱溶剂温度：500℃。
结果如图19所示，原人参二醇标准品(图19A)和样品(实施例4的粗提物)(图19B)的液质色谱图目标峰保留时间一致，都为4.97min；同时，原人参二醇标准品(图19D)和样品(图19E)(实施例4的粗提物)的产物碎片离子图(m/z 407.69/425.09/443.43)完全一致，证明样品的发酵产物中含有原人参二醇，说明重组菌株pCDFDuet-1SSSEpACYDuet-1D612C46P72C46(DE3)能够产生原人参二醇,产量为25ng/L。
标准品的配置：称取1.26mg原人参二醇标准品(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)于5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。
对比例重组菌株pCDFDuet-1SSSEpACYDuet-1D612C46P1C46(DE3)构建
(1)D612C46基因克隆
同实施例2。
(2)P1C46基因克隆
A.以实施例2中经密码子优化并化学合成的P基因为模板，用“P1上”和“P下”为引物扩增P1基因。
①扩增引物序列：
P1上：GGAATTCCATATG ATGGTTCTGTTTTTCTCTCTG(SEQ ID NO.23)；
P下：GGTCTTCTTCCATGTCGACCCGTTGTGCGGGTGCAGGTGAATC。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
P基因(模板)：各2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸40s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图12。
B.以C基因(AtCPR1，登录号：X66016)为模板，经大肠杆菌密码子优化，化学合成C基因，以C基因为模板，经疏水性分析，去掉前46氨基酸序列，用PC上和PC下为引物扩增C46基因。
①扩增引物序列：
PC上：GCACCCGCACAACGGGTCGACATGGAAGAAGACCACCGCGGACCG；
PC下：GGGGTACCTTACCACACATCACGCAGGTAGC。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
C46基因(模板)：各2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸40s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图12。
C.用P1上和PC下为引物扩增P1C46融合基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.24所示。
①扩增引物序列：
P1上：GGAATTCCATATG ATGGTTCTGTTTTTCTCTCTG；
PC下：GGGGTACCTTACCACACATCACGCAGGTAGC。
②扩增体系：
Max DNA polymerase：25μL；
引物(10μM)：各2μL；
P1基因和C46基因(模板)：各2μL；
补加蒸馏水至50μL。
③扩增条件：
1)98℃预变性10s2；2)98℃变性10s；3)62℃退火10s；4)72℃延伸40s；2)-4)循环35次；5)72℃延伸10min。
利用薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒胶回收目的基因片段，如图12。
(3)pACYDuet-1D612C46P1C46载体构建
将胶回收后的P1C46基因与载体pACYCDuet-1D612C46分别用NdeⅠ和KpnⅠ进行双酶切，如图17，载体pACYCDuet-1D612C46与外源片段P1C46按摩尔比1:5的比例，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后涂布含有30μg/mL氯霉素的LB(蛋白胨10％，酵母提取物5％，NaCl 10％，琼脂糖12％)固体平板上，挑转化子，过夜培养，菌液用2×Taq Master Mix(Dye Plus)PCR筛选阳性克隆，图18，送测序验证，测序结果与预期碱基序列完全匹配。所得质粒pACYCDuet-1D612C46P1C46的图谱如图3所示。
(4)重组菌株pCDFDuet-1SSSEpACYDuet-1D612C46P1C46(DE3)构建
将质粒pCDFDuet-1SSSE与质粒pACYDuet-1D612C46P1C46同时转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有100μg/mL链霉素和30μg/mL氯霉素的LB(蛋白胨10％、酵母提取物5％、NaCl 10％、琼脂糖12％)固体平板上，用2×Taq Master Mix(Dye Plus)筛选阳性克隆，由此获得重组菌株pCDFDuet-1SSSEpACYDuet-1D612C46P1C46BL21(DE3)。
(5)重组菌株发酵以及UPLC-MS/MS测定
同实施例4和5。
结果如图19所示，经UPLC-MS/MS检测，没有发现同原人参二醇标准品(图19A)和样品(图19C)的液质色谱图保留时间一致的目标峰，证明样品的发酵产物中不含有原人参二醇，说明重组菌株pCDFDuet-1SSSEpACYDuet-1D612C46P1C46(DE3)不能够产生原人参二醇。
<110> 上海医药工业研究院; 中国医药工业研究总院
<120> 一种生产原人参二醇的基因工程菌及其方法
<130> P1710076C
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1335
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60
aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120
cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180
catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240
atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300
gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360
gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420
caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480
gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540
tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600
aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660
accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720
gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780
ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840
ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900
gttatggcca ttgcaacctt ggttttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960
gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020
tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080
ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140
taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200
aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260
ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320
ttacacagag cgtga 1335
<210> 2
<211> 1491
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
atgtctgctg ttaacgttgc acctgaattg attaatgccg acaacacaat tacctacgat 60
gcgattgtca tcggtgctgg tgttatcggt ccatgtgttg ctactggtct agcaagaaag 120
ggtaagaaag ttcttatcgt agaacgtgac tgggctatgc ctgatagaat tgttggtgaa 180
ttgatgcaac caggtggtgt tagagcattg agaagtctgg gtatgattca atctatcaac 240
aacatcgaag catatcctgt taccggttat accgtctttt tcaacggcga acaagttgat 300
attccatacc cttacaaggc cgatatccct aaagttgaaa aattgaagga cttggtcaaa 360
gatggtaatg acaaggtctt ggaagacagc actattcaca tcaaggatta cgaagatgat 420
gaaagagaaa ggggtgttgc ttttgttcat ggtagattct tgaacaactt gagaaacatt 480
actgctcaag agccaaatgt tactagagtg caaggtaact gtattgagat attgaaggat 540
gaaaagaatg aggttgttgg tgccaaggtt gacattgatg gccgtggcaa ggtggaattc 600
aaagcccact tgacatttat ctgtgacggt atcttttcac gtttcagaaa ggaattgcac 660
ccagaccatg ttccaactgt cggttcttcg tttgtcggta tgtctttgtt caatgctaag 720
aatcctgctc ctatgcacgg tcacgttatt cttggtagtg atcatatgcc aatcttggtt 780
taccaaatca gtccagaaga aacaagaatc ctttgtgctt acaactctcc aaaggtccca 840
gctgatatca agagttggat gattaaggat gtccaacctt tcattccaaa gagtctacgt 900
ccttcatttg atgaagccgt cagccaaggt aaatttagag ctatgccaaa ctcctacttg 960
ccagctagac aaaacgacgt cactggtatg tgtgttatcg gtgacgctct aaatatgaga 1020
catccattga ctggtggtgg tatgactgtc ggtttgcatg atgttgtctt gttgattaag 1080
aaaataggtg acctagactt cagcgaccgt gaaaaggttt tggatgaatt actagactac 1140
catttcgaaa gaaagagtta cgattccgtt attaacgttt tgtcagtggc tttgtattct 1200
ttgttcgctg ctgacagcga taacttgaag gcattacaaa aaggttgttt caaatatttc 1260
caaagaggtg gcgattgtgt caacaaaccc gttgaatttc tgtctggtgt cttgccaaag 1320
cctttgcaat tgaccagggt tttcttcgct gtcgcttttt acaccattta cttgaacatg 1380
gaagaacgtg gtttcttggg attaccaatg gctttattgg aaggtattat gattttgatc 1440
acagctatta gagtattcac cccatttttg tttggtgagt tgattggtta a 1491
<210> 3
<211> 1833
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 截短的、经大肠杆菌密码子优化的达玛烯二醇合酶基因（D612）
<400> 3
atgtggaagc agaagggcgc acagggtaac gacccgtacc tgtactccac taacaacttc 60
gtgggtcgcc agtattggga gtttcagccg gacgctggca ccccggaaga gcgtgaagag 120
gttgaaaaag cgcgtaaaga ttatgtgaac aacaagaagc tgcatggtat tcatccgtgc 180
tctgacatgc tgatgcgccg tcagctgatt aaggagagcg gtattgacct gctgagcatt 240
ccgccgctgc gtctggatga aaacgagcag gttaactacg atgctgttac cactgctgtg 300
aaaaaagctc tgcgtctgaa ccgtgcgatt caggctcacg acggccactg gccggcagaa 360
aacgctggct ccctgctgta cactccgccg ctgatcatcg ctctgtatat ctccggcacc 420
attgacacca tcctgactaa gcagcacaaa aaggaactga tccgttttgt gtacaaccac 480
cagaacgaag atggcggttg gggttcttac attgaaggtc actctaccat gatcggttct 540
gttctgtctt acgtgatgct gcgcctgctg ggtgagggtc tggctgaatc tgatgatggt 600
aacggtgcgg tggagcgtgg ccgcaagtgg attctggacc acggtggtgc ggcaggtatt 660
ccgagctggg gtaagactta cctggcagtt ctgggtgttt atgaatggga gggctgtaac 720
ccgctgccgc cggagttttg gctgttcccg tctagctttc cgtttcaccc ggctaagatg 780
tggatctact gccgctgtac ttatatgccg atgtcttatc tgtatggtaa gcgctatcac 840
ggtccgatca ccgatctggt gctgtccctg cgtcaggaga tctataacat cccgtacgaa 900
cagattaaat ggaaccagca gcgtcacaac tgttgtaagg aagacctgta ttacccgcac 960
accctggttc aggacctggt ttgggatggc ctgcactatt ttagcgaacc gtttctgaag 1020
cgttggccgt tcaacaaact gcgtaaacgc ggcctgaaac gtgttgttga gctgatgcgt 1080
tatggcgcga ccgagacccg ttttatcact accggcaacg gcgagaaagc gctgcagatc 1140
atgagctggt gggcggagga cccgaacggt gacgagttca agcaccatct ggctcgcatc 1200
ccggattttc tgtggattgc ggaagacggt atgaccgttc agtctttcgg tagccagctg 1260
tgggattgta ttctggcaac tcaggcgatt attgcgacca acatggttga ggaatatggc 1320
gactccctga agaaagctca cttcttcatc aaggagtccc agatcaaaga gaacccgcgt 1380
ggtgacttcc tgaaaatgtg ccgccagttc actaaaggtg cgtggacctt ctctgaccag 1440
gaccacggct gcgttgtgag cgactgcacc gcagaagcac tgaagtgtct gctgctgctg 1500
tctcagatgc cgcaggatat cgttggcgaa aagccggaag ttgagcgcct gtacgaagca 1560
gttaacgttc tgctgtacct gcagtctcgt gttagcggtg gctttgcggt gtgggaaccg 1620
ccggttccga agccgtatct ggagatgctg aacccgtctg agattttcgc ggatattgtg 1680
gtggaacgtg aacacatcga atgtaccgcg tctgttatca aaggtctgat ggcgttcaaa 1740
tgtctgcatc cgggtcatcg tcagaaagaa atcgaagact ctgttgcgaa agcgatccgc 1800
tacctggaac gcaaccagat gccggatggc tct 1833
<210> 4
<211> 1380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 截短的、经大肠杆菌密码子优化的原人参二醇合酶基因（P72）
<400> 4
atgaaacgta tcccgcagaa ggagaacgac tctaaagctc cgctgccgcc gggtcagacc 60
ggctggccgc tgatcggtga aaccctgaac tatctgtctt gcgttaaatc tggtgtttct 120
gagaacttcg ttaagtaccg taaagagaag tatagcccga aggtttttcg taccagcctg 180
ctgggcgaac cgatggcgat cctgtgtggc ccggaaggta acaaatttct gtactctacc 240
gaaaagaagc tggttcaggt ttggttcccg tcctctgtgg aaaaaatgtt cccgcgctct 300
cacggcgaat ctaacgctga taacttttct aaagttcgtg gtaagatgat gttcctgctg 360
aaagttgatg gtatgaaaaa gtatgttggc ctgatggacc gtgtgatgaa gcagtttctg 420
gagactgact ggaaccgcca gcagcagatt aacgtgcaca acactgttaa gaaatatact 480
gttaccatgt cttgtcgtgt tttcatgtct attgacgacg aggaacaggt tactcgtctg 540
ggtagctcta tccagaacat cgaagcgggt ctgctggcag ttccgatcaa cattccgggc 600
accgctatga accgtgctat caaaaccgtt aagctgctga ctcgcgaagt tgaagcggtt 660
atcaagcagc gtaaggttga cctgctggag aacaagcagg cgtctcagcc gcaggacctg 720
ctgtcccatc tgctgctgac cgcgaaccag gacggtcagt tcctgtctga atctgacatc 780
gcgagccacc tgattggtct gatgcagggc ggctacacta ctctgaacgg caccattact 840
tttgttctga actacctggc ggagttcccg gatgtttaca accaggtgct gaaggagcag 900
gttgaaatcg cgaactctaa gcatccgaaa gaactgctga actgggaaga tctgcgcaaa 960
atgaaatact cttggaacgt tgctcaggaa gtgctgcgca tcattccgcc gggtgttggt 1020
actttccgtg aggcgatcac cgacttcacc tacgctggct acctgatccc gaaaggttgg 1080
aaaatgcatc tgattccgca tgacacccac aaaaacccga cttacttccc gagcccggag 1140
aaattcgacc cgacccgttt cgaaggcaac ggtccggctc cgtatacctt tactccgttc 1200
ggcggtggtc cgcgtatgtg cccgggtatc gaatatgcgc gtctggttat tctgatcttc 1260
atgcataacg tggttactaa ctttcgttgg gaaaaactga ttccgaacga gaaaatcctg 1320
accgatccga tcccgcgttt cgcgcacggt ctgccgattc acctgcaccc gcacaactaa 1380
<210> 5
<211> 1941
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 截短的、经大肠杆菌密码子优化的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因（C46）
<400> 5
tggaagaaga ccaccgcgga ccgctccggc gaactgaagc cgctgatgat tccgaagtct 60
ctgatggcta aagacgaaga tgatgatctg gacctgggca gcggcaaaac tcgtgtgtct 120
attttctttg gtactcagac tggtactgcg gagggttttg ctaaggcgct gtccgaggaa 180
atcaaagcgc gttatgaaaa ggcagctgtg aaagtgattg acctggatga ctatgcggca 240
gacgacgacc agtacgaaga aaaactgaaa aaagagaccc tggcgttctt ttgtgttgcg 300
acctacggcg atggcgagcc gaccgacaac gctgcacgct tttccaaatg gttcactgag 360
gagaacgaac gcgacattaa actgcagcag ctggcatacg gcgtgttcgc actgggcaac 420
cgtcagtatg aacactttaa caaaattggt atcgtgctgg acgaggaact gtgtaaaaaa 480
ggcgcaaaac gtctgattga agtgggtctg ggcgatgacg atcagtctat tgaggacgat 540
ttcaacgcgt ggaaggaatc cctgtggtcc gaactggata agctgctgaa ggatgaagac 600
gataagtctg tggctacccc gtataccgca gttatcccgg aataccgtgt tgtgactcat 660
gacccgcgct tcaccaccca gaagtctatg gagtctaacg ttgctaacgg taacaccacc 720
attgacatcc atcacccgtg ccgtgtggac gtggctgttc agaaggagct gcatacccac 780
gagagcgacc gttcttgcat ccacctggag ttcgacatct ctcgcaccgg catcacctat 840
gaaaccggtg accatgttgg cgtttatgct gagaaccacg ttgagatcgt tgaggaggca 900
ggcaaactgc tgggccactc cctggatctg gtgtttagca ttcacgcgga caaggaagat 960
ggcagcccgc tggaaagcgc agttccgccg ccgtttccgg gtccgtgtac cctgggcacc 1020
ggcctggctc gttatgcgga tctgctgaac ccgccgcgta aatctgcgct ggttgcactg 1080
gcggcgtatg cgactgaacc gagcgaggca gagaagctga aacatctgac ttctccggac 1140
ggtaaggacg aatactctca gtggatcgtg gcatcccagc gctccctgct ggaagttatg 1200
gctgcgttcc cgagcgctaa accgccgctg ggtgtgtttt ttgcagcgat tgctccgcgc 1260
ctgcagccgc gttactattc tatttcttct tgccaggact gggctccgtc ccgtgttcac 1320
gttacctctg ctctggttta cggtccgacc ccgaccggcc gtatccacaa gggcgtttgt 1380
tctacttgga tgaaaaacgc ggttccggcg gagaaatctc atgaatgcag cggtgcgccg 1440
atctttatcc gtgcgtccaa cttcaagctg ccgtctaacc cgtctactcc gattgttatg 1500
gttggtccgg gcaccggtct ggcaccgttc cgtggttttc tgcaggagcg tatggctctg 1560
aaagaggacg gtgaagaact gggttctagc ctgctgtttt tcggttgtcg taaccgccag 1620
atggatttta tctacgagga tgagctgaac aacttcgtgg accagggtgt tatcagcgag 1680
ctgattatgg cattttctcg cgaaggtgcg cagaaagagt atgtgcagca caaaatgatg 1740
gagaaagcgg cgcaggtgtg ggacctgatt aaagaagagg gttatctgta tgtttgcggc 1800
gacgcaaaag gtatggcacg tgacgtgcat cgcactctgc acaccatcgt tcaggaacag 1860
gaaggcgttt cttcctctga agcagaagcg attgttaaaa agctgcagac tgaaggtcgc 1920
tacctgcgtg atgtgtggta a 1941
<210> 6
<211> 3783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合基因D612C46
<400> 6
atgtggaagc agaagggcgc acagggtaac gacccgtacc tgtactccac taacaacttc 60
gtgggtcgcc agtattggga gtttcagccg gacgctggca ccccggaaga gcgtgaagag 120
gttgaaaaag cgcgtaaaga ttatgtgaac aacaagaagc tgcatggtat tcatccgtgc 180
tctgacatgc tgatgcgccg tcagctgatt aaggagagcg gtattgacct gctgagcatt 240
ccgccgctgc gtctggatga aaacgagcag gttaactacg atgctgttac cactgctgtg 300
aaaaaagctc tgcgtctgaa ccgtgcgatt caggctcacg acggccactg gccggcagaa 360
aacgctggct ccctgctgta cactccgccg ctgatcatcg ctctgtatat ctccggcacc 420
attgacacca tcctgactaa gcagcacaaa aaggaactga tccgttttgt gtacaaccac 480
cagaacgaag atggcggttg gggttcttac attgaaggtc actctaccat gatcggttct 540
gttctgtctt acgtgatgct gcgcctgctg ggtgagggtc tggctgaatc tgatgatggt 600
aacggtgcgg tggagcgtgg ccgcaagtgg attctggacc acggtggtgc ggcaggtatt 660
ccgagctggg gtaagactta cctggcagtt ctgggtgttt atgaatggga gggctgtaac 720
ccgctgccgc cggagttttg gctgttcccg tctagctttc cgtttcaccc ggctaagatg 780
tggatctact gccgctgtac ttatatgccg atgtcttatc tgtatggtaa gcgctatcac 840
ggtccgatca ccgatctggt gctgtccctg cgtcaggaga tctataacat cccgtacgaa 900
cagattaaat ggaaccagca gcgtcacaac tgttgtaagg aagacctgta ttacccgcac 960
accctggttc aggacctggt ttgggatggc ctgcactatt ttagcgaacc gtttctgaag 1020
cgttggccgt tcaacaaact gcgtaaacgc ggcctgaaac gtgttgttga gctgatgcgt 1080
tatggcgcga ccgagacccg ttttatcact accggcaacg gcgagaaagc gctgcagatc 1140
atgagctggt gggcggagga cccgaacggt gacgagttca agcaccatct ggctcgcatc 1200
ccggattttc tgtggattgc ggaagacggt atgaccgttc agtctttcgg tagccagctg 1260
tgggattgta ttctggcaac tcaggcgatt attgcgacca acatggttga ggaatatggc 1320
gactccctga agaaagctca cttcttcatc aaggagtccc agatcaaaga gaacccgcgt 1380
ggtgacttcc tgaaaatgtg ccgccagttc actaaaggtg cgtggacctt ctctgaccag 1440
gaccacggct gcgttgtgag cgactgcacc gcagaagcac tgaagtgtct gctgctgctg 1500
tctcagatgc cgcaggatat cgttggcgaa aagccggaag ttgagcgcct gtacgaagca 1560
gttaacgttc tgctgtacct gcagtctcgt gttagcggtg gctttgcggt gtgggaaccg 1620
ccggttccga agccgtatct ggagatgctg aacccgtctg agattttcgc ggatattgtg 1680
gtggaacgtg aacacatcga atgtaccgcg tctgttatca aaggtctgat ggcgttcaaa 1740
tgtctgcatc cgggtcatcg tcagaaagaa atcgaagact ctgttgcgaa agcgatccgc 1800
tacctggaac gcaaccagat gccggatggc tctgggtcga catggaagaa gaccaccgcg 1860
gaccgctccg gcgaactgaa gccgctgatg attccgaagt ctctgatggc taaagacgaa 1920
gatgatgatc tggacctggg cagcggcaaa actcgtgtgt ctattttctt tggtactcag 1980
actggtactg cggagggttt tgctaaggcg ctgtccgagg aaatcaaagc gcgttatgaa 2040
aaggcagctg tgaaagtgat tgacctggat gactatgcgg cagacgacga ccagtacgaa 2100
gaaaaactga aaaaagagac cctggcgttc ttttgtgttg cgacctacgg cgatggcgag 2160
ccgaccgaca acgctgcacg cttttccaaa tggttcactg aggagaacga acgcgacatt 2220
aaactgcagc agctggcata cggcgtgttc gcactgggca accgtcagta tgaacacttt 2280
aacaaaattg gtatcgtgct ggacgaggaa ctgtgtaaaa aaggcgcaaa acgtctgatt 2340
gaagtgggtc tgggcgatga cgatcagtct attgaggacg atttcaacgc gtggaaggaa 2400
tccctgtggt ccgaactgga taagctgctg aaggatgaag acgataagtc tgtggctacc 2460
ccgtataccg cagttatccc ggaataccgt gttgtgactc atgacccgcg cttcaccacc 2520
cagaagtcta tggagtctaa cgttgctaac ggtaacacca ccattgacat ccatcacccg 2580
tgccgtgtgg acgtggctgt tcagaaggag ctgcataccc acgagagcga ccgttcttgc 2640
atccacctgg agttcgacat ctctcgcacc ggcatcacct atgaaaccgg tgaccatgtt 2700
ggcgtttatg ctgagaacca cgttgagatc gttgaggagg caggcaaact gctgggccac 2760
tccctggatc tggtgtttag cattcacgcg gacaaggaag atggcagccc gctggaaagc 2820
gcagttccgc cgccgtttcc gggtccgtgt accctgggca ccggcctggc tcgttatgcg 2880
gatctgctga acccgccgcg taaatctgcg ctggttgcac tggcggcgta tgcgactgaa 2940
ccgagcgagg cagagaagct gaaacatctg acttctccgg acggtaagga cgaatactct 3000
cagtggatcg tggcatccca gcgctccctg ctggaagtta tggctgcgtt cccgagcgct 3060
aaaccgccgc tgggtgtgtt ttttgcagcg attgctccgc gcctgcagcc gcgttactat 3120
tctatttctt cttgccagga ctgggctccg tcccgtgttc acgttacctc tgctctggtt 3180
tacggtccga ccccgaccgg ccgtatccac aagggcgttt gttctacttg gatgaaaaac 3240
gcggttccgg cggagaaatc tcatgaatgc agcggtgcgc cgatctttat ccgtgcgtcc 3300
aacttcaagc tgccgtctaa cccgtctact ccgattgtta tggttggtcc gggcaccggt 3360
ctggcaccgt tccgtggttt tctgcaggag cgtatggctc tgaaagagga cggtgaagaa 3420
ctgggttcta gcctgctgtt tttcggttgt cgtaaccgcc agatggattt tatctacgag 3480
gatgagctga acaacttcgt ggaccagggt gttatcagcg agctgattat ggcattttct 3540
cgcgaaggtg cgcagaaaga gtatgtgcag cacaaaatga tggagaaagc ggcgcaggtg 3600
tgggacctga ttaaagaaga gggttatctg tatgtttgcg gcgacgcaaa aggtatggca 3660
cgtgacgtgc atcgcactct gcacaccatc gttcaggaac aggaaggcgt ttcttcctct 3720
gaagcagaag cgattgttaa aaagctgcag actgaaggtc gctacctgcg tgatgtgtgg 3780
taa 3783
<210> 7
<211> 3327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合基因P72C46
<400> 7
atgaaacgta tcccgcagaa ggagaacgac tctaaagctc cgctgccgcc gggtcagacc 60
ggctggccgc tgatcggtga aaccctgaac tatctgtctt gcgttaaatc tggtgtttct 120
gagaacttcg ttaagtaccg taaagagaag tatagcccga aggtttttcg taccagcctg 180
ctgggcgaac cgatggcgat cctgtgtggc ccggaaggta acaaatttct gtactctacc 240
gaaaagaagc tggttcaggt ttggttcccg tcctctgtgg aaaaaatgtt cccgcgctct 300
cacggcgaat ctaacgctga taacttttct aaagttcgtg gtaagatgat gttcctgctg 360
aaagttgatg gtatgaaaaa gtatgttggc ctgatggacc gtgtgatgaa gcagtttctg 420
gagactgact ggaaccgcca gcagcagatt aacgtgcaca acactgttaa gaaatatact 480
gttaccatgt cttgtcgtgt tttcatgtct attgacgacg aggaacaggt tactcgtctg 540
ggtagctcta tccagaacat cgaagcgggt ctgctggcag ttccgatcaa cattccgggc 600
accgctatga accgtgctat caaaaccgtt aagctgctga ctcgcgaagt tgaagcggtt 660
atcaagcagc gtaaggttga cctgctggag aacaagcagg cgtctcagcc gcaggacctg 720
ctgtcccatc tgctgctgac cgcgaaccag gacggtcagt tcctgtctga atctgacatc 780
gcgagccacc tgattggtct gatgcagggc ggctacacta ctctgaacgg caccattact 840
tttgttctga actacctggc ggagttcccg gatgtttaca accaggtgct gaaggagcag 900
gttgaaatcg cgaactctaa gcatccgaaa gaactgctga actgggaaga tctgcgcaaa 960
atgaaatact cttggaacgt tgctcaggaa gtgctgcgca tcattccgcc gggtgttggt 1020
actttccgtg aggcgatcac cgacttcacc tacgctggct acctgatccc gaaaggttgg 1080
aaaatgcatc tgattccgca tgacacccac aaaaacccga cttacttccc gagcccggag 1140
aaattcgacc cgacccgttt cgaaggcaac ggtccggctc cgtatacctt tactccgttc 1200
ggcggtggtc cgcgtatgtg cccgggtatc gaatatgcgc gtctggttat tctgatcttc 1260
atgcataacg tggttactaa ctttcgttgg gaaaaactga ttccgaacga gaaaatcctg 1320
accgatccga tcccgcgttt cgcgcacggt ctgccgattc acctgcaccc gcacaacggg 1380
tcgacatgga agaagaccac cgcggaccgc tccggcgaac tgaagccgct gatgattccg 1440
aagtctctga tggctaaaga cgaagatgat gatctggacc tgggcagcgg caaaactcgt 1500
gtgtctattt tctttggtac tcagactggt actgcggagg gttttgctaa ggcgctgtcc 1560
gaggaaatca aagcgcgtta tgaaaaggca gctgtgaaag tgattgacct ggatgactat 1620
gcggcagacg acgaccagta cgaagaaaaa ctgaaaaaag agaccctggc gttcttttgt 1680
gttgcgacct acggcgatgg cgagccgacc gacaacgctg cacgcttttc caaatggttc 1740
actgaggaga acgaacgcga cattaaactg cagcagctgg catacggcgt gttcgcactg 1800
ggcaaccgtc agtatgaaca ctttaacaaa attggtatcg tgctggacga ggaactgtgt 1860
aaaaaaggcg caaaacgtct gattgaagtg ggtctgggcg atgacgatca gtctattgag 1920
gacgatttca acgcgtggaa ggaatccctg tggtccgaac tggataagct gctgaaggat 1980
gaagacgata agtctgtggc taccccgtat accgcagtta tcccggaata ccgtgttgtg 2040
actcatgacc cgcgcttcac cacccagaag tctatggagt ctaacgttgc taacggtaac 2100
accaccattg acatccatca cccgtgccgt gtggacgtgg ctgttcagaa ggagctgcat 2160
acccacgaga gcgaccgttc ttgcatccac ctggagttcg acatctctcg caccggcatc 2220
acctatgaaa ccggtgacca tgttggcgtt tatgctgaga accacgttga gatcgttgag 2280
gaggcaggca aactgctggg ccactccctg gatctggtgt ttagcattca cgcggacaag 2340
gaagatggca gcccgctgga aagcgcagtt ccgccgccgt ttccgggtcc gtgtaccctg 2400
ggcaccggcc tggctcgtta tgcggatctg ctgaacccgc cgcgtaaatc tgcgctggtt 2460
gcactggcgg cgtatgcgac tgaaccgagc gaggcagaga agctgaaaca tctgacttct 2520
ccggacggta aggacgaata ctctcagtgg atcgtggcat cccagcgctc cctgctggaa 2580
gttatggctg cgttcccgag cgctaaaccg ccgctgggtg tgttttttgc agcgattgct 2640
ccgcgcctgc agccgcgtta ctattctatt tcttcttgcc aggactgggc tccgtcccgt 2700
gttcacgtta cctctgctct ggtttacggt ccgaccccga ccggccgtat ccacaagggc 2760
gtttgttcta cttggatgaa aaacgcggtt ccggcggaga aatctcatga atgcagcggt 2820
gcgccgatct ttatccgtgc gtccaacttc aagctgccgt ctaacccgtc tactccgatt 2880
gttatggttg gtccgggcac cggtctggca ccgttccgtg gttttctgca ggagcgtatg 2940
gctctgaaag aggacggtga agaactgggt tctagcctgc tgtttttcgg ttgtcgtaac 3000
cgccagatgg attttatcta cgaggatgag ctgaacaact tcgtggacca gggtgttatc 3060
agcgagctga ttatggcatt ttctcgcgaa ggtgcgcaga aagagtatgt gcagcacaaa 3120
atgatggaga aagcggcgca ggtgtgggac ctgattaaag aagagggtta tctgtatgtt 3180
tgcggcgacg caaaaggtat ggcacgtgac gtgcatcgca ctctgcacac catcgttcag 3240
gaacaggaag gcgtttcttc ctctgaagca gaagcgattg ttaaaaagct gcagactgaa 3300
ggtcgctacc tgcgtgatgt gtggtaa 3327
<210> 8
<211> 2310
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 经大肠杆菌密码子优化的达玛二烯合酶
<400> 8
atgtggaagc agaagggcgc acagggtaac gacccgtacc tgtactccac taacaacttc 60
gtgggtcgcc agtattggga gtttcagccg gacgctggca ccccggaaga gcgtgaagag 120
gttgaaaaag cgcgtaaaga ttatgtgaac aacaagaagc tgcatggtat tcatccgtgc 180
tctgacatgc tgatgcgccg tcagctgatt aaggagagcg gtattgacct gctgagcatt 240
ccgccgctgc gtctggatga aaacgagcag gttaactacg atgctgttac cactgctgtg 300
aaaaaagctc tgcgtctgaa ccgtgcgatt caggctcacg acggccactg gccggcagaa 360
aacgctggct ccctgctgta cactccgccg ctgatcatcg ctctgtatat ctccggcacc 420
attgacacca tcctgactaa gcagcacaaa aaggaactga tccgttttgt gtacaaccac 480
cagaacgaag atggcggttg gggttcttac attgaaggtc actctaccat gatcggttct 540
gttctgtctt acgtgatgct gcgcctgctg ggtgagggtc tggctgaatc tgatgatggt 600
aacggtgcgg tggagcgtgg ccgcaagtgg attctggacc acggtggtgc ggcaggtatt 660
ccgagctggg gtaagactta cctggcagtt ctgggtgttt atgaatggga gggctgtaac 720
ccgctgccgc cggagttttg gctgttcccg tctagctttc cgtttcaccc ggctaagatg 780
tggatctact gccgctgtac ttatatgccg atgtcttatc tgtatggtaa gcgctatcac 840
ggtccgatca ccgatctggt gctgtccctg cgtcaggaga tctataacat cccgtacgaa 900
cagattaaat ggaaccagca gcgtcacaac tgttgtaagg aagacctgta ttacccgcac 960
accctggttc aggacctggt ttgggatggc ctgcactatt ttagcgaacc gtttctgaag 1020
cgttggccgt tcaacaaact gcgtaaacgc ggcctgaaac gtgttgttga gctgatgcgt 1080
tatggcgcga ccgagacccg ttttatcact accggcaacg gcgagaaagc gctgcagatc 1140
atgagctggt gggcggagga cccgaacggt gacgagttca agcaccatct ggctcgcatc 1200
ccggattttc tgtggattgc ggaagacggt atgaccgttc agtctttcgg tagccagctg 1260
tgggattgta ttctggcaac tcaggcgatt attgcgacca acatggttga ggaatatggc 1320
gactccctga agaaagctca cttcttcatc aaggagtccc agatcaaaga gaacccgcgt 1380
ggtgacttcc tgaaaatgtg ccgccagttc actaaaggtg cgtggacctt ctctgaccag 1440
gaccacggct gcgttgtgag cgactgcacc gcagaagcac tgaagtgtct gctgctgctg 1500
tctcagatgc cgcaggatat cgttggcgaa aagccggaag ttgagcgcct gtacgaagca 1560
gttaacgttc tgctgtacct gcagtctcgt gttagcggtg gctttgcggt gtgggaaccg 1620
ccggttccga agccgtatct ggagatgctg aacccgtctg agattttcgc ggatattgtg 1680
gtggaacgtg aacacatcga atgtaccgcg tctgttatca aaggtctgat ggcgttcaaa 1740
tgtctgcatc cgggtcatcg tcagaaagaa atcgaagact ctgttgcgaa agcgatccgc 1800
tacctggaac gcaaccagat gccggatggc tcttggtacg gtttttgggg tatttgcttt 1860
ctgtacggca ccttctttac tctgagcggt ttcgcgtccg ctggccgtac ttacgacaac 1920
agcgaggcag tgcgcaaagg cgttaaattc ttcctgtcca ctcagaacga agaaggcggc 1980
tggggcgagt ctctggaatc ttgtccgagc gaaaaattca ccccgctgaa aggtaaccgc 2040
actaacctgg tgcagacctc ttgggcaatg ctgggcctga tgttcggtgg ccaggcggaa 2100
cgcgacccga ctccgctgca tcgcgctgcg aaactgctga tcaacgcgca gatggacaac 2160
ggcgactttc cgcagcagga aatcactggt gtgtattgca agaactccat gctgcattac 2220
gctgagtatc gtaacatctt cccgctgtgg gctctgggcg aataccgtaa gcgtgtgtgg 2280
ctgccgaaac accagcagct gaagatctaa 2310
<210> 9
<211> 1449
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 经大肠杆菌密码子优化的原人参二醇合酶
<400> 9
atggttctgt ttttctctct gtccctgctg ctgctgccgc tgctgctgct gtttgcttat 60
ttctcttaca ccaaacgtat cccgcagaag gagaacgact ctaaagctcc gctgccgccg 120
ggtcagaccg gctggccgct gatcggtgaa accctgaact atctgtcttg cgttaaatct 180
ggtgtttctg agaacttcgt taagtaccgt aaagagaagt atagcccgaa ggtttttcgt 240
accagcctgc tgggcgaacc gatggcgatc ctgtgtggcc cggaaggtaa caaatttctg 300
tactctaccg aaaagaagct ggttcaggtt tggttcccgt cctctgtgga aaaaatgttc 360
ccgcgctctc acggcgaatc taacgctgat aacttttcta aagttcgtgg taagatgatg 420
ttcctgctga aagttgatgg tatgaaaaag tatgttggcc tgatggaccg tgtgatgaag 480
cagtttctgg agactgactg gaaccgccag cagcagatta acgtgcacaa cactgttaag 540
aaatatactg ttaccatgtc ttgtcgtgtt ttcatgtcta ttgacgacga ggaacaggtt 600
actcgtctgg gtagctctat ccagaacatc gaagcgggtc tgctggcagt tccgatcaac 660
attccgggca ccgctatgaa ccgtgctatc aaaaccgtta agctgctgac tcgcgaagtt 720
gaagcggtta tcaagcagcg taaggttgac ctgctggaga acaagcaggc gtctcagccg 780
caggacctgc tgtcccatct gctgctgacc gcgaaccagg acggtcagtt cctgtctgaa 840
tctgacatcg cgagccacct gattggtctg atgcagggcg gctacactac tctgaacggc 900
accattactt ttgttctgaa ctacctggcg gagttcccgg atgtttacaa ccaggtgctg 960
aaggagcagg ttgaaatcgc gaactctaag catccgaaag aactgctgaa ctgggaagat 1020
ctgcgcaaaa tgaaatactc ttggaacgtt gctcaggaag tgctgcgcat cattccgccg 1080
ggtgttggta ctttccgtga ggcgatcacc gacttcacct acgctggcta cctgatcccg 1140
aaaggttgga aaatgcatct gattccgcat gacacccaca aaaacccgac ttacttcccg 1200
agcccggaga aattcgaccc gacccgtttc gaaggcaacg gtccggctcc gtataccttt 1260
actccgttcg gcggtggtcc gcgtatgtgc ccgggtatcg aatatgcgcg tctggttatt 1320
ctgatcttca tgcataacgt ggttactaac tttcgttggg aaaaactgat tccgaacgag 1380
aaaatcctga ccgatccgat cccgcgtttc gcgcacggtc tgccgattca cctgcacccg 1440
cacaactaa 1449
<210> 10
<211> 2079
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 经大肠杆菌密码子优化的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶基因
<400> 10
atgactagcg cactgtacgc atccgatctg ttcaaacagc tgaagtccat tatgggtact 60
gattccctgt ctgacgatgt ggtgctggtg atcgcgacca ccagcctggc actggtggcg 120
ggcttcgttg ttctgctgtg gaagaagacc accgcggacc gctccggcga actgaagccg 180
ctgatgattc cgaagtctct gatggctaaa gacgaagatg atgatctgga cctgggcagc 240
ggcaaaactc gtgtgtctat tttctttggt actcagactg gtactgcgga gggttttgct 300
aaggcgctgt ccgaggaaat caaagcgcgt tatgaaaagg cagctgtgaa agtgattgac 360
ctggatgact atgcggcaga cgacgaccag tacgaagaaa aactgaaaaa agagaccctg 420
gcgttctttt gtgttgcgac ctacggcgat ggcgagccga ccgacaacgc tgcacgcttt 480
tccaaatggt tcactgagga gaacgaacgc gacattaaac tgcagcagct ggcatacggc 540
gtgttcgcac tgggcaaccg tcagtatgaa cactttaaca aaattggtat cgtgctggac 600
gaggaactgt gtaaaaaagg cgcaaaacgt ctgattgaag tgggtctggg cgatgacgat 660
cagtctattg aggacgattt caacgcgtgg aaggaatccc tgtggtccga actggataag 720
ctgctgaagg atgaagacga taagtctgtg gctaccccgt ataccgcagt tatcccggaa 780
taccgtgttg tgactcatga cccgcgcttc accacccaga agtctatgga gtctaacgtt 840
gctaacggta acaccaccat tgacatccat cacccgtgcc gtgtggacgt ggctgttcag 900
aaggagctgc atacccacga gagcgaccgt tcttgcatcc acctggagtt cgacatctct 960
cgcaccggca tcacctatga aaccggtgac catgttggcg tttatgctga gaaccacgtt 1020
gagatcgttg aggaggcagg caaactgctg ggccactccc tggatctggt gtttagcatt 1080
cacgcggaca aggaagatgg cagcccgctg gaaagcgcag ttccgccgcc gtttccgggt 1140
ccgtgtaccc tgggcaccgg cctggctcgt tatgcggatc tgctgaaccc gccgcgtaaa 1200
tctgcgctgg ttgcactggc ggcgtatgcg actgaaccga gcgaggcaga gaagctgaaa 1260
catctgactt ctccggacgg taaggacgaa tactctcagt ggatcgtggc atcccagcgc 1320
tccctgctgg aagttatggc tgcgttcccg agcgctaaac cgccgctggg tgtgtttttt 1380
gcagcgattg ctccgcgcct gcagccgcgt tactattcta tttcttcttg ccaggactgg 1440
gctccgtccc gtgttcacgt tacctctgct ctggtttacg gtccgacccc gaccggccgt 1500
atccacaagg gcgtttgttc tacttggatg aaaaacgcgg ttccggcgga gaaatctcat 1560
gaatgcagcg gtgcgccgat ctttatccgt gcgtccaact tcaagctgcc gtctaacccg 1620
tctactccga ttgttatggt tggtccgggc accggtctgg caccgttccg tggttttctg 1680
caggagcgta tggctctgaa agaggacggt gaagaactgg gttctagcct gctgtttttc 1740
ggttgtcgta accgccagat ggattttatc tacgaggatg agctgaacaa cttcgtggac 1800
cagggtgtta tcagcgagct gattatggca ttttctcgcg aaggtgcgca gaaagagtat 1860
gtgcagcaca aaatgatgga gaaagcggcg caggtgtggg acctgattaa agaagagggt 1920
tatctgtatg tttgcggcga cgcaaaaggt atggcacgtg acgtgcatcg cactctgcac 1980
accatcgttc aggaacagga aggcgtttct tcctctgaag cagaagcgat tgttaaaaag 2040
ctgcagactg aaggtcgcta cctgcgtgat gtgtggtaa 2079
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SS上
<400> 11
cgggatccga tgggaaagct attacaattg 30
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SS下
<400> 12
ccaagctttc acgctctgtg taaagtgtat atataataaa ac 42
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SE上
<400> 13
gaagatctca tgtctgctgt taacgttgca c 31
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SE下
<400> 14
ggggtacctt aaccaatcaa ctcaccaaac 30
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物D上
<400> 15
cgcggatccg atgtggaagc agaagggcgc acag 34
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物D下
<400> 16
gtggtcttct tccatgtcga cccagagcca tccggcatct ggttgc 46
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物DC上
<400> 17
gccggatggc tctgggtcga catggaagaa gaccaccgcg gacc 44
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物DC下
<400> 18
cccaagcttt taccacacat cacgcaggta gc 32
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物P上
<400> 19
ggaattccat atgatgaaac gtatcccgca gaagg 35
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物P下
<400> 20
ggtcttcttc catgtcgacc cgttgtgcgg gtgcaggtga atc 43
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物PC上
<400> 21
gcacccgcac aacgggtcga catggaagaa gaccaccgcg gaccg 45
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物PC下
<400> 22
ggggtacctt accacacatc acgcaggtag c 31
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物P1上
<400> 23
ggaattccat atgatggttc tgtttttctc tctg 34
<210> 24
<211> 3396
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合基因P1C46
<400> 24
atggttctgt ttttctctct gtccctgctg ctgctgccgc tgctgctgct gtttgcttat 60
ttctcttaca ccaaacgtat cccgcagaag gagaacgact ctaaagctcc gctgccgccg 120
ggtcagaccg gctggccgct gatcggtgaa accctgaact atctgtcttg cgttaaatct 180
ggtgtttctg agaacttcgt taagtaccgt aaagagaagt atagcccgaa ggtttttcgt 240
accagcctgc tgggcgaacc gatggcgatc ctgtgtggcc cggaaggtaa caaatttctg 300
tactctaccg aaaagaagct ggttcaggtt tggttcccgt cctctgtgga aaaaatgttc 360
ccgcgctctc acggcgaatc taacgctgat aacttttcta aagttcgtgg taagatgatg 420
ttcctgctga aagttgatgg tatgaaaaag tatgttggcc tgatggaccg tgtgatgaag 480
cagtttctgg agactgactg gaaccgccag cagcagatta acgtgcacaa cactgttaag 540
aaatatactg ttaccatgtc ttgtcgtgtt ttcatgtcta ttgacgacga ggaacaggtt 600
actcgtctgg gtagctctat ccagaacatc gaagcgggtc tgctggcagt tccgatcaac 660
attccgggca ccgctatgaa ccgtgctatc aaaaccgtta agctgctgac tcgcgaagtt 720
gaagcggtta tcaagcagcg taaggttgac ctgctggaga acaagcaggc gtctcagccg 780
caggacctgc tgtcccatct gctgctgacc gcgaaccagg acggtcagtt cctgtctgaa 840
tctgacatcg cgagccacct gattggtctg atgcagggcg gctacactac tctgaacggc 900
accattactt ttgttctgaa ctacctggcg gagttcccgg atgtttacaa ccaggtgctg 960
aaggagcagg ttgaaatcgc gaactctaag catccgaaag aactgctgaa ctgggaagat 1020
ctgcgcaaaa tgaaatactc ttggaacgtt gctcaggaag tgctgcgcat cattccgccg 1080
ggtgttggta ctttccgtga ggcgatcacc gacttcacct acgctggcta cctgatcccg 1140
aaaggttgga aaatgcatct gattccgcat gacacccaca aaaacccgac ttacttcccg 1200
agcccggaga aattcgaccc gacccgtttc gaaggcaacg gtccggctcc gtataccttt 1260
actccgttcg gcggtggtcc gcgtatgtgc ccgggtatcg aatatgcgcg tctggttatt 1320
ctgatcttca tgcataacgt ggttactaac tttcgttggg aaaaactgat tccgaacgag 1380
aaaatcctga ccgatccgat cccgcgtttc gcgcacggtc tgccgattca cctgcacccg 1440
cacaacgggt cgacatggaa gaagaccacc gcggaccgct ccggcgaact gaagccgctg 1500
atgattccga agtctctgat ggctaaagac gaagatgatg atctggacct gggcagcggc 1560
aaaactcgtg tgtctatttt ctttggtact cagactggta ctgcggaggg ttttgctaag 1620
gcgctgtccg aggaaatcaa agcgcgttat gaaaaggcag ctgtgaaagt gattgacctg 1680
gatgactatg cggcagacga cgaccagtac gaagaaaaac tgaaaaaaga gaccctggcg 1740
ttcttttgtg ttgcgaccta cggcgatggc gagccgaccg acaacgctgc acgcttttcc 1800
aaatggttca ctgaggagaa cgaacgcgac attaaactgc agcagctggc atacggcgtg 1860
ttcgcactgg gcaaccgtca gtatgaacac tttaacaaaa ttggtatcgt gctggacgag 1920
gaactgtgta aaaaaggcgc aaaacgtctg attgaagtgg gtctgggcga tgacgatcag 1980
tctattgagg acgatttcaa cgcgtggaag gaatccctgt ggtccgaact ggataagctg 2040
ctgaaggatg aagacgataa gtctgtggct accccgtata ccgcagttat cccggaatac 2100
cgtgttgtga ctcatgaccc gcgcttcacc acccagaagt ctatggagtc taacgttgct 2160
aacggtaaca ccaccattga catccatcac ccgtgccgtg tggacgtggc tgttcagaag 2220
gagctgcata cccacgagag cgaccgttct tgcatccacc tggagttcga catctctcgc 2280
accggcatca cctatgaaac cggtgaccat gttggcgttt atgctgagaa ccacgttgag 2340
atcgttgagg aggcaggcaa actgctgggc cactccctgg atctggtgtt tagcattcac 2400
gcggacaagg aagatggcag cccgctggaa agcgcagttc cgccgccgtt tccgggtccg 2460
tgtaccctgg gcaccggcct ggctcgttat gcggatctgc tgaacccgcc gcgtaaatct 2520
gcgctggttg cactggcggc gtatgcgact gaaccgagcg aggcagagaa gctgaaacat 2580
ctgacttctc cggacggtaa ggacgaatac tctcagtgga tcgtggcatc ccagcgctcc 2640
ctgctggaag ttatggctgc gttcccgagc gctaaaccgc cgctgggtgt gttttttgca 2700
gcgattgctc cgcgcctgca gccgcgttac tattctattt cttcttgcca ggactgggct 2760
ccgtcccgtg ttcacgttac ctctgctctg gtttacggtc cgaccccgac cggccgtatc 2820
cacaagggcg tttgttctac ttggatgaaa aacgcggttc cggcggagaa atctcatgaa 2880
tgcagcggtg cgccgatctt tatccgtgcg tccaacttca agctgccgtc taacccgtct 2940
actccgattg ttatggttgg tccgggcacc ggtctggcac cgttccgtgg ttttctgcag 3000
gagcgtatgg ctctgaaaga ggacggtgaa gaactgggtt ctagcctgct gtttttcggt 3060
tgtcgtaacc gccagatgga ttttatctac gaggatgagc tgaacaactt cgtggaccag 3120
ggtgttatca gcgagctgat tatggcattt tctcgcgaag gtgcgcagaa agagtatgtg 3180
cagcacaaaa tgatggagaa agcggcgcag gtgtgggacc tgattaaaga agagggttat 3240
ctgtatgttt gcggcgacgc aaaaggtatg gcacgtgacg tgcatcgcac tctgcacacc 3300
atcgttcagg aacaggaagg cgtttcttcc tctgaagcag aagcgattgt taaaaagctg 3360
cagactgaag gtcgctacct gcgtgatgtg tggtaa 3396